Imagerie en temps réel à large champ des signaux de plaies locales et systémiques chez Arabidopsis

Résumé

La signalisation systémique glutamate-déclenchée extracellulaire de calcium est critique pour l’induction des réponses de défense des plantes à la blessure mécanique et à l’attaque herbivore dans les plantes. Cet article décrit une méthode pour visualiser la dynamique spatiale et temporelle de ces deux facteurs utilisant des plantes de thaliana d’Arabidopsis exprimant des biocapteurs fluorescents calcium et glutamate-sensibles.

Résumé

Les plantes réagissent aux contraintes mécaniques telles que la blessure et l’herbivorie en induisant des réponses de défense à la fois dans les parties endommagées et dans les parties distales non endommagées. Lors du enroulement d’une feuille, une augmentation de la concentration cytosolique d’ions calcium (signal Ca²⁺⁾ se produit sur le site de la plaie. Ce signal est rapidement transmis aux feuilles intactes, où les réponses de défense sont activées. Nos recherches récentes ont révélé que le glutamate qui fuit des cellules blessées de la feuille dans l’apoplaste qui les entoure sert de signal de plaie. Ce glutamate active les canaux perméables Ca²⁺ de type récepteur du glutamate, ce qui conduit ensuite à la propagation du signal Ca²⁺ à longue distance dans toute la plante. Les caractéristiques spatiales et temporelles de ces événements peuvent être capturées avec l’imagerie en temps réel de plantes vivantes exprimant des biocapteurs fluorescents génétiquement codés. Ici, nous introduisons une méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante pour surveiller la dynamique des signaux Ca^{2 +} et des changements dans le glutamate apoplasique qui se produisent en réponse à la blessure. Cette approche utilise un microscope à fluorescence à large champ et des plantes arabidopsis transgéniques exprimant des biocapteurs Ca²⁺ et glutamate à base de protéines fluorescentes vertes (GFP). En outre, nous présentons la méthodologie pour obtenir facilement la propagation rapide et à longue distance causée par la blessure et glutamate-déclenchée de signal de Ca^2+. Ce protocole peut également être appliqué à des études sur d’autres contraintes de la plante pour aider à étudier comment la signalisation systémique de la plante pourrait être impliquée dans leurs réseaux de signalisation et de réponse.

Introduction

Les plantes ne peuvent pas échapper aux stress biotiques, par exemple les insectes qui s’en nourrissent, elles ont donc développé des systèmes sophistiqués de détection du stress et de transduction des signaux pour détecter et ensuite se protéger contre des défis tels que l’herbivorie^1. Lors d’une blessure ou d’une attaque herbivore, les plantes déclenchent des réponses de défense rapides, y compris l’accumulation de l’acide jasmonique phytohormone (JA) non seulement sur le site blessé, mais également dans les organes distaux intacts^2. Ce JA déclenche alors à la fois des réponses de défense dans les tissus directement en....

Protocole

1. Préparation du matériel végétal

1. Dans un microtube de 1,5 mL, stériliser en surface les graines de la plante Arabidopsis thaliana (Col-0 accession) exprimant soit GCaMP3, soit CHIB-iGluSnFR en secouant avec 20% (v/v) de NaClO pendant 3 min, puis laver 5 fois avec de l’eau distillée stérile.
   NOTE: Les lignées transgéniques d’Arabidopsis exprimant GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR ont été décrites précédemment^6.
2. Dans une hotte stérile, semez 13 graines stérilisées en surface sur une boîte de Petri en plastique carré de 10 cm remplie de 30 mL de murashige stérile (autoclavé) et de milieu Skoog (MS) [1x sels MS, 1% ....

Résultats

La propagation du signal de^[Ca2+]_cyt et [Glu]_apo en réponse à la blessure est présentée à la figure 3, à la figure 4, au film S1et au film S2. La coupe du pétiole de la feuille 1 chez les plantes exprimant GCaMP3 (à 0 s) a conduit à une augmentation significative du_cyte ^[Ca2+]qui a été rapidement induite localement par la vascularisation (à 4.......

Discussion

La signalisation systémique est importante pour que les plantes réagissent à des stimuli environnementaux externes localisés, puis maintiennent leur homéostasie à un niveau de plante entière. Bien qu’ils ne soient pas équipés d’un système nerveux avancé comme les animaux, ils emploient une communication rapideà la fois à l’intérieur et entre les organes en fonction de facteurs tels que les signaux électriques mobiles (et éventuellement hydrauliques) et les ondes de propagation de ROS et^{Ca2+ 4.......}

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Arabidopsis exprimant GCaMP3	Saitama University
Arabidopsis exprimant CHIB-iGluSnFR	Saitama University
GraphPad Prism 7	GraphPad Software
L-Glutamate	FUJIFILM Wako	072-00501	Dissous dans un milieu de croissance liquide [sels MS 1/2x, saccharose 1 % (p/v) et 0,05 % (p/v) MES ; pH 5,1 ajusté avec 1N KOH].
Microsoft Excel	Microsoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) medium	FUJIFILM Wako	392-00591	composition : 1x sels MS, 1 % (p/v) de saccharose, 0,01 % (p/v) de myoinositol, 0,05 % (p/v) de MES et 0,5 % (p/v) de gomme gellane ; pH 5,7 ajusté avec 1N KOH.
Stéréomicroscope Nikon SMZ25	Analyse AR Nikon
NIS-Elements
1x (P2-SHR PLAN APO)Appareil	Nikon
sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2)	Hamamatsu Photonics	C11440-22CU
Boîte de Pétri carrée en plastique	Simport	D210-16

Objectif Nikon photo