Analyse du temps de séjour d’une molécule unique du clivage de l’ADN médié par l’endonucléase de restriction

Résumé

À l’aide de l’ADN marqué par des points quantiques et de la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale, nous pouvons étudier le mécanisme de réaction des endonucléases de restriction tout en utilisant des protéines non marquées. Cette technique à molécule unique permet d’observer massivement multiplexée les interactions protéine-ADN individuelles, et les données peuvent être regroupées pour générer des distributions de temps de séjour bien remplies.

Résumé

Ce nouveau test basé sur la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale facilite la mesure simultanée de la durée du cycle catalytique pour des centaines de molécules d’endonucléase de restriction individuelle (REase) en une seule expérience. Ce test ne nécessite pas de marquage protéique et peut être réalisé avec un seul canal d’imagerie. De plus, les résultats de plusieurs expériences individuelles peuvent être regroupés pour générer des distributions de temps de séjour bien remplies. L’analyse des distributions de temps de séjour résultantes peut aider à élucider le mécanisme de clivage de l’ADN en révélant la présence d’étapes cinétiques qui ne peuvent pas être observées directement. Des exemples de données recueillies à l’aide de ce test avec le bien étudié REase, EcoRV - une endonucléase de restriction dimérique de type IIP qui clive la séquence palindromique GAT↓ATC (où ↓ est le site de coupe) - sont en accord avec les études antérieures. Ces résultats suggèrent qu’il y a au moins trois étapes dans la voie du clivage de l’ADN qui est initiée par l’introduction de magnésium après que l’EcoRV se lie à l’ADN en son absence, avec un taux moyen de 0,17 ^s-1 pour chaque étape.

Introduction

Les endonucléases de restriction (REases) sont des enzymes qui effectuent des cassures double brin spécifiques à une séquence dans l’ADN. La découverte des REases dans les années 1970 a conduit au développement de la technologie de l’ADN recombinant, et ces enzymes sont aujourd’hui des outils de laboratoire indispensables pour la modification et la manipulation^{génétiques1}. Les REases de type II sont les enzymes les plus largement utilisées dans cette classe car elles clivent l’ADN à un endroit fixe, soit à l’intérieur ou à proximité de leur séquence de reconnaissance. Cependant, il existe une grande variation entre les REases de type II, et elles sont divisées en plusieurs sous-types basés sur des propriétés enzymatiques particulières plutôt que d’être classées en fonction de leurs relations évolutives. Parmi chaque sous-type, il existe de fréquentes exceptions au schéma de classification, et de nombreuses enzymes appartiennent à plusieurs sous-types². Des milliers de REases de type II ont été identifiées, et des centaines d’entre elles sont disponibles dans le commerce.

Cependant, malgré la diversité des REases de type II, très peu d’REases ont été étudiées en détail. Selon REBASE, la base de données sur les enzymes de restriction établie par Sir Richard Roberts en 1975³, des données cinétiques publiées sont disponibles pour moins de 20 de ces enzymes. De plus, alors que certaines REases ont été observées directement au niveau de la molécule unique lors de la diffusion le long de l’ADN avant de rencontrer et de se lier à leur séquence de reconnaissance 4,5,6,7, il existe très peu d’études sur la cinétique de réaction de clivage de la molécule unique. Les études existantes ne fournissent pas de statistiques suffisantes pour entreprendre une analyse détaillée de la variation des moments où les événements de clivage uniques se produisent^{8, 9, 10} ou ne sont pas en mesure de saisir la distribution complète des temps de clivage¹¹. Ce type d’analyse peut révéler la présence d’intermédiaires cinétiques à durée de vie relativement longue et pourrait conduire à une meilleure compréhension des mécanismes du clivage de l’ADN médié par la REase.

Au niveau de la molécule unique, les processus biochimiques sont stochastiques - le temps d’attente pour qu’une seule instance du processus se produise, τ, est variable. Cependant, on peut s’attendre à ce que de nombreuses mesures de τ obéissent à une distribution de probabilité, p(τ), qui est indicative du type de processus qui se déroule. Par exemple, un processus en une seule étape, tel que la libération d’une molécule de produit à partir d’une enzyme, obéira aux statistiques de Poisson, et p(τ) prendra la forme d’une distribution exponentielle négative :

où β est le temps d’attente moyen. Notez que le taux du processus, k, sera égal à 1/β, l’inverse du temps d’attente moyen. Pour les processus qui nécessitent plus d’une étape, p(τ) sera la convolution des distributions exponentielles simples pour chacune des étapes individuelles. Une solution générale pour la convolution de N fonctions de décroissance exponentielle unique avec des temps d’attente moyens identiques, β, est la distribution de probabilité gamma :

où Γ(N) est la fonction gamma, qui décrit l’interpolation de la factorielle de N-1 en valeurs non entières de N. Bien que cette solution générale puisse être utilisée à titre approximatif lorsque les temps d’attente moyens des différentes étapes sont similaires, il faut comprendre que la présence de pas relativement rapides sera masquée par des étapes avec des temps d’attente nettement plus longs. En d’autres termes, la valeur de N représente une limite inférieure sur le nombre d’étapes¹². Avec un nombre adéquat de mesures du temps d’attente, les paramètres β et N peuvent être estimés en regroupant les événements et en ajustant la distribution gamma à l’histogramme résultant ou en utilisant une approche d’estimation du maximum de vraisemblance. Ce type d’analyse peut donc révéler la présence d’étapes cinétiques qui ne peuvent pas être facilement résolues dans des essais d’ensemble et nécessite un grand nombre d’observations pour estimer les paramètres avec précision^12,13.

Cet article décrit une méthode permettant d’utiliser l’ADN marqué par des points quantiques et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour observer en parallèle des centaines d’événements de clivage de l’ADN individuels médiés par REase. La conception du test permet de regrouper les résultats de plusieurs expériences et de créer des distributions de temps de séjour contenant des milliers d’événements. La photostabilité et la luminosité élevées des points quantiques permettent une résolution temporelle de 10 Hz sans sacrifier la capacité d’observer les événements de clivage se produisant même plusieurs minutes après le début de l’expérience. Une bonne résolution temporelle et une large plage dynamique, combinées à la capacité de collecter un grand nombre de données, permettent une caractérisation précise des distributions de temps de séjour pour découvrir la présence de plusieurs étapes cinétiques dans les voies de clivage des REases, qui ont des taux de renouvellement de l’ordre de 1 ^min-1 . Dans le cas de l’EcoRV, trois étapes cinétiques peuvent être résolues, qui ont toutes été identifiées par d’autres moyens, confirmant que le test est sensible à la présence de telles étapes.

Des substrats d’ADN duplex contenant la séquence de reconnaissance d’intérêt sont produits par recuit d’un oligonucléotide biotinylé en un brin complémentaire marqué avec une seule boîte quantique nanocristalline semi-conductrice attachée de manière covalente. Ces substrats sont introduits dans un canal d’écoulement construit au-dessus d’une lamelle de verre avec une pelouse de molécules de polyéthylène glycol (PEG) de haut poids moléculaire attachées de manière covalente à sa surface. Les substrats de l’ADN sont capturés via une liaison biotine-streptavidine-biotine par une fraction des molécules de PEG qui ont une biotine à leur extrémité libre. En microscopie TIRF, une onde évanescente qui décroît de façon exponentielle avec la distance de l’interface verre-liquide fournit de l’éclairage ; La profondeur de pénétration est de l’ordre de la longueur d’onde de la lumière utilisée. Dans ces conditions, seuls les points quantiques qui sont attachés à la surface par une molécule d’ADN qui a été capturée sur la surface du verre fonctionnalisé seront excités. Les points quantiques qui sont libres en solution ne seront pas contraints dans la région éclairée et ne luminescent donc pas. Si l’ADN qui relie un point quantique à la surface est clivé, ce point quantique sera libre de diffuser loin de la surface et disparaîtra de l’image de fluorescence.

Bien que de nombreuses REases de type II soient connues pour se lier à l’ADN en l’absence de magnésium¹⁴, toutes ont besoin de magnésium pour médier le clivage de l’ADN¹⁵. Ces REases peuvent se lier à l’ADN immobilisé en surface en l’absence de magnésium. Lorsque le tampon contenant du magnésium est circulé à travers un canal avec la REase liée à l’ADN, le clivage commence immédiatement, comme l’indique la disparition des points quantiques. La synchronisation obtenue en préliant les molécules de REase, puis en initiant le clivage de l’ADN en introduisant du magnésium, facilite la mesure du temps de latence jusqu’à la fin du clivage de l’ADN indépendamment pour chaque molécule de la population d’enzymes observée dans une expérience. La fluorescéine est incluse comme colorant traceur dans le tampon contenant du magnésium pour indiquer l’arrivée du magnésium dans le champ de vision. Comme aucune enzyme n’est incluse dans le tampon contenant du magnésium, le décalage entre l’arrivée du tampon contenant du magnésium et la disparition de chaque point quantique indique le temps qu’il faut à une REase déjà liée à l’ADN pour cliver l’ADN et libérer le point quantique de la surface du verre. La disparition des points quantiques se produit rapidement et entraîne une forte diminution de la trajectoire d’intensité, fournissant une indication claire du moment où une molécule d’ADN donnée est clivée. La détermination des temps d’événements est réalisée par l’analyse mathématique des trajectoires d’intensité, et une expérience typique aboutit à des centaines d’événements de clivage identifiables. Les résultats de plusieurs expériences peuvent être regroupés pour fournir des statistiques adéquates permettant l’estimation des paramètres, N et β, par l’analyse non linéaire des moindres carrés ou l’analyse du maximum de vraisemblance.

Protocole

1. Informations générales

1. Conception d’oligonucléotides
   REMARQUE : Le substrat d’ADN de 60 paires de bases (pb) de long est formé d’une paire d’oligonucléotides complémentaires avec une température de fusion duplex de 75 °C dans 100 mM de NaCl.
   1. Commandez un oligonucléotide synthétisé avec une seule modification de la biotine 5' et l’autre avec une modification du thiol 5' (avec un espaceur à six carbones). Placez le site de reconnaissance au centre de la région duplex.
      REMARQUE : Les séquences d’oligonucléotides à utiliser avec EcoRV sont illustrées ci-dessous (site de reconnaissance en gras).
      5' biotine - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' thiol - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. Utilisez de l’eau ultra-pure avec une résistivité de 18 MOhm pour toutes les étapes.
3. Protégez toutes les solutions contenant des points quantiques de la lumière pour éviter le photoblanchiment.
4. Utilisez une source d’air comprimé pour effectuer ce protocole.

2. Préparation de matériaux de substrat d’ADN marqués à des points quantiques

REMARQUE : Outre les oligonucléotides décrits ci-dessus, voir le Tableau des matériaux pour d’autres matériaux et le Tableau 1 pour les tampons nécessaires à la préparation de substrats d’ADN marqués par des points quantiques.

1. Réduire les groupes thiols 5' sur l’oligonucléotide à coupler aux points quantiques.
   1. Remettre en suspension chaque oligonucléotide thiolé dans l’eau à une concentration de 100 μM.
   2. Pipeter 650 μL d’eau dans une colonne de spin d’exclusion stérique pour chaque échantillon d’oligonucléotides, et vortex pendant ~15 s. Laissez la colonne s’emballer pendant 30 min.
   3. Préparez une solution fraîche de 100 mM de dithiothréitol (DTT) immédiatement avant chaque utilisation, car le DTT se dégrade rapidement en solution. Ouvrez avec précaution un flacon contenant 7,7 mg de DTT et placez une pipette de 500 μL de tampon de phosphate de sodium dans le flacon ; Vortex pour bien mélanger.
   4. Pour chaque oligonucléotide remis en suspension, préparez un nouveau tube et ajoutez 50 μL d’oligonucléotide et 50 μL de solution de DTT dans le tube. Pipette de haut en bas pour mélanger. Incuber pendant 30 min à température ambiante pour réduire les liaisons disulfure entre les groupes thiols oxydés à l’extrémité 5' des oligonucléotides.
   5. Retirez les capuchons de la colonne d’essorage et placez chaque colonne dans le tube de collecte. Centrifuger les colonnes de centrifugation à 750 × g pendant 2 min et jeter l’éluat.
   6. Transférez les colonnes de centrifugation dans de nouveaux tubes à centrifuger. Pipeter doucement le volume entier (100 μL) d’un échantillon de mélange ADN/DTT sur chaque colonne préparée. Centrifuger à 750 × g pendant 2 min et mesurer l’absorbance de l’éluat à 260 nm pour confirmer que la concentration est d’environ 40 μM.
   7. Conservez tous les échantillons qui ne seront pas utilisés immédiatement à -20 °C pour éviter l’oxydation des groupes thiols et la formation de liaisons disulfure.
2. Couplage de l’ADN à des points quantiques
   1. Pipetez une aliquote de 50 μL de la crosse de points quantiques dans un appareil de dialyse pour chaque construction à fabriquer, en veillant à ne pas toucher la membrane avec la pointe de la pipette. Dialyser contre un volume de tampon d’acide N-cyclohexyl-2-aminoéthanesulfonique (CHES) qui est au moins 1000 fois le volume de l’échantillon en agitant à ~100 tr/min pendant 15 min.
   2. Préparer une solution fraîche de 6 mM de sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) dans un tampon CHES immédiatement avant chaque utilisation. Ouvrez avec précaution un flacon contenant 2 mg de sulfo-SMCC et injectez 800 μL de tampon CHES dans le flacon. Vortex pour bien mélanger.
   3. À l’aide d’un pipeteur, récupérer soigneusement les points quantiques suspendus de l’appareil de dialyse et les transférer dans un tube frais contenant un volume égal de solution sulfo-SMCC ; Pipette de haut en bas pour mélanger. Incuber pendant 1 h à température ambiante avec agitation à 1000 tr/min pour permettre au sulfo-SMCC de réagir avec les amines primaires sur les points quantiques.
   4. À l’aide d’un pipeteur, transférez soigneusement chaque échantillon dans un appareil de dialyse frais. Pour éliminer l’excès de sulfo-SMCC, procéder à une dialyse contre un volume de tampon CHES d’au moins 1000 fois le volume contenu dans le ou les appareils de dialyse, en agitant pendant 15 min. Remplacez le tampon 2 fois et effectuez la dialyse avec le tampon CHES frais 3 fois au total, ce qui permet à la dialyse de se poursuivre 15 minutes après chaque remplacement de tampon.
   5. Pour remplacer le tampon en prévision de la deuxième réaction, transférez les dispositifs de dialyse dans un bécher contenant un volume de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) qui est au moins 1000 fois le volume contenu dans le ou les appareils. Dialysez en agitant pendant 15 min, remplacez le tampon 2 fois et effectuez une dialyse avec du PBS frais 3 fois au total, ce qui permet à la dialyse de se poursuivre pendant 15 minutes après chaque remplacement de tampon.
   6. À l’aide d’un pipeteur, récupérez soigneusement la solution contenant les points quantiques du ou des appareils de dialyse et transférez chaque échantillon dans un tube frais contenant une quantité équivalente d’oligonucléotide thiolé dilué dans du PBS. Combinez un volume égal de PBS et un 1/10e du volume de l’échantillon d’oligonucléotides réduit et purifié (concentration d’environ 40 μM) car la concentration de points quantiques à ce point est de ~4 μM. Incuber pendant 2 h à température ambiante, en agitant à 1000 tr/min.
   7. Ajouter de l’albumine sérique bovine (BSA, 10 mg/mL) à chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de 0,5 mg/mL de BSA. À l’aide d’un pipeteur, transférez soigneusement chaque échantillon dans un appareil de dialyse frais et dialysez contre un volume de tampon de stockage d’au moins 1000 fois le volume contenu dans le ou les appareils de dialyse. Remplacez le tampon 2 fois et effectuez une dialyse avec un nouveau tampon de stockage 3 fois au total, ce qui permet à la dialyse de se poursuivre pendant 15 minutes après chaque remplacement de tampon.
   8. À l’aide d’une pipette, récupérez soigneusement chaque échantillon, placez-le dans un tube frais et conservez-le à 4 °C.
      REMARQUE : Ne pas stocker à -20 °C car les points quantiques sont endommagés par le gel.
3. Recuit d’un oligonucléotide marqué par des points quantiques en oligonucléotide biotinylé
   1. Remettre en suspension chaque oligonucléotide biotinylé dans le tampon de stockage à une concentration de 100 μM. Stocker les échantillons non utilisés à -20 °C.
   2. Combinez un échantillon d’oligonucléotide marqué par des points quantiques avec un excès molaire de 10 fois plus d’oligonucléotide biotinylé. Comme la concentration estimée d’ADN dans l’échantillon marqué par des points quantiques est de 2 μM, ajoutez 0,2 μL d’oligonucléotide biotinylé pour chaque 10 μL de cet échantillon.
   3. Chauffer le mélange dans un bloc chauffant à 75 °C (température de fusion pour la région complémentaire). Maintenez à cette température pendant 5 min. Éteignez le bloc de chaleur et laissez refroidir lentement. Entreposez la construction terminée à 4 °C ; Ne pas congeler.

3. Fonctionnalisation de surface des lamelles

REMARQUE : Ce processus a été décrit précédemment dans d’autres protocoles vidéo JoVE^16,17. Ce protocole décrit une version adaptée de la procédure avec des modifications mineures pour s’adapter à une lame de verre plus petite. Voir le Tableau des matériaux pour d’autres matériaux nécessaires à la fonctionnalisation de la surface des lamelles.

1. Placez 5 lamelles dans chaque porte-lamelle. Assurez-vous de sauter un espace entre chaque paire de lamelles afin qu’elles ne collent pas les unes aux autres. Placez les lamelles dans leur support dans un bocal avec un couvercle, ajoutez de l’éthanol dans le bocal jusqu’à ce que les lamelles soient couvertes et vissez solidement le couvercle. Placez le bocal entier dans l’eau du sonicateur de bain, sans l’immerger complètement, et sonicez pendant 30 min.
2. Remplissez un bécher ou un bocal propre avec de l’eau ultra-pure. Utilisez une pince à épiler en métal pour retirer les lamelles de leur support de l’éthanol et plongez-les dans l’eau pour les rincer. Ensuite, transférez les lamelles et le support dans un bocal contenant une solution d’hydroxyde de potassium 1 M (KOH). Vissez fermement le couvercle, placez le pot dans le bain sonicateur et sonicate pendant 30 min.
   REMARQUE : Soyez prudent lors de la manipulation de la solution de KOH car elle est corrosive et irritante.
3. Répétez la sonication dans une solution d’éthanol et de KOH, en rinçant les lamelles à l’eau comme décrit ci-dessus entre chaque étape.
4. Transférez les lamelles dans leur support dans un bocal propre rempli d’acétone pure. Terminez le nettoyage en sonicant le bocal comme décrit ci-dessus pendant 30 min. Ne rincez pas à l’eau après cette étape.
5. À l’aide d’une pince à épiler métallique, transférez les lamelles dans leur support dans un bécher propre de 100 ml contenant 80 ml d’acétone fraîche et une barre d’agitation à l’échelle microscopique. Placez le bécher sur une plaque d’agitation magnétique réglée à au moins 1 000 tr/min. Pendant que l’acétone est agitée vigoureusement, injectez 1,6 mL de 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) dans le bécher pour obtenir une solution à 2 % v/v.
   REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous pipetez APTES car il est corrosif.
6. Laissez les lamelles incuber dans la solution pendant 2 min, puis utilisez une pince à épiler en métal pour transférer les lamelles dans leur support dans un bécher d’eau pour éteindre la réaction. Rincez les lamelles deux fois de plus, en remplaçant l’eau dans le bécher.
7. Durcir le verre silanisé au four à 120 °C pendant 75 min. Si vous ne passez pas immédiatement à l’étape suivante, conservez les lamelles sous vide pendant quelques jours maximum.
8. Dissoudre les polyéthylèneglycols (PEG) dérivés-esters de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans 100 mM de bicarbonate de sodium (pH 8,2). Utilisez un rapport de 10:1 entre le PEG à terminaison méthoxy et le PEG à terminaison biotine, avec ~100 mg/mL de PEG à terminaison méthoxy.
9. Déposer 100 μL de la solution de PEG sur la moitié des lamelles silanisées sèches et recouvrir chacune d’elles d’une deuxième lamelle. Utilisez de petits morceaux de parafilm placés à chaque coin comme entretoises pour éviter que les lamelles ne collent les unes aux autres.
10. Incuber les lamelles dans un environnement humide pendant 3,5 h. Séparez les sandwichs de lamelle. À l’aide d’une bouteille à eau, lavez chaque lamelle à l’eau abondamment et séchez-la à l’air comprimé.
11. Stockez les lamelles fonctionnalisées sous vide. Assurez-vous de garder le côté traité au PEG vers le haut, car l’autre côté ne capturera pas le substrat de l’ADN.

4. Construction d’un dispositif microfluidique

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour les autres matériaux nécessaires à la construction du dispositif microfluidique.

1. À l’aide d’un outil rotatif à main équipé d’un foret à pointe diamantée conique, percez deux trous dans les coins opposés de la glissière en quartz pour servir d’entrée et de sortie. Assurez-vous de fixer la glissière en place, de lubrifier le foret et de glisser constamment avec de l’eau pendant le perçage. Après chaque expérience, récupérez la lame de quartz préparée pour la réutiliser en trempant un appareil usagé dans de l’acétone pour dissoudre l’adhésif et l’époxy ; Jetez les composants restants.
   REMARQUE : Le perçage peut être effectué à la main, mais l’utilisation d’un support de type presse pour l’outil multifonction facilite le processus.
2. Combinez 25 μL de solution de streptavidine avec 80 μL de PBS et 20 μL de tampon de blocage. Enduire une lamelle traitée PEG avec ce mélange et incuber dans un environnement humide pendant 30 min.
3. Pendant l’incubation de la lamelle, préparez l’espaceur d’imagerie pour créer un canal d’écoulement. Coupez un morceau carré de 1 pouce de matériau d’espacement d’imagerie, puis marquez un canal de 2 mm de large aligné sur les extrémités des trous percés dans la lame de quartz (Figure 2). Découpez le canal dans le matériau de l’entretoise avec un scalpel.
4. Décollez un côté du support de l’entretoise d’image et placez-le soigneusement sur la glissière en quartz, en prenant soin de ne pas couvrir les trous d’entrée et de sortie. Assurez-vous de bien nettoyer la lame de quartz avec de l’acétone pour éliminer tout reste d’adhésif des expériences précédentes.
5. Lavez la lamelle à l’eau et séchez-la à l’air comprimé. Retirez l’autre côté du support de l’entretoise d’imagerie et placez-le en sandwich entre la lame de quartz et la lamelle fonctionnalisée recouverte de streptavidine, à l’aide de la pince à épiler en plastique pour presser l’ensemble et éliminer les bulles d’air de l’adhésif.
6. Insérez un tube en polyéthylène de 30 cm de long dans chaque trou de la glissière en quartz. Assurez-vous de couper les extrémités du tube à un angle pour assurer la libre circulation de la solution. Utilisez un support de tubes ou un autre support pour maintenir les tubes en place et scellez les tubes en place et les bords de l’appareil assemblé avec de l’époxy.
   REMARQUE : Il fonctionne bien de construire l’appareil sur un morceau de parafilm, qui peut facilement être décollé du fond lorsque l’époxy a pris.
7. Une fois que l’époxy a pris, insérez l’aiguille émoussée de la seringue vide dans le tube de sortie de l’appareil et plongez l’extrémité du tube d’entrée dans un récipient rempli de tampon de blocage. Tirez sur le piston de la seringue pour remplir l’appareil de tampon de blocage. Laissez l’appareil incuber pendant au moins 30 minutes avant de l’utiliser.

5. Attache de surface d’un substrat d’ADN marqué par des points quantiques

REMARQUE : Outre le dispositif microfluidique, le substrat d’ADN et le tampon de blocage décrits ci-dessus, voir le tableau des matériaux pour les autres matériaux et le tableau 1 pour les tampons nécessaires à l’attache de surface des substrats d’ADN marqués par des points quantiques.

1. Fixez le dispositif microfluidique à la plaque de la platine du microscope à l’aide de ruban adhésif, mettez l’objectif en contact avec le bas du dispositif et positionnez l’objectif de manière à ce que le champ de vision se trouve à l’intérieur du canal microfluidique.
2. Rincez le canal microfluidique avec un tampon de blocage frais en tirant le piston de la seringue vers l’arrière après avoir connecté le tube de sortie à la pompe à seringue. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles piégées dans le tube ou dans le canal.
   REMARQUE : À partir de ce point, assurez-vous que le tube d’entrée est liquide afin qu’aucune bulle d’air ne soit introduite dans l’appareil.
3. Diluer 1 μL du substrat d’ADN préparé dans 1 mL de tampon de blocage. Placez le tube d’entrée dans le substrat d’ADN dilué et faites couler 800 μL de la solution de substrat à travers le canal à une vitesse de 200 μL/min. Laissez la solution d’ADN incuber dans le canal sans être perturbée pendant 15 minutes après l’arrêt de l’écoulement.
4. Verser au moins 800 μL de tampon de blocage à travers le canal à une vitesse de 200 μL/min pour rincer l’ADN non lié du canal.
5. Ajustez la puissance du laser, la mise au point du microscope et l’angle TIRF de sorte que les points quantiques attachés à la surface soient clairement visibles.
   REMARQUE : Bien que les points quantiques ne blanchissent pas rapidement, il est préférable de maintenir la puissance aussi faible que possible pour minimiser le clignotement.

6. Clivage de l’ADN médié par la REase

REMARQUE : Voir le Tableau des matériaux pour les matériaux et le Tableau 1 pour les tampons requis pour le clivage de l’ADN médié par REase.

1. Assurez-vous que la caméra est refroidie à la température de fonctionnement optimale et configurée pour la diffusion à grande vitesse avec un temps d’exposition de 0,10 s. Soyez prêt à collecter des données pendant ~4 min.
2. Rincer le dispositif microfluidique avec 800 μL de tampon expérimental sans magnésium à un débit de 200 μL/min.
3. Ajouter la REase à une aliquote (1 mL) de tampon expérimental sans magnésium et mélanger doucement par pipetage. Utilisez 4 μL de 100 000 unités/mL, ce qui correspond à 400 unités/mL d’EcoRV. Écouler 800 μL de l’enzyme diluée à travers le canal à un débit de 200 μL/min.
4. Commencer l’expérience en écoulant un tampon expérimental contenant du magnésium et de la fluorescéine à un débit de 200 μL/min. Commencez à capturer des données immédiatement après avoir démarré le pousse-seringue. Après avoir écoulé 800 μL de tampon, arrêtez l’acquisition des données.

7. Analyse des données

REMARQUE : Consultez la table des matériaux pour connaître le logiciel d’analyse de données utilisé pour ce protocole, et faites des ajustements si vous utilisez une autre plateforme d’analyse.

1. Détermination du point temporel zéro
   1. Soustrayez la fluorescence d’arrière-plan de chaque image du film expérimental à l’aide de la fonction imtophat , une fonction de filtrage morphologique intégrée dans la boîte à outils de traitement d’image. Sélectionnez un disque d’un rayon de trois pixels comme élément structurant. Obtenez l’intensité de l’arrière-plan en soustrayant l’image filtrée de l’image d’origine.
      REMARQUE : Le filtre ne conserve que les caractéristiques de l’image plus claires que l’arrière-plan et plus petites que l’élément structurant.
   2. Faites la moyenne de l’arrière-plan soustrait sur chaque image de la vidéo. Utilisez une trajectoire de cette valeur pour déterminer le point temporel zéro de l’expérience (Figure 3A). Déterminez l’heure de début en trouvant la première trame à laquelle le taux d’augmentation dépasse 3 fois l’écart-type du taux de variation pendant l’écoulement volumique mort.
      REMARQUE : une forte augmentation du taux de variation de la valeur moyenne de l’arrière-plan soustrait pour chaque image de film indique le moment où le tampon expérimental final contenant le colorant traceur est entré dans la cellule d’écoulement (Figure 3B).
2. Calcul et analyse de la trajectoire d’intensité des points quantiques
   1. Calculez une projection d’intensité maximale pour l’ensemble d’images vidéo corrigées en arrière-plan enregistrées avant l’arrivée du colorant traceur. Déterminez l’emplacement des points quantiques avec une précision d’un pixel dans cette image de projection à l’aide d’une fonction de recherche de pic telle que pkfnd.
   2. Générez des trajectoires d’intensité pour des points quantiques individuels en calculant l’intensité moyenne dans chaque image vidéo d’une région carrée, trois pixels par côté entourant l’emplacement renvoyé par la fonction de recherche de pic.
      REMARQUE : La correction d’arrière-plan décrite ci-dessus supprime les artefacts introduits par le colorant traceur. Les trajectoires d’intensité qui en résultent doivent être relativement stables, mais inclure tout de même des fluctuations d’intensité naturelles (figure 4).
   3. Identifier les événements de disparition de points quantiques par l’analyse statistique des trajectoires d’intensité. Pour chaque trajectoire d’intensité de boîte quantique, calculez une intensité seuil supérieure à la valeur minimale d’une fraction appropriée de la différence entre les valeurs maximale et minimale de cette trajectoire, en fonction du bruit observé dans les trajectoires.
      REMARQUE : La fluctuation d’intensité du point quantique est généralement beaucoup plus grande que la fluctuation de fond. Une valeur appropriée peut être déterminée en comparant ces valeurs : le seuil sélectionné doit être supérieur à la valeur de fond la plus élevée, mais idéalement inférieur à la valeur la plus basse pour la fluorescence à points quantiques. Pour les données présentées, le seuil utilisé a été calculé de manière à être supérieur à la valeur minimale pour chaque trajectoire plus un tiers de la différence entre les valeurs maximale et minimale pour cette trajectoire. On peut considérer qu’un point quantique disparaît au dernier moment où l’intensité observée à son emplacement était supérieure à ce seuil.
   4. Confirmer les événements de disparition présumée. N’incluez les événements dans l’analyse finale que si l’intensité observée est supérieure au point médian entre les valeurs d’intensité minimale et maximale de la trajectoire pour plus de la moitié des images du film avant le moment de la disparition et que l’écart-type de la trajectoire d’intensité a diminué après l’événement.
      REMARQUE : D’autres tests statistiques peuvent être utilisés pour s’assurer que seuls les événements de disparition valides sont enregistrés.

Résultats

La cellule d’écoulement est directement couplée à un objectif à immersion dans l’huile à grande ouverture numérique à grossissement 60x sur un microscope inversé équipé d’un éclairage laser pour l’imagerie TIRF à travers l’objectif (Figure 5A). Après avoir introduit le substrat d’ADN et éliminé l’excès d’ADN et de points quantiques, il y a généralement des milliers de points quantiques individuels dans un champ de vision (Figure 5B). Ces points quantiques sont f...

Discussion

Le substrat d’ADN pour ce test est marqué à l’aide d’une boîte quantique à l’aide d’un schéma de réaction en deux étapes utilisant le sulfo-SMCC. Ce réticulant bifonctionnel se compose d’une fraction ester NHS qui peut réagir avec une amine primaire, et d’une fraction maléimide qui peut réagir avec un groupe sulfhydryle²⁰. Les oligonucléotides thiolés utilisés pour préparer le substrat sont expédiés sous leur forme oxydée. Il est important de les réduire et de les purifier, comme décrit, avant de ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
3-aminopropyltriéthoxysilane (APTS)	Sigma Aldrich	440140-100ML	Stocker dans une boîte de dessiccateur
5 Minute Epoxy	Devcon	20845	utilisation pour sceller le dispositif microfluidique
acétone	Pharmco	329000ACS	utilisation pour le nettoyage des lamelles de
bain sonicateur	Fisher Scientific	CPXH modèle 2800	numéro de catalogue 15-337-410
Bécher, verre, 100 mL
Centrifugeuse
Biotin-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)	Laysan Bio	BIO-SVA-5K	Le valérate de succinimidyle a une demi-vie plus longue que le carbonate de succinimidyle
oligonucléotide biotinylé	Integrated DNA Technologies	custom - voir le protocole pour les considérations de conception	Demande 5' Modification de la biotine et Purification HPLC
Albumine sérique bovine (BSA)	VWR	0903-5G	préparer une solution à 10 mg/mL (aq) et chauffer à 95 ° ; C avant d’utiliser
Centri-Spin-10 Colonnes de centri-Spin-10	Séparations Princeton	CS-100 ou CS-101	utilisées pour purifier les oligonucléotides thiolés après réduction de la liaison disulfure
Tubes à centrifuger 1,5 mL
Couvercles, supports
Roue à pointe diamantée	Dremel	7134	utilisation pour percer des trous dans la cellule d’écoulement de quartz topper
dithiothreitol (DTT)	Thermo Scientific	A39255	No-Weigh Format, 7,7 mg/flacon
perceuse à colonne outil rotatif support de poste de travail	Dremel	220-01	facilite le forage de quartz
EcoRV (REase utilisé pour générer des données d’exemple)	New England Biolabs	R0195T ou R0195M	Utilisez 100 000 unités/mL de stock pour éviter d’ajouter un excès de glycérol Vérifiez REBASE pour les fournisseurs d’autres REases
	divers	CAS 64-17-5	dénaturés ou 95 % sont acceptables, à utiliser pour nettoyer les lamelles
Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)	Sigma Aldrich	EDS	BioUltra, anhydre, stocker dans une boîte de dessiccateur
Flea Micro Spinbar	Fisherbrand	14-513-65	Taille de 3 mm x 10 mm pour s’adapter sous le support
lamelles fluorescéine	Acros Organics	17324	à utiliser pour fabriquer des tampons expérimentaux four à
convection par gravité	Binder	9010-0131
outil multifonction rotatif portatif	Dremel	8220	à utiliser pour percer des trous dans le topper de cellule d’écoulement en quartz
ImagEM X2 EM-CCD Caméra	Hamamatsu	C9100-23B	le refroidissement par air est adéquat pour cette expérience, utilisez le logiciel HCImage ou similaire pour contrôler
l’espaceur d’imagerie, double face, adhésif
Pot, verre avec bouchon à vis, (environ 50 mm de diamètre sur 50 mm de haut)
chlorure de magnésium hexahydraté	Bioreagents	BP214-500	à utiliser pour fabriquer un tampon expérimental avec
logiciel		MATLAB en magnésium	Analyse des données
pince à épiler métallique	Fisher Brand	16-100-110
methoxy-PEG-Succinimidyl Valerate (MW 5,000)	Laysan Bio	M-SVA-5K	deux PEG doivent avoir le même ester NHS afin que la vitesse de réaction soit cohérente
microcentrifugeuse	Eppendorf	5424
agitateur magnétique multiposition	VWR	12621-022
Acide N-cyclohexyl-2-aminoéthanesulfonique (CHES)	Acros Organics	AC20818	CAS 103-47-9, à utiliser pour fabriquer
agitateur orbital tampon CHES et un réchauffeur pour tubes de microcentrifugation	Q Instruments	1808-0506	avec adaptateur 1808-1061 pour 24 tubes de 2,0 ml ou 15 tubes de 0,5 ml
Parafilm
PE60 (diamètre intérieur 0,76 mm, diamètre extérieur 1,22 mm)	Intramedic	6258917	aiguilles émoussées de 22 g conviennent parfaitement à cette taille de tube
Saline tamponnée au phosphate (PBS) 10x	Sigma Aldrich	P7059	Utiliser à une force 1x
hydroxyde de potassium	VWR Chemicals BDH	BDH9262	utiliser une solution de 1 M pour nettoyer les lamelles
Qdot 655 ITK Amino (PEG) Quantum Dots	Invitrogen	Q21521MP
Lame de quartz, 1 pouce carré, 1 mm d’épaisseur	Microscopie électronique Sciences	72250-10	: des trous doivent être percés dans les coins pour l’insertion de tubes d’entrée et de sortie,
une pince à épiler en plastique renforcé,	Rubis	K35a	à utiliser pour la manipulation de lamelles et le bâtiment d’un dispositif microfluidique
Feuilles adhésives SecureSeal Grace	Biolabs	SA-S-1L	entretoise coupée en forme pour dispositif microfluidique
Pousse-seringue monocanal pour la microfluidique	Systèmes	de pompage New EraNE-1002X-US	équipé d’une seringue de 50 ml et d’une aiguille émoussée de 22 g
Dispositifs de dialyse Slide-a-Lyzer MINI, 10 kDa MWCO, 0,1 mL	Thermo Scientific	69570 ou 69572	utilisés pour l’échange de tampon lors du couplage de points quantiques avec le
bicarbonate de sodium	d’ADN EMD Millipore	SX0320	à utiliser pour faire un tampon pour la fonctionnalisation de surface ; 100 mM, pH 8
chlorure de sodium	Macron	7581-12	Utilisation pour la fabrication de tampons expérimentaux Solution
dibasique de phosphate de sodium (BioUltra, 0,5 M dans l’eau)	Sigma Aldrich	94046	Utilisation pour la fabrication d’un tampon de phosphate de sodium de 100 mM
Solution monobasique de phosphate de sodium (BioUltra, 5M dans l’eau)	Sigma Aldrich	74092	Utilisation pour ajuster le pH de 100 mM Tampon de phosphate de sodium
Streptavidine de Streptomyces avidinii	Sigma Aldrich	S4762	dissoudre à 1 mg/mL et stocker les aliqouts de 25 mL à -20 ?
Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC)	Thermo Scientific	A39268	Format sans pesée, seringue de 2 mg/flacon
équipée d’une aiguille
			Demander 5' Thiol Modifier C6 S-S et HPLC purificaiton
Système d’imagerie TIRF avec éclairage laser 488 nm	divers		Tris
-HCl	Research Products International	T60050	à utiliser pour fabriquer des tampons expérimentaux
Tris base	JT Baker	4101	à utiliser pour fabriquer des tampons expérimentaux
Tween-20	Sigma	P7949	à utiliser pour faire des blocs tampon
Mélangeur à vortex
Wash-N-Dry Coverslip Rack	Microscopie électronique Sciences	70366-16	utilisé pour la fonctionnalisation de surface des lamelles