Acétylation spécifique de la lysine des histones pour la reconstitution des nucléosomes à l’aide de l’expansion du code génétique chez Escherichia coli

Résumé

Nous présentons ici une méthode pour exprimer les protéines histones acétylées en utilisant l’expansion du code génétique et assembler des nucléosomes reconstitués in vitro.

Résumé

Les protéines histones acétylées peuvent être facilement exprimées dans Escherichia coli codant pour un mutant, N^ε-acétyl-lysine (AcK)-methanosarcina mazi pyrrolysine ARNt-synthétase (MmAcKRS1) et son ARNt apparenté (ARNt^Pyl)pour assembler des mononucléosomes reconstitués avec des histones acétylées spécifiques au site. MmAcKRS1 et tRNA^Pyl délivrent AcK à un emplacement ambré de mutation dans l’ARNm de choix pendant la traduction dans Escherichia coli. Cette technique a été largement utilisée pour incorporer AcK aux sites de lysine H3. La pyrrolysyl-ARNt synthétase (PylRS) peut également être facilement évoluée pour incorporer d’autres acides aminés non canoniques (NCAAs) pour la modification ou la fonctionnalisation des protéines spécifiques au site. Ici, nous détaillons une méthode pour incorporer AcK en utilisant le système MmAcKRS1 dans l’histone H3 et intégrer les protéines H3 acétylées dans les mononucléosomes reconstitués. Les mononucléosomes reconstitués acétylés peuvent être utilisés dans les tests biochimiques et de liaison, la détermination de la structure, etc. L’obtention de mononucléosomes modifiés est cruciale pour concevoir des expériences liées à la découverte de nouvelles interactions et à la compréhension de l’épigénétique.

Introduction

Nous avons utilisé PylRS et tRNA^Pyl pour synthétiser et assembler des mononucléosomes reconstitués avec des histones acétylées spécifiques au site. PylRS s’est avéré inestimable en tant qu’outil d’expansion du code génétique pour produire des protéines avec des modifications post-traductionnelles (PTM) et a été génétiquement évolué pour incorporer environ 200 NCA différents. PylRS incorpore au codon ambré, éliminant la concurrence d’autres acides aminés pendant la traduction. PylRS a été découvert pour la première fois dans les archées méthanogènes, et a depuis été utilisé en biologie chimique pour incorporer de nouveaux groupes chimiques réactifs dans les ....

Protocole

1. Construction du plasmide

1. Commencez par décider quelle protéine d’histone sera acétylée et à quel site de lysine. Muter l’emplacement au codon ambrique (TAG) utilisant la mutagenèse dirigée par site.
   REMARQUE: Il existe quatre plasmides précédemment conçus utilisés pour l’expression de protéines histones. Chacun des quatre protéines d’histone a été cloné dans le vecteur pETDuet-1 avec une étiquette N-terminale d’histidine. L’histone H4 comprend également une étiquette SUMO, l’origine de la réplication colE1 avec un numéro de copie d’environ 40, résistante à l’ampicilline et un promoteur T7.
   1. Concevoir des amorces avant et arrière qui con....

Résultats

Les dimères, les tétramères et les octamères peuvent être évalués en exécutant un gel PAGE SDS à 12 %(figure 1 et figure 2). Ici, vous pouvez voir que certains des tétramères acétylés ont un rendement inférieur à d’autres (Figure 1). En fait, plus on se rapproche de la région centrale, plus le rendement observé est faible. Cela est probablement dû à l’acétylation interférant avec l’assemblage du tétr.......

Discussion

Il est essentiel de suivre ce protocole dans les moindres détails lors d’une expérience. Les nucléosomes ne sont pas très stables et beaucoup d’essais et d’erreurs ont été consacrés à la détermination de ce protocole. Il est essentiel d’éliminer les précipités à chaque étape (ou chaque fois qu’elles sont observées), car les particules peuvent facilement interférer avec les processus d’assemblage. Gardez toujours les échantillons d’histones sur la glace. Si les nucléosomes sont stockés à 4 °C pendant trop longtemps, ils p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,5 M Tampon TE	NA	NA	0,5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
M Tampon TE	NA	NA	1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
100x TE Buffer	NA	NA
2 M TE Buffer	NA	NA	2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
20 mM TE Buffer	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8
6 M GuHCl			6M chlorure de guanidinium, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,0
d’acétyllysine
	NA		NA 6 M urée, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7,8
Tampon à élution	NA	NA
Fisherbrand  ; Pompe de transfert de produits chimiques à débit variable	Fischer Scientific	15-077-67
Protéase
Tampon de lyse des histones	NA		NA 60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0,5 % Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8,0
Résine			6 M urée, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7,8
Kit de nettoyage PCR	Epoch Life	2360050
Tampon de lavage des granulés	NA	NA	60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0
petDUET-His-SUMO-TEV-H4
petDUET-His-TEV-H2A
petDUET-His-TEV-H2B
petDUET-His-TEV-H3
pEVOL-AckRS	Addgene	137976
pGEM-3z/601	Addgene	26656
Tampon de stockage	NA	NA	20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20 % glycérol, pH 7,8
Thermocycleur

1 Tampon de lavage sur colonne His-TEV Ni-NTA