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Article de méthode

Imagerie en temps réel à large champ des signaux de plaies locales et systémiques chez Arabidopsis

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DOI :

10.3791/62114

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4 juin 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Saitama University, 2Department of Botany, University of Wisconsin

Dans cet article

Résumé

La signalisation systémique glutamate-déclenchée extracellulaire de calcium est critique pour l’induction des réponses de défense des plantes à la blessure mécanique et à l’attaque herbivore dans les plantes. Cet article décrit une méthode pour visualiser la dynamique spatiale et temporelle de ces deux facteurs utilisant des plantes de thaliana d’Arabidopsis exprimant des biocapteurs fluorescents calcium et glutamate-sensibles.

Résumé

Les plantes réagissent aux contraintes mécaniques telles que la blessure et l’herbivorie en induisant des réponses de défense à la fois dans les parties endommagées et dans les parties distales non endommagées. Lors du enroulement d’une feuille, une augmentation de la concentration cytosolique d’ions calcium (signal Ca2+) se produit sur le site de la plaie. Ce signal est rapidement transmis aux feuilles intactes, où les réponses de défense sont activées. Nos recherches récentes ont révélé que le glutamate qui fuit des cellules blessées de la feuille dans l’apoplaste qui les entoure sert de signal de plaie. Ce glutamate active les canaux perméables Ca2+ de type récepteur du glutamate, ce qui conduit ensuite à la propagation du signal Ca2+ à longue distance dans toute la plante. Les caractéristiques spatiales et temporelles de ces événements peuvent être capturées avec l’imagerie en temps réel de plantes vivantes exprimant des biocapteurs fluorescents génétiquement codés. Ici, nous introduisons une méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante pour surveiller la dynamique des signaux Ca2 + et des changements dans le glutamate apoplasique qui se produisent en réponse à la blessure. Cette approche utilise un microscope à fluorescence à large champ et des plantes arabidopsis transgéniques exprimant des biocapteurs Ca2+ et glutamate à base de protéines fluorescentes vertes (GFP). En outre, nous présentons la méthodologie pour obtenir facilement la propagation rapide et à longue distance causée par la blessure et glutamate-déclenchée de signal de Ca2+. Ce protocole peut également être appliqué à des études sur d’autres contraintes de la plante pour aider à étudier comment la signalisation systémique de la plante pourrait être impliquée dans leurs réseaux de signalisation et de réponse.

Introduction

Les plantes ne peuvent pas échapper aux stress biotiques, par exemple les insectes qui s’en nourrissent, elles ont donc développé des systèmes sophistiqués de détection du stress et de transduction des signaux pour détecter et ensuite se protéger contre des défis tels que l’herbivorie1. Lors d’une blessure ou d’une attaque herbivore, les plantes déclenchent des réponses de défense rapides, y compris l’accumulation de l’acide jasmonique phytohormone (JA) non seulement sur le site blessé, mais également dans les organes distaux intacts2. Ce JA déclenche alors à la fois des réponses de défense dans les tissus directement endommagés et induit préventivement des défenses dans les parties intactes de la plante. Chez Arabidopsis,l’accumulation de JA induite par la blessure a été détectée dans des feuilles distales et intactes en quelques minutes seulement après avoir été endommagées ailleurs dans la plante, ce qui suggère qu’un signal rapide et à longue distance est transmis à partir de la feuille blessée3. Plusieurs candidats, tels queCa2+,les espèces réactives de l’oxygène (ROS), et les signaux électriques, ont été proposés pour servir de signaux enroulés à longue distance dans les plantes4,5.

Ca2+ est l’un des éléments messagers deuxièmes les plus polyvalents et les plus omniprésents dans les organismes eucaryotes. Chez les plantes, la mastication des chenilles et les blessures mécaniques provoquent des augmentations drastiques de la concentration cytosolique deCa2+ ([Ca2+]cyt)à la fois dans la feuille blessée et dans les feuilles éloignées non enroulées6,7. Ce signal systémiqueCa2+ est reçu par des protéines de détectionca2+intracellulaires, qui conduisent à l’activation des voies de signalisation de défense en aval, y compris la biosynthèse JA8,9. En dépit de nombreux tels rapports soutenant l’importance des signaux de Ca2+ dans des réponses de blessure d’usine, l’information sur les caractéristiques spatiales et temporelles des signaux de Ca2+ induits par blessure est limitée.

L’imagerie en temps réel à l’aide d’indicateurs Ca2+ génétiquement codés est un outil puissant pour surveiller et quantifier la dynamique spatiale et temporelle des signaux Ca2+. À ce jour, des versions de ces capteurs ont été développées qui permettent la visualisation des signaux Ca2+ au niveau d’une seule cellule, vers des tissus, des organes et même des plantes entières10. Le premier biocapteur génétiquement codé pour Ca2+ utilisé dans les plantes était la protéine bioluminescente aequorine dérivée de la méduse Aequorea victoria11. Bien que cette protéine chimiluminescente ait été utilisée pour détecter les changements deCa2+ en réponse à diverses contraintes chez les plantes12,13,14,15,16,17,18,elle n’est pas bien adaptée à l’imagerie en temps réel en raison du signal luminescent extrêmement faible qu’elle produit. Les indicateurs Ca2+ basés sur le transfert d’énergie de résonance de Förster (FRET), tels que les caméléons jaunes, ont également été utilisés avec succès pour étudier la dynamique d’une gamme d’événements de signalisation Ca2 + dans les plantes19,20,21,22,23,24. Ces capteurs sont compatibles avec les approches d’imagerie et sont le plus souvent composés de la protéine de liaison Ca2+ calmoduline (CaM) et d’un peptide de liaison au CaM (M13) à partir d’une kinase à chaîne légère de myosine, toutes fusionnées entre deux protéines fluorophores, généralement une protéine fluorescente cyan (CFP) et une variante de protéine fluorescente jaune (YFP)10. Ca2+ se liant au CaM favorise l’interaction entre le CaM et le M13 conduisant à un changement conformationnel du capteur. Ce changement favorise le transfert d’énergie entre le CFP et le YFP, ce qui augmente l’intensité de fluorescence du YFP tout en diminuant l’émission de fluorescence du CFP. La surveillance de ce passage de la CFP à la fluorescence YFP fournit ensuite une mesure de l’augmentation du niveau de Ca2 +. En plus de ces capteurs FRET, les biocapteurs Ca2+ à base de protéines fluorescentes uniques (FP), tels que GCaMP et R-GECO, sont également compatibles avec les approches d’imagerie végétale et sont largement utilisés pour étudier les changementsde cytaires [Ca2+ ] en raison de leur sensibilité élevée et de leur facilité d’utilisation25,26,27,28,29,30. Les GCaMPs contiennent un seul GFP permuté circulairement (cp), à nouveau fusionné au CaM et au peptide M13. L’interaction dépendante du Ca2+entre le CaM et le M13 provoque un changement conformationnel dans le capteur qui favorise un changement dans l’état de protonation du cpGFP, améliorant ainsi son signal fluorescent. Ainsi, à mesure que les niveaux de Ca2+ augmentent, le signal cpGFP augmente.

Pour étudier la dynamique des signaux Ca2+ générés en réponse à une blessure mécanique ou à une alimentation herbivore, nous avons utilisé des plantes transgéniques Arabidopsis thaliana exprimant une variante GCaMP, GCaMP3, et un microscope à fluorescence à large champ6. Cette approche a réussi à visualiser la transmission rapide d’un signal Ca2+ longue distance du site de la plaie sur une feuille à la plante entière. Ainsi, une augmentation de [Ca2+]cyt a été immédiatement détectée à l’emplacement de blessure mais ce signal de Ca2+ a été alors propagé aux feuilles voisines par la vascularisation dans quelques minutes de blessure. En outre, nous avons constaté que la transmission de ce signal de plaie systémique rapide est abolie dans les plantes Arabidopsis avec des mutations dans deux gènes récepteur-comme de glutamate, glutamate récepteur comme (GLR), GLR3.3, et GLR3.66. Les GLR semblent fonctionner comme des canaux Ca2+ à capté d’acides aminés impliqués dans divers processus physiologiques, y compris la réponse de la plaie3,la croissance du tubepollinique 31,le développement des racines32,la réponse au froid33et l’immunité innée34. Malgré cette fonction physiologique large et bien comprise des GLRs, les informations sur leurs propriétés fonctionnelles, telles que leur spécificité de ligand, leur sélectivité ionique et leur localisation subcellulaire, sont limitéesà 35. Cependant, des études récentes ont rapporté que GLR3.3 et GLR3.6 sont localisés dans le phloème et le xylème, respectivement. Les GLR végétaux présentent des similitudes avec les récepteurs ionotropes du glutamate (iGluRs)36 chez les mammifères, qui sont activés par des acides aminés, tels que le glutamate, la glycine et la D-sérine dans le système nerveux des mammifères37. En effet, nous avons démontré que l’application de glutamate de 100 mM, mais pas d’autres acides aminés, sur le site de la plaie induit un signalCa2+ rapide et à longue distance chez Arabidopsis,indiquant que le glutamate extracellulaire agit probablement comme un signal de plaie dans les plantes6. Cette réponse est supprimée dans le mutant glr3.3/glr3.6 suggérant que le glutamate peut agir par l’un ou les deux canaux de type récepteur et en effet, AtGLR3.6 s’est récemment avéré être fermée par ces niveaux de glutamate38.

Dans les plantes, en plus de son rôle d’acide aminé structurel, le glutamate a également été proposé comme régulateur clé du développement39; cependant, sa dynamique spatiale et temporelle est mal comprise. Tout comme pour leCa2+,plusieurs indicateurs génétiquement codés pour le glutamate ont été développés pour surveiller la dynamique de cet acide aminé dans les cellules vivantes40,41. iGluSnFR est un biocapteur de glutamate mono-FP à base de GFP composé de cpGFP et d’une protéine de liaison au glutamate (GltI) d’Escherichia coli42,43. Le changement conformationnel d’iGluSnFR, qui est induit par la liaison de glutamate à GltI, a comme conséquence une émission augmentée de fluorescence de GFP. Pour étudier si le glutamate extracellulaire agit comme une molécule de signalisation dans la réponse de la plaie végétale, nous avons connecté la séquence iGluSnFR avec la séquence de sécrétion peptidique signal de chitinase de base (CHIB-iGluSnFR) pour localiser ce biocapteur dans l’espace apoplasique6. Cette approche a permis l’imagerie de tout changement dans la concentration de glutamate apoplasique ([Glu]apo)en utilisant des plantes transgéniques d’Arabidopsis exprimant ce capteur. Nous avons détecté des augmentations rapides du signal d’iGluSnFR à l’emplacement de blessure. Ces données soutiennent l’idée que le glutamate s’échappe des cellules / tissus endommagés vers l’apoplaste lors de la blessure et agit comme un signal de dommage activant les GLRs et conduisant au signal Ca2 + à longue distance dans les plantes6.

Ici, nous décrivons une méthode d’imagerie en temps réel à l’échelle de la plante utilisant des biocapteurs génétiquement codés pour surveiller et analyser la dynamique des signaux Ca2+ à longue distance et extracellulaires du glutamate en réponse à la blessure6. La disponibilité de la microscopie à fluorescence à large champ et de plantes transgéniques exprimant des biocapteurs génétiquement codés fournit une approche puissante, mais facile à mettre en œuvre pour détecter les signaux à longue distance transmis rapidement, tels que les ondes Ca2 +.

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Protocole

1. Préparation du matériel végétal

  1. Dans un microtube de 1,5 mL, stériliser en surface les graines de la plante Arabidopsis thaliana (Col-0 accession) exprimant soit GCaMP3, soit CHIB-iGluSnFR en secouant avec 20% (v/v) de NaClO pendant 3 min, puis laver 5 fois avec de l’eau distillée stérile.
    NOTE: Les lignées transgéniques d’Arabidopsis exprimant GCaMP3 ou CHIB-iGluSnFR ont été décrites précédemment6.
  2. Dans une hotte stérile, semez 13 graines stérilisées en surface sur une boîte de Petri en plastique carré de 10 cm remplie de 30 mL de murashige stérile (autoclavé) et de milieu Skoog (MS) [1x sels MS, 1% (p/v) de saccharose, 0,01% (p/v) de myoinositol, 0,05% (p/v) MES et 0,5% (p/v) de gomme gellan; pH 5,7 ajusté avec 1N KOH]. Remplacez le couvercle et enveloppez-le par du ruban chirurgical.
  3. Après incubation dans l’obscurité à 4 °C pendant 2 jours, placer les plaques horizontalement à 22 °C dans une chambre de croissance sous lumière continue (90-100 μmol m-2 s-1)pendant environ 2 semaines avant utilisation. Après 2 semaines, comptez le nombre de feuilles d’Arabidopsis du plus ancien au plus jeune44 (Figure 1). Les réponses des plaies se déplacent préférentiellement de la feuille endommagée (n) vers les feuilles numérotées n ± 3 et n ± 56.
    REMARQUE: Dans ce protocole, la boîte de Petri sera ouverte pour l’imagerie des effets de la plaie et du glutamate sous un microscope à fluorescence. Par conséquent, les étapes suivantes de cette expérience devraient être effectuées dans des conditions ambiantes à température et humidité contrôlées. En effet, les signaux Ca2+ sont également obtenus par les changements dans ces conditions environnementales. On sait également que la lumière bleue, émise par le microscope lors de l’enregistrement pour l’excitation de la fluorescence de la protéine biocapteur, peut provoquer une augmentation de la concentration cytosolique de Ca2+ 45 et donc la plante doit être acclimatée à l’irradiation de la lumière bleue pendant plusieurs minutes avant de commencer l’expérience.

2. Préparation chimique

  1. Dissoudre le L-glutamate dans un milieu de croissance liquide [1/2x sels ms, 1% (p/v) de saccharose et 0,05% (p/v) MES; pH 5,1 ajusté avec 1N KOH] pour obtenir une solution de travail de 100 mM.
    REMARQUE: Évitez d’utiliser des sels de glutamate tels que le glutamate de sodium pour prévenir les effets cationiques potentiels sur la dynamique du Ca2 +.

3. Réglage au microscope et réalisation d’images en temps réel

  1. Allumez le stéréomicroscope à fluorescence motorisé équipé d’une lentille d’objectif 1x (NA = 0,156) et d’une caméra sCMOS(Figure 2)et configurez les réglages de l’appareil pour irradier avec une lumière d’excitation de 470/40 nm et acquérir une lumière d’émission passant à travers un filtre de 535/50 nm.
    REMARQUE: Tout microscope à fluorescence sensible au GFP peut être utilisé pour détecter les signaux GCaMP3 et iGluSnFR en temps réel, mais un objectif de faible puissance et une caméra hautement sensible avec une large puce sCMOS sont recommandés pour acquérir des signaux de l’ensemble de l’usine. L’objectif de faible puissance permet l’imagerie de la réponse d’une usine Arabidopsis entière et l’utilisation d’une caméra hautement sensible permet l’acquisition rapide de données nécessaires pour capturer le cours rapide du temps de l’onde Ca2 + déclenchée par la plaie. Pour le microscope à fluorescence utilisé dans cette étude, les valeurs maximales du champ de vision et de la résolution temporelle sont respectivement de 3 cm x 3 cm et 30 images par seconde (fps).
  2. Retirez le couvercle et placez le plat sous la lentille de l’objectif.
  3. Vérifiez le signal de fluorescence de la plante, puis attendez environ 30 minutes dans l’obscurité jusqu’à ce que les plantes soient adaptées aux nouvelles conditions environnementales. Cette étape d’adaptation est nécessaire parce que les changements d’humidité provoquent une élévationdes cytaires [Ca2+ ] chez les plantes qui peuvent interférer avec tout événement lié à la plaie.
  4. Ajustez la mise au point et le grossissement pour voir la plante entière dans le champ de vision. Dans le protocole actuel, un grossissement de 0,63x a été utilisé.
  5. Avant de commencer l’imagerie en temps réel, configurez les paramètres d’acquisition pour détecter les signaux de fluorescence à l’aide d’un logiciel d’imagerie au microscope. Les paramètres d’imagerie dans le protocole actuel sont les suivants : exposition et intervalles réglés sur 1,8 s et 2 s (c.-à-d. 0,5 ips), respectivement. Réglez la durée d’enregistrement sur 11 min.
  6. Image pendant 5 min avant de commencer l’expérience pour acclimater la plante à l’irradiation de la lumière bleue du microscope, puis commencez l’enregistrement en cliquant sur Exécuter maintenant, ou la commande équivalente dans le logiciel de microscope utilisé. Pour déterminer la fluorescence de base moyenne, enregistrer au moins 10 images (c.-à-d. au moins 20 s dans le protocole actuel) avant de blesser ou d’appliquer du glutamate (voir la section 4).
    1. Pour l’imagerie en temps réel des changements decyte [Ca2+] etd’apo [Glu] induits par la plaie, coupez le pétiole ou la région médiane de la feuille L1 avec des ciseaux(figure 3 et figure 4).
    2. Pour l’imagerie en temps réel des changements decytocytes déclenchés par le glutamate [Ca2+],coupez le bord (environ 1 mm de la pointe) de la feuille 1 à travers la veine principale avec des ciseaux. Après une période de récupération d’au moins 20 minutes, appliquer 10 μL de glutamate de 100 mM sur la surface coupée de la feuille (figure 5).
      REMARQUE: Cette prédécoupe était nécessaire pour permettre au glutamate d’accéder à l’apoplaste foliaire afin de déclencher des réponses. De plus, l’application d’une goutte d’eau distillée sur la surface coupée de la feuille L1 s’est avérée essentielle pour empêcher les échantillons de se dessécher pendant la récupération avant l’application du glutamate.
  7. Après avoir terminé l’enregistrement de 11 minutes, enregistrez les données.

4. Analyse des données

  1. Pour l’analyse de l’intensité de la fluorescence au fil du temps, définissez une région d’intérêt (ROI) à l’endroit où l’intensité de la fluorescence doit être analysée(Figure 6 et Figure 7). Pour le calcul de la vitesse de l’onde Ca2+, définissez 2 ROIs (ROI1 et ROI2) pour l’analyse. Dans le logiciel d’imagerie, cliquez sur Mesure du temps | Définir | Cercle. Mesurez la distance entre ROI1 et ROI2 en cliquant sur Annotations et mesures | Longueur | Ligne simple (Figure 6).
  2. Mesurez les valeurs de fluorescence brutes (F) dans chaque roi au fil du temps en cliquant sur Mesurer. Exportez des données brutes vers un tableur pour convertir le signal de fluorescence en nombres à chaque point de temps en cliquant sur Tous vers Excel | Exporter.
  3. Déterminer la valeur de fluorescence de base, qui est définie comme F0, en calculant la moyenne de F sur les 10 premières trames (c’est-à-dire avant le traitement) dans les données enregistrées.
  4. Normaliser les données F (en calculant ΔF/F) en utilisant l’équation ΔF/F= (F−F0 )/F0 , où ΔF est le changement de fluorescence dépendant du temps.
  5. Pourl’analyse d’onde de vitesse d’onde Ca 2+, définissez un point de montée de signal significatif au-dessus des valeurs pré-stimulées comme représentant la détection d’une augmentation Ca2+ de chaque ROI (t1 et t2) en utilisant le critère d’une élévation à 2× l’écart type (2x SD) qui est calculé à partir des données F0 à l’aide d’un logiciel statistique. 95% des données F0 se situent à moins de 2x SD de la moyenne, ce qui indique qu’une augmentation du signal au-dessus de ce niveau par hasard est ≤5%. Calculez la différence de temps de l’augmentation ca2+ entre ROI1 et ROI2 [t2- t1 décalage temporel (Δt)] et mesurez la distance entre ROI1 et ROI2, puis déterminez les vitesses de toute onde Ca2+.

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Résultats

La propagation du signal de[Ca2+]cyt et [Glu]apo en réponse à la blessure est présentée à la figure 3, à la figure 4, au film S1et au film S2. La coupe du pétiole de la feuille 1 chez les plantes exprimant GCaMP3 (à 0 s) a conduit à une augmentation significative ducyte [Ca2+]qui a été rapidement induite localement par la vascularisation (à 4...

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Discussion

La signalisation systémique est importante pour que les plantes réagissent à des stimuli environnementaux externes localisés, puis maintiennent leur homéostasie à un niveau de plante entière. Bien qu’ils ne soient pas équipés d’un système nerveux avancé comme les animaux, ils emploient une communication rapideà la fois à l’intérieur et entre les organes en fonction de facteurs tels que les signaux électriques mobiles (et éventuellement hydrauliques) et les ondes de propagation de ROS etCa2+ 4...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Société japonaise pour la promotion de la science (17H05007 et 18H05491) à MT, à la National Science Foundation (IOS1557899 et MCB2016177) et à la National Aeronautics and Space Administration (NNX14AT25G et 80NSSC19K0126) à SG.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Arabidopsis exprimant GCaMP3Saitama University
Arabidopsis exprimant CHIB-iGluSnFRSaitama University
GraphPad Prism 7GraphPad Software
L-GlutamateFUJIFILM Wako072-00501Dissous dans un milieu de croissance liquide [sels MS 1/2x, saccharose 1 % (p/v) et 0,05 % (p/v) MES ; pH 5,1 ajusté avec 1N KOH].
Microsoft ExcelMicrosoft Corporation
Murashige and Skoog (MS) mediumFUJIFILM Wako392-00591composition : 1x sels MS, 1 % (p/v) de saccharose, 0,01 % (p/v) de myoinositol, 0,05 % (p/v) de MES et 0,5 % (p/v) de gomme gellane ; pH 5,7 ajusté avec 1N KOH.
Stéréomicroscope Nikon SMZ25Analyse AR Nikon
NIS-Elements
1x (P2-SHR PLAN APO)AppareilNikon
sCMOS (ORCA-Flash4.0 V2)Hamamatsu PhotonicsC11440-22CU
Boîte de Pétri carrée en plastiqueSimportD210-16
Objectif Nikon photo

Références

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