Analyse du temps de séjour d’une molécule unique du clivage de l’ADN médié par l’endonucléase de restriction

Les endonucléases de restriction (REases) sont des enzymes qui effectuent des cassures double brin spécifiques à une séquence dans l’ADN. La découverte des REases dans les années 1970 a conduit au développement de la technologie de l’ADN recombinant, et ces enzymes sont aujourd’hui des outils de laboratoire indispensables pour la modification et la manipulation^{génétiques1}. Les REases de type II sont les enzymes les plus largement utilisées dans cette classe car elles clivent l’ADN à un endroit fixe, soit à l’intérieur ou à proximité de leur séquence de reconnaissance. Cependant, il existe une grande variation entre les REases de type II, et elles sont divisées en plusieurs sous-types basés sur des propriétés enzymatiques particulières plutôt que d’être classées en fonction de leurs relations évolutives. Parmi chaque sous-type, il existe de fréquentes exceptions au schéma de classification, et de nombreuses enzymes appartiennent à plusieurs sous-types². Des milliers de REases de type II ont été identifiées, et des centaines d’entre elles sont disponibles dans le commerce.

Cependant, malgré la diversité des REases de type II, très peu d’REases ont été étudiées en détail. Selon REBASE, la base de données sur les enzymes de restriction établie par Sir Richard Roberts en 1975³, des données cinétiques publiées sont disponibles pour moins de 20 de ces enzymes. De plus, alors que certaines REases ont été observées directement au niveau de la molécule unique lors de la diffusion le long de l’ADN avant de rencontrer et de se lier à leur séquence de reconnaissance 4,5,6,7, il existe très peu d’études sur la cinétique de réaction de clivage de la molécule unique. Les études existantes ne fournissent pas de statistiques suffisantes pour entreprendre une analyse détaillée de la variation des moments où les événements de clivage uniques se produisent^{8, 9, 10} ou ne sont pas en mesure de saisir la distribution complète des temps de clivage¹¹. Ce type d’analyse peut révéler la présence d’intermédiaires cinétiques à durée de vie relativement longue et pourrait conduire à une meilleure compréhension des mécanismes du clivage de l’ADN médié par la REase.

Au niveau de la molécule unique, les processus biochimiques sont stochastiques - le temps d’attente pour qu’une seule instance du processus se produise, τ, est variable. Cependant, on peut s’attendre à ce que de nombreuses mesures de τ obéissent à une distribution de probabilité, p(τ), qui est indicative du type de processus qui se déroule. Par exemple, un processus en une seule étape, tel que la libération d’une molécule de produit à partir d’une enzyme, obéira aux statistiques de Poisson, et p(τ) prendra la forme d’une distribution exponentielle négative :

où β est le temps d’attente moyen. Notez que le taux du processus, k, sera égal à 1/β, l’inverse du temps d’attente moyen. Pour les processus qui nécessitent plus d’une étape, p(τ) sera la convolution des distributions exponentielles simples pour chacune des étapes individuelles. Une solution générale pour la convolution de N fonctions de décroissance exponentielle unique avec des temps d’attente moyens identiques, β, est la distribution de probabilité gamma :

où Γ(N) est la fonction gamma, qui décrit l’interpolation de la factorielle de N-1 en valeurs non entières de N. Bien que cette solution générale puisse être utilisée à titre approximatif lorsque les temps d’attente moyens des différentes étapes sont similaires, il faut comprendre que la présence de pas relativement rapides sera masquée par des étapes avec des temps d’attente nettement plus longs. En d’autres termes, la valeur de N représente une limite inférieure sur le nombre d’étapes¹². Avec un nombre adéquat de mesures du temps d’attente, les paramètres β et N peuvent être estimés en regroupant les événements et en ajustant la distribution gamma à l’histogramme résultant ou en utilisant une approche d’estimation du maximum de vraisemblance. Ce type d’analyse peut donc révéler la présence d’étapes cinétiques qui ne peuvent pas être facilement résolues dans des essais d’ensemble et nécessite un grand nombre d’observations pour estimer les paramètres avec précision^12,13.

Cet article décrit une méthode permettant d’utiliser l’ADN marqué par des points quantiques et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour observer en parallèle des centaines d’événements de clivage de l’ADN individuels médiés par REase. La conception du test permet de regrouper les résultats de plusieurs expériences et de créer des distributions de temps de séjour contenant des milliers d’événements. La photostabilité et la luminosité élevées des points quantiques permettent une résolution temporelle de 10 Hz sans sacrifier la capacité d’observer les événements de clivage se produisant même plusieurs minutes après le début de l’expérience. Une bonne résolution temporelle et une large plage dynamique, combinées à la capacité de collecter un grand nombre de données, permettent une caractérisation précise des distributions de temps de séjour pour découvrir la présence de plusieurs étapes cinétiques dans les voies de clivage des REases, qui ont des taux de renouvellement de l’ordre de 1 ^min-1 . Dans le cas de l’EcoRV, trois étapes cinétiques peuvent être résolues, qui ont toutes été identifiées par d’autres moyens, confirmant que le test est sensible à la présence de telles étapes.

Des substrats d’ADN duplex contenant la séquence de reconnaissance d’intérêt sont produits par recuit d’un oligonucléotide biotinylé en un brin complémentaire marqué avec une seule boîte quantique nanocristalline semi-conductrice attachée de manière covalente. Ces substrats sont introduits dans un canal d’écoulement construit au-dessus d’une lamelle de verre avec une pelouse de molécules de polyéthylène glycol (PEG) de haut poids moléculaire attachées de manière covalente à sa surface. Les substrats de l’ADN sont capturés via une liaison biotine-streptavidine-biotine par une fraction des molécules de PEG qui ont une biotine à leur extrémité libre. En microscopie TIRF, une onde évanescente qui décroît de façon exponentielle avec la distance de l’interface verre-liquide fournit de l’éclairage ; La profondeur de pénétration est de l’ordre de la longueur d’onde de la lumière utilisée. Dans ces conditions, seuls les points quantiques qui sont attachés à la surface par une molécule d’ADN qui a été capturée sur la surface du verre fonctionnalisé seront excités. Les points quantiques qui sont libres en solution ne seront pas contraints dans la région éclairée et ne luminescent donc pas. Si l’ADN qui relie un point quantique à la surface est clivé, ce point quantique sera libre de diffuser loin de la surface et disparaîtra de l’image de fluorescence.

Bien que de nombreuses REases de type II soient connues pour se lier à l’ADN en l’absence de magnésium¹⁴, toutes ont besoin de magnésium pour médier le clivage de l’ADN¹⁵. Ces REases peuvent se lier à l’ADN immobilisé en surface en l’absence de magnésium. Lorsque le tampon contenant du magnésium est circulé à travers un canal avec la REase liée à l’ADN, le clivage commence immédiatement, comme l’indique la disparition des points quantiques. La synchronisation obtenue en préliant les molécules de REase, puis en initiant le clivage de l’ADN en introduisant du magnésium, facilite la mesure du temps de latence jusqu’à la fin du clivage de l’ADN indépendamment pour chaque molécule de la population d’enzymes observée dans une expérience. La fluorescéine est incluse comme colorant traceur dans le tampon contenant du magnésium pour indiquer l’arrivée du magnésium dans le champ de vision. Comme aucune enzyme n’est incluse dans le tampon contenant du magnésium, le décalage entre l’arrivée du tampon contenant du magnésium et la disparition de chaque point quantique indique le temps qu’il faut à une REase déjà liée à l’ADN pour cliver l’ADN et libérer le point quantique de la surface du verre. La disparition des points quantiques se produit rapidement et entraîne une forte diminution de la trajectoire d’intensité, fournissant une indication claire du moment où une molécule d’ADN donnée est clivée. La détermination des temps d’événements est réalisée par l’analyse mathématique des trajectoires d’intensité, et une expérience typique aboutit à des centaines d’événements de clivage identifiables. Les résultats de plusieurs expériences peuvent être regroupés pour fournir des statistiques adéquates permettant l’estimation des paramètres, N et β, par l’analyse non linéaire des moindres carrés ou l’analyse du maximum de vraisemblance.

1. Informations générales

1. Conception d’oligonucléotides
   REMARQUE : Le substrat d’ADN de 60 paires de bases (pb) de long est formé d’une paire d’oligonucléotides complémentaires avec une température de fusion duplex de 75 °C dans 100 mM de NaCl.
   1. Commandez un oligonucléotide synthétisé avec une seule modification de la biotine 5' et l’autre avec une modification du thiol 5' (avec un espaceur à six carbones). Placez le site de reconnaissance au centre de la région duplex.
      REMARQUE : Les séquences d’oligonucléotides à utiliser avec EcoRV sont illustrées ci-dessous (site de reconnaissance en gras).
      5' biotine - AAA ACC GAC ATG TTG ATT TCC TGA AAC GGG ATA TCA TCA AAG CCA TGA ACA AAG CAG CCG - 3'
      5' thiol - CGG CTG CTT TGT TCA TGG CTT TGA TGA TAT CCC GTT TCA GGA AAT CAA CAT GTC GGT TTT - 3'
2. Utilisez de l’eau ultra-pure avec une résistivité de 18 MOhm pour toutes les étapes.
3. Protégez toutes les solutions contenant des points quantiques de la lumière pour éviter le photoblanchiment.
4. Utilisez une source d’air comprimé pour effectuer ce protocole.

2. Préparation de matériaux de substrat d’ADN marqués à des points quantiques

REMARQUE : Outre les oligonucléotides décrits ci-dessus, voir le Tableau des matériaux pour d’autres matériaux et le Tableau 1 pour les tampons nécessaires à la préparation de substrats d’ADN marqués par des points quantiques.

1. Réduire les groupes thiols 5' sur l’oligonucléotide à coupler aux points quantiques.
   1. Remettre en suspension chaque oligonucléotide thiolé dans l’eau à une concentration de 100 μM.
   2. Pipeter 650 μL d’eau dans une colonne de spin d’exclusion stérique pour chaque échantillon d’oligonucléotides, et vortex pendant ~15 s. Laissez la colonne s’emballer pendant 30 min.
   3. Préparez une solution fraîche de 100 mM de dithiothréitol (DTT) immédiatement avant chaque utilisation, car le DTT se dégrade rapidement en solution. Ouvrez avec précaution un flacon contenant 7,7 mg de DTT et placez une pipette de 500 μL de tampon de phosphate de sodium dans le flacon ; Vortex pour bien mélanger.
   4. Pour chaque oligonucléotide remis en suspension, préparez un nouveau tube et ajoutez 50 μL d’oligonucléotide et 50 μL de solution de DTT dans le tube. Pipette de haut en bas pour mélanger. Incuber pendant 30 min à température ambiante pour réduire les liaisons disulfure entre les groupes thiols oxydés à l’extrémité 5' des oligonucléotides.
   5. Retirez les capuchons de la colonne d’essorage et placez chaque colonne dans le tube de collecte. Centrifuger les colonnes de centrifugation à 750 × g pendant 2 min et jeter l’éluat.
   6. Transférez les colonnes de centrifugation dans de nouveaux tubes à centrifuger. Pipeter doucement le volume entier (100 μL) d’un échantillon de mélange ADN/DTT sur chaque colonne préparée. Centrifuger à 750 × g pendant 2 min et mesurer l’absorbance de l’éluat à 260 nm pour confirmer que la concentration est d’environ 40 μM.
   7. Conservez tous les échantillons qui ne seront pas utilisés immédiatement à -20 °C pour éviter l’oxydation des groupes thiols et la formation de liaisons disulfure.
2. Couplage de l’ADN à des points quantiques
   1. Pipetez une aliquote de 50 μL de la crosse de points quantiques dans un appareil de dialyse pour chaque construction à fabriquer, en veillant à ne pas toucher la membrane avec la pointe de la pipette. Dialyser contre un volume de tampon d’acide N-cyclohexyl-2-aminoéthanesulfonique (CHES) qui est au moins 1000 fois le volume de l’échantillon en agitant à ~100 tr/min pendant 15 min.
   2. Préparer une solution fraîche de 6 mM de sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC) dans un tampon CHES immédiatement avant chaque utilisation. Ouvrez avec précaution un flacon contenant 2 mg de sulfo-SMCC et injectez 800 μL de tampon CHES dans le flacon. Vortex pour bien mélanger.
   3. À l’aide d’un pipeteur, récupérer soigneusement les points quantiques suspendus de l’appareil de dialyse et les transférer dans un tube frais contenant un volume égal de solution sulfo-SMCC ; Pipette de haut en bas pour mélanger. Incuber pendant 1 h à température ambiante avec agitation à 1000 tr/min pour permettre au sulfo-SMCC de réagir avec les amines primaires sur les points quantiques.
   4. À l’aide d’un pipeteur, transférez soigneusement chaque échantillon dans un appareil de dialyse frais. Pour éliminer l’excès de sulfo-SMCC, procéder à une dialyse contre un volume de tampon CHES d’au moins 1000 fois le volume contenu dans le ou les appareils de dialyse, en agitant pendant 15 min. Remplacez le tampon 2 fois et effectuez la dialyse avec le tampon CHES frais 3 fois au total, ce qui permet à la dialyse de se poursuivre 15 minutes après chaque remplacement de tampon.
   5. Pour remplacer le tampon en prévision de la deuxième réaction, transférez les dispositifs de dialyse dans un bécher contenant un volume de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) qui est au moins 1000 fois le volume contenu dans le ou les appareils. Dialysez en agitant pendant 15 min, remplacez le tampon 2 fois et effectuez une dialyse avec du PBS frais 3 fois au total, ce qui permet à la dialyse de se poursuivre pendant 15 minutes après chaque remplacement de tampon.
   6. À l’aide d’un pipeteur, récupérez soigneusement la solution contenant les points quantiques du ou des appareils de dialyse et transférez chaque échantillon dans un tube frais contenant une quantité équivalente d’oligonucléotide thiolé dilué dans du PBS. Combinez un volume égal de PBS et un 1/10e du volume de l’échantillon d’oligonucléotides réduit et purifié (concentration d’environ 40 μM) car la concentration de points quantiques à ce point est de ~4 μM. Incuber pendant 2 h à température ambiante, en agitant à 1000 tr/min.
   7. Ajouter de l’albumine sérique bovine (BSA, 10 mg/mL) à chaque échantillon pour obtenir une concentration finale de 0,5 mg/mL de BSA. À l’aide d’un pipeteur, transférez soigneusement chaque échantillon dans un appareil de dialyse frais et dialysez contre un volume de tampon de stockage d’au moins 1000 fois le volume contenu dans le ou les appareils de dialyse. Remplacez le tampon 2 fois et effectuez une dialyse avec un nouveau tampon de stockage 3 fois au total, ce qui permet à la dialyse de se poursuivre pendant 15 minutes après chaque remplacement de tampon.
   8. À l’aide d’une pipette, récupérez soigneusement chaque échantillon, placez-le dans un tube frais et conservez-le à 4 °C.
      REMARQUE : Ne pas stocker à -20 °C car les points quantiques sont endommagés par le gel.
3. Recuit d’un oligonucléotide marqué par des points quantiques en oligonucléotide biotinylé
   1. Remettre en suspension chaque oligonucléotide biotinylé dans le tampon de stockage à une concentration de 100 μM. Stocker les échantillons non utilisés à -20 °C.
   2. Combinez un échantillon d’oligonucléotide marqué par des points quantiques avec un excès molaire de 10 fois plus d’oligonucléotide biotinylé. Comme la concentration estimée d’ADN dans l’échantillon marqué par des points quantiques est de 2 μM, ajoutez 0,2 μL d’oligonucléotide biotinylé pour chaque 10 μL de cet échantillon.
   3. Chauffer le mélange dans un bloc chauffant à 75 °C (température de fusion pour la région complémentaire). Maintenez à cette température pendant 5 min. Éteignez le bloc de chaleur et laissez refroidir lentement. Entreposez la construction terminée à 4 °C ; Ne pas congeler.

3. Fonctionnalisation de surface des lamelles

REMARQUE : Ce processus a été décrit précédemment dans d’autres protocoles vidéo JoVE^16,17. Ce protocole décrit une version adaptée de la procédure avec des modifications mineures pour s’adapter à une lame de verre plus petite. Voir le Tableau des matériaux pour d’autres matériaux nécessaires à la fonctionnalisation de la surface des lamelles.

1. Placez 5 lamelles dans chaque porte-lamelle. Assurez-vous de sauter un espace entre chaque paire de lamelles afin qu’elles ne collent pas les unes aux autres. Placez les lamelles dans leur support dans un bocal avec un couvercle, ajoutez de l’éthanol dans le bocal jusqu’à ce que les lamelles soient couvertes et vissez solidement le couvercle. Placez le bocal entier dans l’eau du sonicateur de bain, sans l’immerger complètement, et sonicez pendant 30 min.
2. Remplissez un bécher ou un bocal propre avec de l’eau ultra-pure. Utilisez une pince à épiler en métal pour retirer les lamelles de leur support de l’éthanol et plongez-les dans l’eau pour les rincer. Ensuite, transférez les lamelles et le support dans un bocal contenant une solution d’hydroxyde de potassium 1 M (KOH). Vissez fermement le couvercle, placez le pot dans le bain sonicateur et sonicate pendant 30 min.
   REMARQUE : Soyez prudent lors de la manipulation de la solution de KOH car elle est corrosive et irritante.
3. Répétez la sonication dans une solution d’éthanol et de KOH, en rinçant les lamelles à l’eau comme décrit ci-dessus entre chaque étape.
4. Transférez les lamelles dans leur support dans un bocal propre rempli d’acétone pure. Terminez le nettoyage en sonicant le bocal comme décrit ci-dessus pendant 30 min. Ne rincez pas à l’eau après cette étape.
5. À l’aide d’une pince à épiler métallique, transférez les lamelles dans leur support dans un bécher propre de 100 ml contenant 80 ml d’acétone fraîche et une barre d’agitation à l’échelle microscopique. Placez le bécher sur une plaque d’agitation magnétique réglée à au moins 1 000 tr/min. Pendant que l’acétone est agitée vigoureusement, injectez 1,6 mL de 3-aminopropyltriéthoxysilane (APTES) dans le bécher pour obtenir une solution à 2 % v/v.
   REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous pipetez APTES car il est corrosif.
6. Laissez les lamelles incuber dans la solution pendant 2 min, puis utilisez une pince à épiler en métal pour transférer les lamelles dans leur support dans un bécher d’eau pour éteindre la réaction. Rincez les lamelles deux fois de plus, en remplaçant l’eau dans le bécher.
7. Durcir le verre silanisé au four à 120 °C pendant 75 min. Si vous ne passez pas immédiatement à l’étape suivante, conservez les lamelles sous vide pendant quelques jours maximum.
8. Dissoudre les polyéthylèneglycols (PEG) dérivés-esters de N-hydroxysuccinimide (NHS) dans 100 mM de bicarbonate de sodium (pH 8,2). Utilisez un rapport de 10:1 entre le PEG à terminaison méthoxy et le PEG à terminaison biotine, avec ~100 mg/mL de PEG à terminaison méthoxy.
9. Déposer 100 μL de la solution de PEG sur la moitié des lamelles silanisées sèches et recouvrir chacune d’elles d’une deuxième lamelle. Utilisez de petits morceaux de parafilm placés à chaque coin comme entretoises pour éviter que les lamelles ne collent les unes aux autres.
10. Incuber les lamelles dans un environnement humide pendant 3,5 h. Séparez les sandwichs de lamelle. À l’aide d’une bouteille à eau, lavez chaque lamelle à l’eau abondamment et séchez-la à l’air comprimé.
11. Stockez les lamelles fonctionnalisées sous vide. Assurez-vous de garder le côté traité au PEG vers le haut, car l’autre côté ne capturera pas le substrat de l’ADN.

4. Construction d’un dispositif microfluidique

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour les autres matériaux nécessaires à la construction du dispositif microfluidique.

1. À l’aide d’un outil rotatif à main équipé d’un foret à pointe diamantée conique, percez deux trous dans les coins opposés de la glissière en quartz pour servir d’entrée et de sortie. Assurez-vous de fixer la glissière en place, de lubrifier le foret et de glisser constamment avec de l’eau pendant le perçage. Après chaque expérience, récupérez la lame de quartz préparée pour la réutiliser en trempant un appareil usagé dans de l’acétone pour dissoudre l’adhésif et l’époxy ; Jetez les composants restants.
   REMARQUE : Le perçage peut être effectué à la main, mais l’utilisation d’un support de type presse pour l’outil multifonction facilite le processus.
2. Combinez 25 μL de solution de streptavidine avec 80 μL de PBS et 20 μL de tampon de blocage. Enduire une lamelle traitée PEG avec ce mélange et incuber dans un environnement humide pendant 30 min.
3. Pendant l’incubation de la lamelle, préparez l’espaceur d’imagerie pour créer un canal d’écoulement. Coupez un morceau carré de 1 pouce de matériau d’espacement d’imagerie, puis marquez un canal de 2 mm de large aligné sur les extrémités des trous percés dans la lame de quartz (Figure 2). Découpez le canal dans le matériau de l’entretoise avec un scalpel.
4. Décollez un côté du support de l’entretoise d’image et placez-le soigneusement sur la glissière en quartz, en prenant soin de ne pas couvrir les trous d’entrée et de sortie. Assurez-vous de bien nettoyer la lame de quartz avec de l’acétone pour éliminer tout reste d’adhésif des expériences précédentes.
5. Lavez la lamelle à l’eau et séchez-la à l’air comprimé. Retirez l’autre côté du support de l’entretoise d’imagerie et placez-le en sandwich entre la lame de quartz et la lamelle fonctionnalisée recouverte de streptavidine, à l’aide de la pince à épiler en plastique pour presser l’ensemble et éliminer les bulles d’air de l’adhésif.
6. Insérez un tube en polyéthylène de 30 cm de long dans chaque trou de la glissière en quartz. Assurez-vous de couper les extrémités du tube à un angle pour assurer la libre circulation de la solution. Utilisez un support de tubes ou un autre support pour maintenir les tubes en place et scellez les tubes en place et les bords de l’appareil assemblé avec de l’époxy.
   REMARQUE : Il fonctionne bien de construire l’appareil sur un morceau de parafilm, qui peut facilement être décollé du fond lorsque l’époxy a pris.
7. Une fois que l’époxy a pris, insérez l’aiguille émoussée de la seringue vide dans le tube de sortie de l’appareil et plongez l’extrémité du tube d’entrée dans un récipient rempli de tampon de blocage. Tirez sur le piston de la seringue pour remplir l’appareil de tampon de blocage. Laissez l’appareil incuber pendant au moins 30 minutes avant de l’utiliser.

5. Attache de surface d’un substrat d’ADN marqué par des points quantiques

REMARQUE : Outre le dispositif microfluidique, le substrat d’ADN et le tampon de blocage décrits ci-dessus, voir le tableau des matériaux pour les autres matériaux et le tableau 1 pour les tampons nécessaires à l’attache de surface des substrats d’ADN marqués par des points quantiques.

1. Fixez le dispositif microfluidique à la plaque de la platine du microscope à l’aide de ruban adhésif, mettez l’objectif en contact avec le bas du dispositif et positionnez l’objectif de manière à ce que le champ de vision se trouve à l’intérieur du canal microfluidique.
2. Rincez le canal microfluidique avec un tampon de blocage frais en tirant le piston de la seringue vers l’arrière après avoir connecté le tube de sortie à la pompe à seringue. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles piégées dans le tube ou dans le canal.
   REMARQUE : À partir de ce point, assurez-vous que le tube d’entrée est liquide afin qu’aucune bulle d’air ne soit introduite dans l’appareil.
3. Diluer 1 μL du substrat d’ADN préparé dans 1 mL de tampon de blocage. Placez le tube d’entrée dans le substrat d’ADN dilué et faites couler 800 μL de la solution de substrat à travers le canal à une vitesse de 200 μL/min. Laissez la solution d’ADN incuber dans le canal sans être perturbée pendant 15 minutes après l’arrêt de l’écoulement.
4. Verser au moins 800 μL de tampon de blocage à travers le canal à une vitesse de 200 μL/min pour rincer l’ADN non lié du canal.
5. Ajustez la puissance du laser, la mise au point du microscope et l’angle TIRF de sorte que les points quantiques attachés à la surface soient clairement visibles.
   REMARQUE : Bien que les points quantiques ne blanchissent pas rapidement, il est préférable de maintenir la puissance aussi faible que possible pour minimiser le clignotement.

6. Clivage de l’ADN médié par la REase

REMARQUE : Voir le Tableau des matériaux pour les matériaux et le Tableau 1 pour les tampons requis pour le clivage de l’ADN médié par REase.

1. Assurez-vous que la caméra est refroidie à la température de fonctionnement optimale et configurée pour la diffusion à grande vitesse avec un temps d’exposition de 0,10 s. Soyez prêt à collecter des données pendant ~4 min.
2. Rincer le dispositif microfluidique avec 800 μL de tampon expérimental sans magnésium à un débit de 200 μL/min.
3. Ajouter la REase à une aliquote (1 mL) de tampon expérimental sans magnésium et mélanger doucement par pipetage. Utilisez 4 μL de 100 000 unités/mL, ce qui correspond à 400 unités/mL d’EcoRV. Écouler 800 μL de l’enzyme diluée à travers le canal à un débit de 200 μL/min.
4. Commencer l’expérience en écoulant un tampon expérimental contenant du magnésium et de la fluorescéine à un débit de 200 μL/min. Commencez à capturer des données immédiatement après avoir démarré le pousse-seringue. Après avoir écoulé 800 μL de tampon, arrêtez l’acquisition des données.

7. Analyse des données

REMARQUE : Consultez la table des matériaux pour connaître le logiciel d’analyse de données utilisé pour ce protocole, et faites des ajustements si vous utilisez une autre plateforme d’analyse.

1. Détermination du point temporel zéro
   1. Soustrayez la fluorescence d’arrière-plan de chaque image du film expérimental à l’aide de la fonction imtophat , une fonction de filtrage morphologique intégrée dans la boîte à outils de traitement d’image. Sélectionnez un disque d’un rayon de trois pixels comme élément structurant. Obtenez l’intensité de l’arrière-plan en soustrayant l’image filtrée de l’image d’origine.
      REMARQUE : Le filtre ne conserve que les caractéristiques de l’image plus claires que l’arrière-plan et plus petites que l’élément structurant.
   2. Faites la moyenne de l’arrière-plan soustrait sur chaque image de la vidéo. Utilisez une trajectoire de cette valeur pour déterminer le point temporel zéro de l’expérience (Figure 3A). Déterminez l’heure de début en trouvant la première trame à laquelle le taux d’augmentation dépasse 3 fois l’écart-type du taux de variation pendant l’écoulement volumique mort.
      REMARQUE : une forte augmentation du taux de variation de la valeur moyenne de l’arrière-plan soustrait pour chaque image de film indique le moment où le tampon expérimental final contenant le colorant traceur est entré dans la cellule d’écoulement (Figure 3B).
2. Calcul et analyse de la trajectoire d’intensité des points quantiques
   1. Calculez une projection d’intensité maximale pour l’ensemble d’images vidéo corrigées en arrière-plan enregistrées avant l’arrivée du colorant traceur. Déterminez l’emplacement des points quantiques avec une précision d’un pixel dans cette image de projection à l’aide d’une fonction de recherche de pic telle que pkfnd.
   2. Générez des trajectoires d’intensité pour des points quantiques individuels en calculant l’intensité moyenne dans chaque image vidéo d’une région carrée, trois pixels par côté entourant l’emplacement renvoyé par la fonction de recherche de pic.
      REMARQUE : La correction d’arrière-plan décrite ci-dessus supprime les artefacts introduits par le colorant traceur. Les trajectoires d’intensité qui en résultent doivent être relativement stables, mais inclure tout de même des fluctuations d’intensité naturelles (figure 4).
   3. Identifier les événements de disparition de points quantiques par l’analyse statistique des trajectoires d’intensité. Pour chaque trajectoire d’intensité de boîte quantique, calculez une intensité seuil supérieure à la valeur minimale d’une fraction appropriée de la différence entre les valeurs maximale et minimale de cette trajectoire, en fonction du bruit observé dans les trajectoires.
      REMARQUE : La fluctuation d’intensité du point quantique est généralement beaucoup plus grande que la fluctuation de fond. Une valeur appropriée peut être déterminée en comparant ces valeurs : le seuil sélectionné doit être supérieur à la valeur de fond la plus élevée, mais idéalement inférieur à la valeur la plus basse pour la fluorescence à points quantiques. Pour les données présentées, le seuil utilisé a été calculé de manière à être supérieur à la valeur minimale pour chaque trajectoire plus un tiers de la différence entre les valeurs maximale et minimale pour cette trajectoire. On peut considérer qu’un point quantique disparaît au dernier moment où l’intensité observée à son emplacement était supérieure à ce seuil.
   4. Confirmer les événements de disparition présumée. N’incluez les événements dans l’analyse finale que si l’intensité observée est supérieure au point médian entre les valeurs d’intensité minimale et maximale de la trajectoire pour plus de la moitié des images du film avant le moment de la disparition et que l’écart-type de la trajectoire d’intensité a diminué après l’événement.
      REMARQUE : D’autres tests statistiques peuvent être utilisés pour s’assurer que seuls les événements de disparition valides sont enregistrés.

La cellule d’écoulement est directement couplée à un objectif à immersion dans l’huile à grande ouverture numérique à grossissement 60x sur un microscope inversé équipé d’un éclairage laser pour l’imagerie TIRF à travers l’objectif (Figure 5A). Après avoir introduit le substrat d’ADN et éliminé l’excès d’ADN et de points quantiques, il y a généralement des milliers de points quantiques individuels dans un champ de vision (Figure 5B). Ces points quantiques sont fixés de manière stable à la surface du verre, et ils ne subissent pas de gradation notable ou de blanchiment significatif sur l’échelle de temps de l’expérience. Cependant, si un tampon contenant à la fois du magnésium et une REase appropriée est écoulé dans le canal d’écoulement, à la fin d’une période d’observation typique de quatre minutes, au moins 30 % des points quantiques présents au début d’une expérience auront disparu du champ de vision. Confirmant l’exigence en magnésium, lorsque la REase circule dans le canal en l’absence de magnésium, au moins 95% des points quantiques présents au début de l’expérience sont encore visibles à la fin de la période d’observation (Figure 5C). Cependant, lorsque le tampon contenant du magnésium est écoulé immédiatement après avoir permis à la REase de se lier à l’ADN lié à la surface en l’absence de magnésium, jusqu’à la moitié des points quantiques auront disparu à la fin de la période d’observation (Figure 5D), comme c’est le cas lorsque la REase et le magnésium ont été circulés ensemble dans le canal. Le rendement exact des événements dépendra de l’efficacité de l’enzyme dans les conditions utilisées. Lorsque le tampon contenant du magnésium est écoulé sans avoir préalablement introduit la REase appropriée dans le canal d’écoulement, moins de 5 % des points quantiques disparaissent pendant la période d’observation, et il n’y a pas de pic discernable pour un histogramme des événements. Ce résultat indique que les molécules REase pré-liées médient le clivage de l’ADN qui attache les points quantiques à la surface du verre, et ce clivage de l’ADN est responsable de la grande majorité des événements de disparition de points quantiques observés dans ces expériences.

La disparition des points quantiques se produit rapidement et entraîne une forte diminution de la trajectoire d’intensité, fournissant une indication claire du moment où une molécule d’ADN donnée est clivée (Figure 5E). La détermination des temps d’événements est réalisée par l’analyse mathématique des trajectoires d’intensité. Les points quantiques uniques génèrent des trajectoires d’intensité avec une variance significativement plus élevée que le bruit de fond dans les conditions d’image utilisées, de sorte que les événements présumés sont confirmés lorsque la variance de la trajectoire d’intensité diminue à un niveau comparable à la variance du bruit de fond après la baisse d’intensité observée. De plus, les trajectoires qui comprennent un degré élevé de clignement des yeux avant un événement de disparition présumée sont exclues de l’analyse finale. Cependant, une expérience typique aboutit à des centaines d’événements qui répondent à ces critères, et les résultats de plusieurs expériences peuvent être regroupés pour fournir des statistiques adéquates afin de permettre l’estimation des paramètres N et β par ajustement de la courbe des moindres carrés non linéaire ou par estimation des paramètres du maximum de vraisemblance.

Les données représentatives présentées ont été recueillies en réalisant cette expérience avec le REase de type IIP bien étudié, EcoRV (Vidéo 1). Le substrat d’ADN duplex de 60 pb de long est construit avec une molécule de biotine à l’extrémité 5' d’un brin du duplex et un point quantique attaché de manière covalente à l’extrémité 5' de l’autre brin. Le substrat de l’ADN contient une seule copie de la séquence de reconnaissance, GAT↓ATC, qui est clivée par EcoRV au milieu, comme l’indique la flèche vers le bas (↓). EcoRV a été prélié au substrat de l’ADN en l’absence de magnésium, puis un tampon contenant du magnésium a été écoulé pour initier le clivage de l’ADN. Les données représentatives comprennent les résultats regroupés de cinq expériences distinctes, ce qui donne un total de 3451 événements de clivage observés. Après avoir exclu les événements qui se sont produits avant le point temporel zéro ou en dehors du pic d’activité important, il restait 2987 événements, ce qui était suffisant pour remplir un histogramme avec des groupes d’une seconde. L’ajustement de la courbe des moindres carrés non linéaires et l’estimation du paramètre du maximum de vraisemblance ont été utilisés pour extraire les valeurs de N et de β des données. Les deux méthodes d’estimation des paramètres étaient en accord (figure 6A), avec N = 3,52 (intervalle de confiance à 95 % : 3,32-3,71) et β = 5,78 s (intervalle de confiance à 95 % : 5,41-6,15 s) pour l’ajustement non linéaire des moindres carrés et N = 3,41 (intervalle de confiance à 95 % : 3,25-3,58) et β = 6,06 s (intervalle de confiance à 95 % : 5,75-6,39 s) pour l’estimation du maximum de vraisemblance.

L’estimation d’au moins trois étapes cinétiques est raisonnable compte tenu de ce que l’on sait du mécanisme de l’EcoRV. Cette enzyme est connue pour se lier à l’ADN de manière non spécifique en l’absence de magnésium14. L’observation en phase de solution en vrac des changements dans la fluorescence intrinsèque des résidus de tryptophane dans l’EcoRV dans des conditions d’écoulement arrêté a suggéré que l’EcoRV qui s’est lié à l’ADN en l’absence de magnésium doit subir un changement de conformation avant l’entrée du magnésium dans le site actif18. Cette observation est corroborée par les données de structure cristalline19. Les résultats des études de fluorescence du tryptophane indiquent également que le clivage de l’ADN et la libération du produit sont des étapes distinctes qui se produisent à des taux similaires18. Par conséquent, un mécanisme de réaction raisonnable pour le clivage de l’ADN médié par EcoRV dans cette expérience est :

ES → ES* → EP → E+P

Dans ce mécanisme, l’ES, le complexe enzyme-substrat initial, se forme lorsque l’EcoRV est prélié à l’ADN en l’absence de magnésium. Lorsque le magnésium pénètre dans la cellule d’écoulement, le complexe enzyme-substrat subit un changement de conformation pour devenir ES*, le complexe enzyme-substrat activé. Ce complexe activé clive ensuite l’ADN, mais ne libère pas immédiatement les molécules du produit, devenant un complexe enzyme-produit (PE). Enfin, le produit, P, est lancé dans la dernière étape. Ce mécanisme nécessite trois étapes, ce qui est en accord avec les données présentées. L’estimation résultante du temps d’attente moyen pour chaque étape est de ~6 s, ce qui équivaut à un taux de 0,17 s-1 pour chaque étape. Ce calcul est généralement en accord avec les estimations précédentes des taux pour ces processus - de l’ordre de 0,3-0,4 s-1 pour le clivage de l’ADN et la libération de produit et de ~0,5 s-1 pour le réarrangement conformationnel.

Figure 1 : Schéma de réaction de l’ADN et de l’enzyme marqués. Les molécules d’ADN marquées par des points quantiques sont attachées à la surface du verre fonctionnalisé par liaison biotine-streptavidine-biotine et observées à l’aide de la microscopie TIRF. Les molécules d’ADN contiennent le site de reconnaissance de la REase d’intérêt. Lorsqu’une molécule d’ADN est clivée par la REase, le point quantique est libre de diffuser loin de la surface et hors de la zone d’éclairage. Abréviations : REase = endonucléase de restriction ; PEG = polyéthylène glycol ; TIRF = fluorescence à réflexion interne totale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dispositif de cellule à flux microfluidique. (A) Vue éclatée montrant les trois couches utilisées pour créer le dispositif : la lamelle en verre fonctionnalisé sur le fond, la lame de quartz avec des trous d’entrée et de sortie sur le dessus, et l’entretoise d’imagerie adhésive double face avec un canal découpé en sandwich au milieu. (B) Un dispositif complet avec des tubes en polyéthylène scellés en place et avec des bords recouverts d’époxy. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Détermination du point temporel zéro. (A) Intensité moyenne de l’arrière-plan déterminée à l’aide de la fonction de filtrage morphologique du chapeau haut de forme sur chaque image du film. L’intensité du bruit de fond augmente considérablement lorsque le tampon expérimental contenant de la fluorescéine entre dans le champ de vision. Les résultats de trois expériences différentes sont présentés ici. Il y a une variation substantielle dans le temps de latence d’une expérience à l’autre. (B) La forte augmentation du taux de changement de la trajectoire de l’intensité de fluorescence de fond facilite la détermination précise du point temporel zéro. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Correction de l’arrière-plan. L’augmentation de l’intensité de fond due au colorant traceur de fluorescéine indiquant l’arrivée du magnésium peut être observée dans les trajectoires d’intensité de fluorescence brute pour les points quantiques individuels (trajectoire grise). Après soustraction de l’arrière-plan à l’aide de la fonction de filtrage morphologique haut-de-forme, les artefacts introduits par le colorant traceur ont été retirés de la trajectoire (trajectoire noire). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Expérience TIRF à molécule unique pour des observations parallélisées d’événements de clivage de l’ADN. (A) Une cellule d’écoulement construite sur une surface en verre fonctionnalisée conçue pour capturer de l’ADN marqué par des points quantiques est directement couplée à un objectif de microscope à immersion dans l’huile 60x à grande ouverture numérique pour l’imagerie TIRF. (B) Image représentative du début d’une expérience. L’ADN marqué par des points quantiques a été chargé dans la cellule d’écoulement et les points quantiques non liés en excès ont été emportés. Les points quantiques individuels liés à l’ADN peuvent être résolus les uns des autres. (C) Le même champ de vision après qu’un tampon contenant une REase capable de cliver les attaches d’ADN a été écoulé à travers le canal d’écoulement en l’absence de magnésium pendant quatre minutes. Il n’y a pas eu de perte significative de points quantiques attachés à l’ADN. (D) Le même champ de vision à la fin d’une expérience. Le tampon contenant du magnésium a été écoulé à travers le canal d’écoulement immédiatement après l’écoulement de REase dans un tampon sans magnésium. Cette image a été acquise après environ quatre minutes de flux de mémoire tampon. Les REases pré-rebondies ont clivé de nombreuses attaches d’ADN, libérant les points quantiques de la surface. Pour faciliter la visualisation, seul le quadrant central du champ de vision de l’objectif est affiché dans chaque image. Dix images de film (soit l’équivalent d’une seconde de temps d’observation) ont été moyennées pour diminuer les effets du clignotement des points quantiques. Les paramètres de luminosité et de contraste sont identiques pour les trois images. (E) Trajectoires représentatives de l’intensité de la fluorescence à partir des emplacements de l’image où un point quantique était présent au début de l’expérience. Les trajectoires obtenues à partir de positions d’images correspondant à des points quantiques qui ne sont pas libérés de la surface (gris) peuvent présenter de brèves baisses à un niveau d’intensité plus faible, mais elles commencent et se terminent à un niveau d’intensité élevé. Les trajectoires obtenues à partir des emplacements d’images, correspondant à des points quantiques qui sont libérés de la surface (noir), présentent une diminution rapide de l’intensité jusqu’à un faible niveau de fond instantané par rapport à la résolution temporelle de l’expérience (10 Hz). Les points quantiques libérés ne réapparaissent pas dans la période d’observation de quatre minutes. Abréviations : REase = endonucléase de restriction ; TIRF = fluorescence à réflexion interne totale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse de la distribution en temps d’arrêt du clivage de l’ADN médié par EcoRV. (A) Histogramme et enveloppes prédites pour les 2987 événements de clivage qui se produisent au cours du pic d’activité principal dans un ensemble de cinq expériences regroupées avec EcoRV. Les deux courbes prédites sont presque identiques, et les résidus d’ajustement (sous l’histogramme) n’indiquent pas d’erreur systématique dans l’ajustement non linéaire des moindres carrés. (B) Histogramme de l’ensemble des 3393 événements de clivage qui se sont produits après le point temporel zéro. La courbe prédite par l’estimation du maximum de vraisemblance des paramètres (ligne ininterrompue, courbe MLE) en supposant une distribution de probabilité gamma ne parvient pas à englober l’histogramme. La courbe prédite par un ajustement non linéaire des moindres carrés de la formule de la distribution de probabilité gamma aux hauteurs de groupe (ligne pointillée, courbe NLS) est supérieure, mais les résidus de l’ajustement (sous l’histogramme) révèlent une erreur systématique. Abréviations : MLE : estimation du maximum de vraisemblance ; NLS = moindres carrés non linéaires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Tableau des tampons.

Vidéo 1 : Exemple de film sur une molécule unique. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Les auteurs n’ont pas d’intérêts financiers concurrents ou d’autres conflits d’intérêts