Cytométrie en flux et analyse d’imagerie confocale de la faible expression de Wnt dans les thymocytes rapporteurs d’Axin2-mTurquoise2

Résumé

Les niveaux de signalisation sont connus pour réguler le destin cellulaire, indiquant que la régulation de la signalisation Wnt constitue une cible thérapeutique intéressante. Ici, nous décrivons les méthodes d’analyse par cytométrie en flux et microscopie confocale pour un modèle murin robuste de rapporteur de signalisation Wnt canonique qui mesure des niveaux de signalisation Wnt distincts.

Résumé

La mesure des niveaux d’expression de Wnt est essentielle pour tenter d’identifier ou de tester de nouvelles cibles thérapeutiques Wnt. Des études antérieures ont montré que la signalisation canonique Wnt fonctionne via un mécanisme basé sur le dosage, d’où la nécessité d’étudier et de mesurer la signalisation Wnt dans divers types de cellules. Bien que plusieurs modèles rapporteurs aient été proposés pour représenter l’expression physiologique de Wnt, le contexte génétique ou la protéine rapporteure ont fortement influencé la validité, la précision et la flexibilité de ces outils. Cet article décrit les méthodes d’acquisition et d’analyse des données obtenues avec le modèle rapporteur Wnt de souris Axin2-mTurquoise2, qui contient un allèle Axin2^em1Fstl muté. Ce modèle facilite l’étude de la signalisation canonique endogène de Wnt dans des cellules individuelles sur une large gamme d’activité de Wnt.

Ce protocole décrit comment apprécier pleinement l’activité rapporteuse d’Axin2-mTurquoise2 en utilisant l’analyse de la population cellulaire du système hématopoïétique, combinée à des marqueurs de surface cellulaire ou à une coloration intracellulaire β-caténine . Ces procédures servent de base à la mise en œuvre et à la reproduction dans d’autres tissus ou cellules d’intérêt. En combinant le tri cellulaire activé par fluorescence et l’imagerie confocale, des niveaux d’expression canoniques distincts de Wnt peuvent être visualisés. Les stratégies de mesure et d’analyse recommandées fournissent des données quantitatives sur les niveaux d’expression fluorescente pour une évaluation précise de la signalisation canonique Wnt. Ces méthodes seront utiles pour les chercheurs qui souhaitent utiliser le modèle Axin2-mTurquise2 pour des motifs d’expression canoniques de Wnt.

Introduction

La signalisation canonique Wnt est une voie de signalisation conservée impliquée dans l’homéostasie des tissus sains ainsi que dans la maladie. Il a été démontré que la régulation précise des niveaux de signalisation Wnt est importante dans le développement embryonnaire, mais elle est également d’une grande importance dans les tissus adultes. Il a été constaté que la signalisation canonique Wnt joue un rôle important dans la régénération tissulaire de plusieurs organes tels que l’intestin, la peau et le système hématopoïétique. Par conséquent, lorsque la signalisation Wnt est dérégulée, des pathologies graves apparaissent. Le cancer colorectal, du foie et de la peau, les maladies neurologiques, ainsi que certaines hémopathies malignes sont des pathologies exemplaires dans lesquelles la signalisation Wnt dérégulée est le facteur causal ou le contributeur¹. Par conséquent, plusieurs inhibiteurs de différentes cibles de Wnt sont actuellement testés dans des essais cliniques en tant que thérapies anticancéreuses associées à Wnt².

De plus, des progrès intéressants ont lieu dans le potentiel thérapeutique de Wnt pour la récupération neurologique, les troubles neurologiques liés à l’âge et les troubles du spectre autistique congénitaux ^3,4,5. Des signaux Wnt ont été explorés pour l’expansion ex vivo des cellules souches en vue d’une transplantation ultérieure⁶. Cependant, le ciblage thérapeutique de la signalisation canonique Wnt est une entreprise difficile en raison de son importance dans de nombreuses fonctions cellulaires de base et de la diaphonie avec d’autres voies ^7,8,9, d’où la nécessité de mesurer avec précision les effets de ces agents thérapeutiques Wnt dans un modèle facile à interpréter. La signalisation canonique Wnt est pilotée par des ligands Wnt solubles à courte portée, qui sont sécrétés par les cellules voisines ou sous forme d’excrétion autocrine comme rapporté dans divers types de cellules souches sensibles à Wnt.

Les corécepteurs Wnt Frizzled receptor et lipoprotein receptor-related protein (LRP) sont réactifs à ces ligands, ce qui déclenche une cascade de signalisation intracellulaire. Lorsque la signalisation Wnt est désactivée, un complexe de destruction composé d’un inhibiteur d’axe (Axin), d’un produit du gène suppresseur de tumeur, d’une polypose adénomateuse colique (APC), d’une caséine kinase1 (CK1α) et d’une glycogène synthase kinase (GSK-3β), empêche l’accumulation de β-caténine (CTNNB1) par dégradation protéasomale. Lors de la liaison ligand-récepteur Wnt, le complexe de destruction est inactivé, conduisant à l’accumulation et à la stabilisation de la β-caténine dans le cytoplasme. La β-caténine active peut migrer vers le noyau où elle se lie aux facteurs de transcription TCF/LEF (Transcription Factor/Lymphoid Enhancer-binding Factor) pour initier la transcription des gènes cibles Wnt. Axin2 est considéré comme un gène cible car il est une cible directe de la voie Wnt¹⁰. De plus, Axin2 sert de régulateur négatif ainsi que de gène rapporteur pour la signalisation canonique active Wnt^11,12.

Plusieurs rapporteurs canoniques de signalisation Wnt ont été décrits dans la littérature et ont été d’une grande utilité pour comprendre le rôle de la signalisation Wnt dans le développement embryonnaire. La plupart de ces rapporteurs utilisent des sites de liaison TCF/LEF insérés synthétiquement, qui n’utilisent pas un gène cible endogène 13,14,15,16,17,18,19. De plus, des stratégies d’inactivation d’Axin2 ont été utilisées qui respectent l’emplacement naturel du gène 11,20,21,22,23, dont Axin2-LacZ est généralement accepté comme le rapporteur canonique Wnt le plus robuste ¹¹. Cependant, la protéine rapporteure LacZ, bien que facile à utiliser dans la plupart des tissus, nécessite un substrat de β-galactosidase, qui est reconnu comme étant agressif pour les cellules^{vivantes 24}. En particulier pour les cellules souches et les thymocytes, les conditions difficiles de détection du LacZ augmentent la mort cellulaire (données non rapportées) lors de la manipulation de suspensions cellulaires.

Bien que l’amplification du signal provoquée par la coloration LacZ soit pratique pour détecter les signaux faibles, elle rend la quantification moins directe et donc sans doute moins fiable. Par conséquent, un modèle rapporteur murin a été conçu pour imiter la stratégie génétique Axin2-LacZ , mais avec une protéine rapporteure mTurquoise2²¹, afin de fournir une lecture plus directe et plus proche des niveaux d’expression physiologique. La protéine fluorescente mTurquoise2 est un excellent substitut à LacZ en raison de sa luminosité élevée (rendement quantique (QY) = 0,93), de sa flexibilité en combinaison avec d’autres protéines fluorescentes pour une caractérisation poussée de la surface cellulaire et de son absence de substrat exogène. De plus, sa relation génétique étroite avec la protéine fluorescente verte (GFP) offre la possibilité d’utiliser la plupart des anticorps fluorescents reconnaissant la GFP pour une détection de signal plus forte, si nécessaire, dans des cellules extrêmement sensibles à Wnt²⁵.

Le modèle Axin2-mTurquoise2 n’est pas seulement un rapporteur canonique Wnt, mais offre également la possibilité d’étudier les phénotypes hétérozygotes et homozygotes d’Axin2 (Axin2 knock-out). L’insertion ciblée de mTurquoise2 au site de départ d’Axin2 entraîne une perturbation de la protéine²¹ d’Axin2. Comme Axin2, également connu sous le nom de conductine, fait partie du complexe de destruction Wnt, et que le complexe de destruction régule étroitement la transcription médiée par la β-caténine, son absence partielle ou totale pourrait être intéressante pour étudier diverses pathologies. Par exemple, dans le cancer colorectal, les niveaux d’Axin2 sont relativement élevés en raison de l’hyperactivation de Wnt¹¹ ; Cependant, son rôle dans d’autres pathologies est encore largement méconnu. Même si Axin2 est considéré comme jouant un rôle limité dans la dégradation de la β-caténine, son rôle dans la régulation de Wnt peut être renforcé par l’ajout d’un petit peptide, qui bloque la croissance du cancer colorectal médié par Wnt²⁶.

Dans l’ensemble, une régulation prudente de Wnt via des cibles thérapeutiques Wnt peut ouvrir des opportunités pour modifier l’apparition ou le développement de pathologies graves et devrait être étudiée plus avant dans des modèles ayant une capacité de rapporteur. Dans ce rapport, nous expliquons notre méthode d’analyse des meilleures pratiques du modèle murin Axin2-mTurquoise2 pour la cytométrie en flux et l’imagerie confocale. Dans le contexte des niveaux de dosage de Wnt, les niveaux de signalisation canoniques Wnt très faibles sont difficiles à détecter, pour lesquels des capacités de détection et d’analyse avancées offrent un avantage pour tirer pleinement parti des avantages de ce modèle. Les thymocytes sont utilisés comme système modèle en raison de leur viabilité cellulaire fragile, de leur faible expression de signalisation canonique Wnt et de leur zone cytoplasmique condensée pour représenter la sensibilité de détection du modèle Axin2-mTurquoise2. De plus, une procédure histologique de coloration à la β-caténine totale pour les suspensions de cellules thymocytaires est expliquée pour mesurer les niveaux de β-caténine cytoplasmique et vérifier la signalisation canonique nucléaire active Wnt en combinaison avec le rapporteur.

Protocole

REMARQUE : Toutes les procédures sur les souris ont été effectuées avec l’approbation du comité d’éthique du centre médical de l’Université de Leiden (LUMC) sur l’expérimentation animale. Mâle et femelle, âgés de 6 à 12 semaines, de type sauvage (wt), qui n’ont pas d’insertion de la construction rapporteure Axin2-mTurquoise2, hétérozygotes (Tg/0) avec une insertion de la construction rapporteuse Axin2-murquoise2 et donc, un gène Axin2 perturbé, et homozygotes (Tg/Tg) avec l’insertion de la construction rapporteure Axin2-mTurquoise2 dans les deux allèles et donc, deux gènes Axin2 perturbés ; Axin2-mTurquoise2 souris (B6 ; souris CBA-Axin2^em1Fstl/J) ont été utilisées dans les expériences. Les animaux ont été sacrifiés par euthanasie au CO₂ avant l’isolement des organes. Tout au long de la procédure, réduire au minimum l’exposition des échantillons à la lumière et les maintenir sur de la glace ou à 4 °C en tout temps, sauf indication contraire. Recouvrez les échantillons de papier d’aluminium. Toutes les étapes doivent être effectuées dans un laboratoire standard doté d’une enceinte de biosécurité.

1. Préparation de la suspension de cellules thymocytaires

1. Récoltez le thymus des souris avec soin, sans contamination sanguine, en ouvrant l’abdomen des souris et en extrayant le thymus à l’aide d’une pince. Stocker/transporter temporairement dans le milieu Dulbecco’s modifié (IMDM) d’Iscove contenant 2,5 % de sérum de veau fœtal (SCF).
   REMARQUE : Pour éviter les déversements de sang et d’éventuels dommages au thymus, ne sacrifiez pas les souris par luxation cervicale.
2. Préparez un tube de 50 mL avec une crépine à cellules de 70 μm et mouillez le filtre avec 1 mL de milieu IMDM/FCS froid.
3. Écrasez l’organe avec l’embout arrière d’un piston de seringue de 1 mL tout en lavant deux fois avec un milieu IMDM/FCS à froid (figure 1A). Si vous le souhaitez, ajoutez une concentration finale de 50 U/mL d’ADN I au milieu IMDM/FCS à 2,5 % pour éviter l’agglutination des cellules mortes. Rincez le filtre 2 fois avec un fluide IMDM/2,5 % FCS froid et remettez-le en suspension doucement dans le tube de 50 ml.
   REMARQUE : Ne dépassez pas un volume final total de 10 ml. Gardez les cellules sur la glace et dans l’obscurité pour les étapes subséquentes et lorsqu’elles ne sont pas manipulées.
4. Centrifuger à 330 × g pendant 5 min à 4 °C et aspirer doucement le surnageant de la pastille cellulaire. Remettez doucement la pastille en suspension dans un milieu IMDM/FCS incomplet à froid et à 2,5 %, et préparez-vous pour le comptage des cellules.
   REMARQUE : Si nécessaire, congelez et stockez les thymocytes dans de l’azote liquide dans du diméthylsulfoxyde à 10 % de FCS pour une expérimentation ultérieure. Une congélation et une décongélation appropriées des cellules réduiront la mort cellulaire excessive. En moyenne, la moitié des thymocytes peuvent être apoptotiques après décongélation en raison de la sélection naturelle des lymphocytes T dans le thymus, qui doit être prise en compte pour décider du nombre de thymocytes à congeler par cryo-flacon. Pas moins de 2,5 × 10⁶ thymocytes doivent être congelés par flacon.

2. Préparation de la cytométrie en flux des thymocytes

1. Préparez les thymocytes pour la procédure de coloration de la surface cellulaire en préparant 2,5 × 10^{à 6} thymocytes par échantillon de coloration dans une solution saline tamponnée au phosphate glacée (PBS, pH 7,4) (Figure 1B). Comptez le nombre de cellules vivantes après décongélation, si les thymocytes ont été préalablement congelés. Si nécessaire, ajoutez une concentration finale de 50 U/mL d’ADN I pour éviter l’agglutination des cellules mortes.
2. Utilisez les panels de coloration des anticorps pour la caractérisation de la surface cellulaire d’un sous-ensemble complet de thymocytes.
   REMARQUE : D’autres combinaisons de fluorochromes peuvent être sélectionnées. Sélectionnez des marqueurs de population rares pour des fluorochromes fluorescents brillants et, si possible, ajoutez un marqueur de mort-vivant. Ni les fluorochromes V450 ni V500 ne doivent être utilisés en combinaison avec le rapporteur fluorescent mTurquoise2 en raison du chevauchement spectral. Vérifiez toujours les spectres de fluorescence de mTurquoise2 en combinaison avec des fluorochromes bleus et verts (figure supplémentaire 1A).
   1. Mélangez les anticorps dans les rapports précédemment définis des panels négatifs à la lignée (Lin-) séparément dans un tampon PBS/0,2 % d’albumine sérique bovine (BSA)/0,1 % de NaN₃ (azoture de sodium).
      REMARQUE : Toutes les cellules indésirables (non-thymocytes présents dans le thymus) sont colorées en 2 étapes avec un anticorps secondaire contre la streptavidine (dans cet exemple, phycoérythrine (Pe)-Cy7 et allophycocyanine (APC)-Cy7) et peuvent être exclues en utilisant une « porte de vidange » dans l’analyse par cytométrie en flux.
   2. Mélangez les anticorps dans les rapports précédemment définis du panel de coloration Double Négatif (DN) avec l’anticorps secondaire de streptavidine Pe-Cy7 dans un tampon PBS/0,2 % BSA/0,1 % NaN₃ . Exclure le panneau Lin- de ce mélange (Tableau 1).
   3. Mélangez les anticorps dans des rapports préalablement définis de panel de coloration Immature Simple Positif (ISP), Double Positif (DP) et Seul Positif (SP) avec l’anticorps secondaire streptavidine APC-Cy7 dans un tampon PBS/0,2 % BSA/0,1 % NaN₃ . Exclure le panneau Lin- de ce mélange (Tableau 1).
   4. Tout d’abord, colorez les thymocytes avec les populations indésirables de cellules non T en utilisant les mélanges d’anticorps primaires à la biotine des panneaux Lin- pendant 30 minutes sur de la glace dans l’obscurité.
      REMARQUE : Chaque panneau Lin- est un ensemble différent de cellules et ne doit donc pas être coloré ensemble dans un seul échantillon.
   5. Essorer à 300 × g, 4 °C pendant 5 min et retirer le surnageant. Lavez les thymocytes avec 150 μL de tampon PBS/0,2 % BSA/0,1 % NaN₃ glacé, et essorez-les à 300 × g, 4 °C pendant 5 min.
   6. Teindre avec le panneau DN et le panneau ISP/DP/SP du lin-staining correspondant pendant 30 min sur de la glace dans l’obscurité. Essorer à 300 × g, 4 °C pendant 5 min, et retirer le surnageant. Lavez les thymocytes avec 150 μL de tampon PBS/0,2 % BSA/0,1 % NaN₃ glacé, et essorez-les à 300 × g, 4 °C pendant 5 min.
3. Préparez les cellules pour la mesure par cytométrie en flux en les homogénéisant à l’aide d’un tube de crépine cellulaire de 35 μm et en prélevant les cellules dans un tampon PBS/0,2 % BSA/0,1 % NaN₃ . Protégez les cellules de la lumière et conservez-les sur la glace jusqu’à la mesure du cytomètre en flux.
   REMARQUE : Le NaN₃ (azoture de sodium) est hautement toxique et mortel. Des précautions particulières doivent être prises lors du travail avec cette substance. Lavez-vous soigneusement les mains après la manipulation et appelez immédiatement un centre antipoison ou un médecin/médecin en cas d’ingestion de NaN₃ .

3. Mesure du cytomètre en flux

REMARQUE : Les utilisateurs inexpérimentés doivent d’abord suivre une formation sur le cytomètre de flux, car la mesure du signal mTurquoise2 en combinaison avec plusieurs autres fluorochromes nécessite de l’expérience et une planification bien informée de l’expérience. Voir la table des matériaux pour plus d’informations sur le cytomètre en flux.

1. Démarrez le cytomètre en flux conformément au manuel d’utilisation ou à tout autre protocole établi. Vérifiez et, si nécessaire, ajustez les ensembles de filtres passe-bande dans le cytomètre en flux pour une stratégie de détection de fluorescence optimale.
   REMARQUE : Un filtre recommandé pour mTurquoise2 est de 470/20 nm sur la ligne laser ultraviolette 405 nm, 407 nm ou la ligne laser moins courante de 440 nm.
2. Étalonnez le cytomètre en flux en établissant des paramètres de compensation à l’aide de billes de compensation disponibles dans le commerce et de cellules 293T transfectées de manière stable et exprimant mTurquoise2.
   REMARQUE : Des thymocytes wt monocolorés peuvent être utilisés à la place des billes de compensation. Dans ce cas, la compensation avec des billes était tout aussi efficace et plus pratique que l’utilisation de cellules.
   1. Étiquetez les billes avec chaque fluorochrome utilisé dans l’expérience et incluez les billes non colorées. Mesurez les billes pour mettre en place un panneau de réglage de compensation, et mesurez les cellules 293T exprimant mTurquoise2 car il n’y a pas de fluorochrome correspondant pour mTurquoise2, qui peut être utilisé sur les billes. Enregistrez les paramètres de compensation pour les utiliser dans l’expérience réelle.
      REMARQUE : Les cellules exprimant mTurquoise2 utilisées pour le réglage de compensation doivent être aussi brillantes ou plus brillantes que les thymocytes exprimant mTurquoise2 de l’expérience réelle. Assurez-vous qu’il y a également des cellules 293T mTurquoise2-négatives présentes.
   2. Pour l’expérience, incluez des thymocytes colorés en Tg/Tg en fluorescence moins un (FMO), y compris un échantillon wt pour le FMO mTurquoise2 et un échantillon non coloré de thymocytes de chaque génotype de souris comme contrôles positifs pour la partie analyse.
      REMARQUE : Ces commandes sont importantes pour régler correctement les portes des cellules positives. Le reste des échantillons expérimentaux est coloré avec le panel de coloration complet (tableau 1).
      1. Créez une expérience, ajoutez et nommez le nombre de tubes dans le logiciel de cytomètre en flux, et créez des nuages de points pour visualiser les cellules colorées pour l’ensemble complet des fluorochromes.
      2. Appliquez les paramètres de compensation précédemment établis à l’expérience. Ajustez la diffusion directe (FSC) et la diffusion latérale (SSC) avec des thymocytes wt non colorés jusqu’à ce que la population complète de cellules soit visible dans le nuage de points. Mesurez d’abord les thymocytes non colorés exprimant Tg/Tg mTurquoise2 pour vous assurer que la population positive est visible.
      3. Mesurez un échantillon de thymocytes entièrement coloré et vérifiez toutes les combinaisons de fluorochromes. Si nécessaire, ajustez les valeurs de compensation précédemment établies pour les fluorochromes qui affichent une compensation incorrecte. Mesurez le reste des échantillons expérimentaux et n’ajustez aucun réglage pendant la mesure des échantillons.
         REMARQUE : L’ajustement ultérieur de la compensation peut également être effectué dans le progiciel d’analyse. Bien que le nombre de cellules disponibles puisse être un facteur limitant, il est conseillé d’effectuer cette étape lors de la mesure. Gardez les paramètres égaux entre tous les échantillons pour la comparaison des valeurs d’intensité mTurquoise2.

4. Analyse cytométrique en flux

REMARQUE : L’analyse cytométrique en flux a été effectuée à l’aide d’un logiciel spécifique mentionné dans la table des matériaux ; Cependant, d’autres programmes d’analyse par cytométrie en flux sont également disponibles.

1. Gate des cellules vivantes et des sous-ensembles de thymocytes en fonction des valeurs FSC et SSC.
2. Vérifiez les paramètres de compensation dans la boîte de dialogue de la matrice de compensation située à gauche de l’échantillon pour vous assurer qu’il n’y a pas d’interférence fluorochrome et que la compensation appropriée a été effectuée pour éviter les débordements ou les fuites.
   1. Si la matrice définie par l’acquisition doit être ajustée, modifiez les valeurs de la matrice de compensation en augmentant ou en diminuant simplement la valeur de compensation de chaque combinaison de fluorochromes de sorte que la population ne montre pas une ligne horizontale ou verticale presque parfaite (figure supplémentaire 1B).
3. Pour répartir visuellement l’intensité du mTurquoise2 afin d’obtenir un bon contrôle positif, définissez l’affichage de l’axe X du mTurquoise2 sur linéaire (Figure supplémentaire 2).
   1. Utilisez la commande FMO mTurquoise2 comme commande négative pour le déclenchement du signal positif mTurquoise2. Révisez le seuil de contrôle correct par population de cellules (Figure 2).
      REMARQUE : Les cellules de contrôle (wt) mTurquoise2 FMO n’ont pas le marqueur mTurquoise2 et peuvent donc être utilisées comme seuil de fond pour l’activité du rapporteur Axin2.
4. Gate les cellules mTurquoise2-positives avec le canal de détection approprié pour définir combien de cellules sont Wnt-positives.
5. Calculez la moyenne géométrique et la médiane pour définir la quantité d’intensité fluorescente dans les cellules d’intérêt.
   1. Cliquez sur Statistiques | Ajoutez des statistiques dans le panneau montrant les cellules mTurquoise2-positives.
   2. Définissez la méthode statistique, la population d’intérêt et le canal de détection de mTurquoise2, puis cliquez sur Ajouter. Représenter la moyenne géométrique et l’intensité médiane de la fluorescence en unités arbitraires (AU) pour tracer des graphiques.
      REMARQUE : La médiane représente la valeur médiane de l’intensité fluorescente et, par conséquent, fournit des informations sur le déplacement de la population de l’intensité fluorescente. Si nécessaire, une correction de l’arrière-plan peut aider à obtenir une visualisation plus claire de la plage dynamique de l’activité du rapporteur mTurquoise2. Cela peut être fait en soustrayant les fréquences de coloration de fond wt de la fréquence totale des cellules mTurquoise2-positives du type de cellule spécifique qui est bloqué.

5. Préparation de cytospins thymocytaires pour l’imagerie confocale

REMARQUE : Les cytospins thymocytaires sont recommandés lorsque vous travaillez avec des suspensions cellulaires de cellules non adhérentes. Comme l’expression d’Axin2-mTurquoise2 dans les thymocytes est plus faible que dans les cellules épithéliales du thymus, des suspensions de cellules thymocytaires filtrées ont été utilisées pour l’imagerie.

1. Commencez par une suspension cellulaire de thymocytes fraîchement récoltés ou congelés. Mettre en suspension ~20 000 thymocytes dans 100 μL de PBS froid/0,5 % BSA/10 % FCS par génotype de thymocyte.
   REMARQUE : Si nécessaire, décongelez doucement les cellules pour préserver une viabilité cellulaire maximale lorsque vous travaillez avec des thymocytes préalablement congelés. Cela permettra de réduire l’autofluorescence lors de l’imagerie des cellules. Vérifier la viabilité cellulaire pour s’assurer de la qualité de l’échantillon. La procédure de cytospin utilise une force mécanique qui a été adaptée à la fragilité du thymocyte ; Néanmoins, il faut une population de départ très viable. Pour assurer une plus grande viabilité, il est conseillé de commencer avec des thymocytes fraîchement récoltés plutôt que congelés.
2. Prémouiller la zone autour de l’ouverture des cartes de filtre avec du PBS. Assemblez le support de la chambre d’échantillonnage du cytospin conformément au manuel (Figure 1C).
   1. Placez la carte filtrante sur la lame de givre (côté lisse contre la lame de verre). Placez les deux articles sur le support de la chambre d’échantillonnage. Prenez soin de placer la carte de filtre exactement sur le trou du support de la chambre d’échantillonnage et placez le support complet de la chambre d’échantillonnage dans le rotor.
3. Remettez soigneusement les thymocytes en suspension et ajoutez 100 μL de suspension cellulaire dans les chambres d’échantillonnage. Faites tourner la suspension de thymocytes pendant 4 minutes à ~350 × g sur les lames de givre. Retirez délicatement la carte filtrante de la lame de givre sans toucher les cellules. Faites sécher les cytospins à l’air libre pendant une période allant de 1 h à une nuit à température ambiante.
   REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec d’autres types de cellules, testez différentes densités de cellules pour des résultats optimaux. Les cytospins peuvent être congelés à -20 °C dans une boîte scellée pour une expérimentation ultérieure. Décongeler les cytospins pour une manipulation ultérieure pendant 1 h à température ambiante.

6. Immunomarquage par cytospin avec β-caténine totale

1. Fixez les cytospins pendant 15 min à température ambiante dans du méthanol à 100 %. Faites sécher les lames à l’air libre pendant 10 min à température ambiante. Dessinez un cercle autour de la population de thymocytes sur la lame de verre avec un stylo hydrophobe.
   REMARQUE : Cette étape de fixation est optimisée spécifiquement pour la coloration à la β-caténine.
2. Placez les lames dans du PBS/0,05 % Tween-20 pendant 10 minutes à température ambiante, puis transférez-les dans une boîte sombre et humide pendant les étapes de blocage et d’incubation. Ajouter 100 μL de PBS/10 % de sérum de souris normal (NMS) par lame et laisser dans la boîte humide pendant 10 minutes à température ambiante. Tapotez la lame pour retirer le NMS de 10 %, ajoutez 100 μL de PBS/sérum de chèvre normal (NGS) à 10 % par lame et laissez dans la boîte humide pendant 30 min à température ambiante.
   REMARQUE : L’incubation avec PBS/10 % de NMS bloque la liaison d’anticorps primaires non spécifiques (figure 1D), tandis que PBS/10 % de NGS bloque la liaison d’anticorps secondaires non spécifiques.
3. Préparez des anticorps supplémentaires pour la coloration cellulaire. Mélangez 0,5 μg de l’anticorps total β-caténine avec les fragments marqués AF568.
   REMARQUE : Dans ce contexte, un kit d’étiquetage disponible dans le commerce a été utilisé pour le pré-marquage de la β-caténine totale anti-souris primaire avec des fragments IgG1 Fab anti-souris secondaires de chèvre avec un marquage fluorochrome Alexa Fluor 568 (AF568) avant de l’ajouter aux thymocytes. Effectuez l’étiquetage selon le protocole du fabricant car plusieurs concentrations peuvent devoir être testées. Utilisez l’anticorps total marqué à la β-caténine AF568 dans les 30 minutes.
4. Ajouter 50 μL (0,5 μg) de l’anticorps total marqué à la β-caténine-AF568 par lame de cytospin pendant une nuit à 4 °C dans une boîte humide. Inclure un contrôle de coloration négative selon le protocole du fabricant ou un contrôle isotype dans le cas d’un protocole de marquage direct.
5. Laver pendant 20 min avec PBS/0,05 % Tween-20 à température ambiante. Ensuite, laver pendant 20 min avec du PBS à température ambiante dans un bocal en remuant. Effectuer une deuxième étape de fixation pour assurer la liaison de l’anticorps à l’antigène : 10 min à température ambiante avec 100 μL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans du PBS dans une boîte humide.
   REMARQUE : Gardez les diapositives dans l’obscurité. Ni la fixation du méthanol ni celle du PFA n’affecteront significativement l’expression de mTurquoise2²⁷.
6. Trempez les diapositives dans PBS. Effectuer une coloration nucléaire avec 50 μL de TO-PRO-3 (1:1500) pendant 10 min à température ambiante dans la boîte humide. Lavez les lames pendant 20 min avec du PBS à température ambiante dans un bocal en remuant.
   REMARQUE : La concentration de TO-PRO3 peut être titrée en fonction de l’utilisation d’autres fluorochromes avec des spectres fluorescents à proximité.
7. Enrobez les échantillons d’un réactif anti-décoloration conformément au protocole du fabricant et recouvrez d’une lamelle. Sécher à l’air libre pendant 24 h à température ambiante. Visualisez les lames directement sous un microscope fluorescent ou confocal, ou stockez-les à -20 °C pour une imagerie ultérieure.

7. Mesure microscopique confocale

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux pour plus d’informations sur le microscope confocal.

1. Allumez le microscope confocal conformément au manuel ou au protocole établi. Utilisez des commandes de lignées cellulaires mTurquoise2 293T transfectées de manière stable négative et positive pour l’ajustement primaire des paramètres confocaux. Par la suite, utilisez les thymocytes wt Axin2-mTurquoise2 et Tg/Tg (knock-out) Axin2-mTurquoise2 comme témoins négatifs et positifs, respectivement, pour éviter une sous-exposition du signal mTurquoise2.
2. Préparez le logiciel pour le balayage séquentiel en programmant les lasers et les largeurs de filtre. Commencez par la ligne laser de longueur d’onde la plus élevée et progressez vers la longueur d’onde la plus basse. Lorsque toutes les étapes de balayage séquentiel sont installées, chargez l’échantillon sur la platine du microscope, faites la mise au point de l’échantillon et appuyez sur Live pour optimiser la puissance du laser et le Smart Gain à l’aide des boutons respectifs du logiciel confocal ou du panneau manuel en option.
   REMARQUE : La section de l’échantillon de la lame ne doit pas être imagée pour la quantification du signal, car un photoblanchiment potentiel pourrait se produire. Cependant, mTurquoise2 a une photostabilité élevée²⁵.
3. En cas d’expression très faible de mTurquoise2, augmentez la puissance du laser et le Smart Gain jusqu’à ce qu’un signal fluorescent soit observé, et vérifiez avec l’échantillon de contrôle négatif pour vous assurer d’un signal vraiment positif. Visualisez les thymocytes avec une lentille à l’huile 40x 1,4, une lentille à l’huile 63x 1,4 ou une lentille à l’huile 100x 1,4.
   REMARQUE : Un microscope Leica SP5 a été utilisé pour cette étude.
4. Utilisez ces paramètres d’imagerie confocale sur le microscope avant de mesurer l’échantillon.
   1. Ajustez la plage de valeurs d’intensité à une image 12 bits en cliquant sur Configuration | Paramètres | passer à 12 bits dans l’option Profondeur de bits pour créer une échelle d’intensité plus large et donc, plus de distinction entre les signaux fluorescents faibles et élevés.
   2. Ajustez la résolution d’imagerie en cliquant sur XY, et augmentez le format à 1024 x 1024, ce qui doublera également le temps de numérisation. Ajustez la vitesse de balayage à 400-600 Hz en cliquant sur Vitesse | Plus pour modifier manuellement les paramètres. De plus, activez l’option de balayage bidirectionnel .
   3. Ajustez le curseur de sensibilité pour réduire le signal d’arrière-plan. Optimisez la puissance laser et le Smart Gain corrects avec l’option Quick LUT (Look-Up Table).
      REMARQUE : Dans l’image 12 bits, le curseur a une valeur d’intensité de l’échelle de gris de 0 à 4095. Cela peut également être fait par la suite avec le logiciel gratuit hors ligne Las X. La couleur verte montrera le fond noir et la couleur bleue montre les pixels saturés de l’échantillon.
5. Lorsque tous les paramètres d’imagerie sont optimisés, mesurez l’échantillon en cliquant sur Démarrer, ce qui lancera l’imagerie séquentielle des trois canaux.
   1. Mesurez le signal fluorescent nucléaire TO-PRO-3. Détectez TO-PRO-3 avec le laser 633 nm et HyD 640-750 nm.
      REMARQUE : Dans cette configuration, 6 % de puissance laser a été utilisé à 15 % de gain intelligent. Ce réglage peut changer en fonction de l’intensité de la coloration TO-PRO-3. S’il est très brillant, il pourrait influencer les fluorochromes de faible intensité lorsqu’il est surexcité. Dans ce cas, réduisez la concentration de coloration.
   2. Mesurer les signaux de fluorescence nucléaire et cytoplasmique de la β-caténine. Détectez la β-caténine avec le laser 561 nm et HyD 580-605 nm. Accumulez jusqu’à 2 numérisations pour une image en ajustant le réglage dans la case XY du logiciel avec une moyenne de ligne 2 dans le cas d’un signal AF568 faible.
      REMARQUE : Dans cette configuration, 85 % de puissance laser a été utilisé à 87 % de gain intelligent.
   3. Mesurez le signal fluorescent cytoplasmique mTurquoise2. Détectez mTurquoise2 avec le laser de 458 nm et HyD 490-600 nm. Cumulez jusqu’à 4 numérisations pour une image en ajustant le paramètre dans la case XY du logiciel avec une moyenne de ligne 4 dans le cas d’un signal mTurquoise2 faible.
      REMARQUE : En raison des anciens lasers sur le microscope confocal utilisé pour ce protocole et du faible signal mTurquoise2, 405 nm a été utilisé à 90 % de puissance laser, ainsi que les lasers 458 nm et 476 nm à 100 % de puissance laser avec HyD 490-550 nm à 100 % de gain intelligent. Un laser de 440 nm est le plus optimal, bien qu’il soit moins souvent présent sur un microscope confocal. Une puissance laser élevée doit être manipulée avec précaution et réalisée uniquement avec une imagerie séquentielle. Assurez-vous que les paramètres d’urgence sont en place pour éviter une surexposition du détecteur. La puissance laser d’autres microscopes confocaux pourrait être inférieure à celle proposée dans ce protocole en raison de lasers plus puissants ou plus récents. Un test de blanchiment pourrait être effectué pour s’assurer qu’aucun signal fluorescent n’est perdu avant l’imagerie. Dans la configuration proposée, le photoblanchiment de mTurquoise2 était acceptable.
   4. Effectuez une imagerie en fond clair pour une visualisation totale des cellules. Détectez les thymocytes avec le laser 488 nm et le PMT Scan-DIC. Exportez les fichiers Lif pour l’analyse d’image.
      REMARQUE : Dans cette configuration, une puissance laser de 59 % a été utilisée avec un gain de 212 V et un décalage de données de -4,3 %. Les fichiers Lif peuvent être lus dans le logiciel LAS x hors ligne pour la correction d’image.

8. Analyse par microscopie confocale

1. Analysez les images à l’aide d’un logiciel de traitement d’images²⁸ (figure supplémentaire 3). Chargez les images dans le logiciel.
   REMARQUE : Plusieurs formats sont acceptés, mais il est recommandé d’utiliser des fichiers TIFF avec LUT ou d’importer directement des fichiers Lif dans le logiciel de traitement d’images.
2. Mesurez le signal actif de la β-caténine dans les noyaux des thymocytes.
   1. Sélectionnez les noyaux des thymocytes colorés à TO-PRO-3 dans l’image de la valeur en gris rouge pour l’analyse de la β-caténine active. Faites-le manuellement ou utilisez la sélection automatique des cellules dans le logiciel.
      REMARQUE : La sélection automatique des cellules peut nécessiter un traitement d’image pour un seuillage et une analyse des particules appropriés. La sélection manuelle des cellules peut être laborieuse, mais ne nécessite généralement aucun traitement d’image et est recommandée dans ce protocole.
   2. Activez la sélection manuelle à l’aide de l’un des outils de sélection de la barre de travail.
      1. Sélectionnez le contour du noyau et ajoutez-le au gestionnaire de régions d’intérêt (ROI). Activez le gestionnaire de ROI en cliquant sur Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement, et lorsqu’une nouvelle fenêtre de gestionnaire de retour sur investissement s’ouvre, cliquez sur la première option Ajouter (t) ou utilisez le raccourci clavier t. Répétez l’étape précédente jusqu’à ce que tous les noyaux soient définis et ajoutés au gestionnaire de retour sur investissement. Utilisez l’option Afficher tout dans le gestionnaire de retour sur investissement pour visualiser les cellules sélectionnées.
   3. Sélectionnez >3 zones d’arrière-plan où aucune cellule n’est présente et ajoutez-les au gestionnaire de retour sur investissement.
      REMARQUE : La taille et la forme n’ont pas d’importance dans ce cas. Ces régions serviront de mesures du bruit de fond pour le calcul final.
      1. Définissez la mesure sur l’image en cliquant sur Analyser | Définir les mesures. Dans la nouvelle fenêtre qui s’ouvre avec différentes options de mesure, activez Surface, Densité intégrée et Valeur de gris moyen | cliquez sur OK.
      2. Activez l’image de la valeur grise β-caténine en cliquant dessus, et visualisez les noyaux sélectionnés et les zones d’arrière-plan en cliquant sur Afficher tout dans le gestionnaire de ROI. Observez toutes les zones sélectionnées qui sont maintenant visibles dans l’image β-caténine.
      3. Cliquez sur Mesurer dans le Gestionnaire de ROI ou cliquez sur Analyser | Mesurer. Observez la nouvelle fenêtre Résultats qui s’ouvre, montrant les résultats du signal β-caténine dans les ROI.
      4. Transférez les résultats dans un tableur en cliquant sur Modifier | Tout sélectionner ; et copiez/collez la liste dans la feuille de calcul pour un calcul plus approfondi. Enregistrez le gestionnaire de retour sur investissement pour référence ultérieure sans avoir à répéter la sélection des noyaux en cliquant sur Plus | Sauvegarder....
   4. Pour la sélection automatique des cellules, faites des doublons (clavier Ctrl D) de l’image à traiter car de nombreux paramètres de traitement d’image ne peuvent pas être annulés.
      REMARQUE : Le marquage nucléaire automatisé nécessite un traitement d’image, dans la plupart des cas, pour définir les noyaux automatiquement et avec précision. Le traitement de l’image ne doit être effectué qu’à des fins de sélection de zone. Les images traitées ne sont pas utiles pour la mesure de l’intensité fluorescente car les valeurs des pixels sont modifiées.
      1. Effectuez un filtre gaussien en cliquant sur Traiter | Filtres | Flou gaussien pour lisser l’image. Testez plusieurs valeurs Sigma (Radius) et activez l’option Aperçu pour visualiser l’effet avant de cliquer sur OK.
      2. Inversez l’image en cliquant sur Modifier | Inverser. Vérifiez la luminosité et le contraste en cliquant sur Image | Ajuster | Luminosité/Contraste. Utilisez l’option Auto ou, de préférence, modifiez manuellement les valeurs.
         REMARQUE : N’appliquez pas les modifications car cela modifierait les propriétés de l’image. Il suffit de fermer la fenêtre B&C lorsque l’image souhaitée a été obtenue.
      3. Créez un seuil en cliquant sur Image | Ajuster | Threshold, et définissez les meilleurs paramètres de seuil où toutes les cellules sont principalement visibles. Cliquez sur Appliquer pour appliquer les paramètres de seuil.
         REMARQUE : Si aucun seuil n’a été appliqué aux cellules qui présentent des trous, cliquez sur Traiter | Binaire | Remplir les trous pour combler les espaces à l’intérieur des cellules. Si les cellules sont fusionnées avec les paramètres de seuil, cliquez sur Traiter | Binaire | Bassin versant pour séparer ces cellules. Une fine ligne de 1 pixel séparera toute cellule que le programme interprète comme fusionnée.
      4. Définissez le noyau le plus petit et le plus grand de l’image en sélectionnant manuellement un noyau de choix à l’aide de l’outil de sélection à main levée , ajoutez-le au gestionnaire de retour sur investissement et mesurez la surface.
      5. Analysez les particules (noyaux) en cliquant sur Analyser | Analysez les particules et insérez la plus petite surface et la plus grande zone dans la zone Taille (^2) avec un trait d’union (-) entre les deux. Cochez les cases Afficher les résultats, Ajouter au gestionnaire et Exclure sur les bords avant de cliquer sur OK. Passez à l’étape 8.2.3 pour terminer le protocole.
3. Mesurez les signaux cytoplasmiques mTurquoise2 et β-caténine dans les thymocytes.
   1. Sélectionnez le contour de thymocytes entiers dans l’image en fond clair en suivant les mêmes étapes que ci-dessus.
   2. Sélectionnez >3 zones d’arrière-plan où aucune cellule n’est présente et ajoutez-les au gestionnaire de retour sur investissement.
      REMARQUE : La taille et la forme ne sont pas essentielles dans ce cas. Ces régions serviront de mesures du bruit de fond pour le calcul final.
      1. Activez l’image de la valeur grise mTurquoise2 en cliquant dessus, et visualisez les zones de retour sur investissement et d’arrière-plan des cellules totales sélectionnées en cliquant sur Afficher tout dans le gestionnaire de ROI. Observez toutes les zones sélectionnées qui sont visibles dans l’image mTurquoise2.
      2. Cliquez sur Mesurer dans le Gestionnaire de ROI, ou cliquez sur Analyser | Mesurer. Observez la nouvelle fenêtre Résultats qui s’ouvre avec les résultats de mesure du signal mTurquoise2.
      3. Transférez les résultats dans un tableur en cliquant sur Modifier | Sélectionnez tout et copiez/collez la liste dans la feuille de calcul pour un calcul plus approfondi.
      4. Activez l’image de la valeur grise β-caténine en cliquant dessus, et visualisez les zones d’intérêt totales des cellules sélectionnées et les zones d’arrière-plan en cliquant sur Afficher tout dans le gestionnaire de ROI. Observez toutes les zones sélectionnées qui sont visibles dans l’image β-caténine.
      5. Cliquez sur Mesurer dans le Gestionnaire de ROI, ou cliquez sur Analyser | Mesurer. Notez la nouvelle fenêtre Résultats qui s’ouvre avec les résultats de mesure du signal cellulaire total de β-caténine.
      6. Transférez les résultats dans un tableur en cliquant sur Modifier | Sélectionnez tout et copiez/collez la liste dans la feuille de calcul pour un calcul plus approfondi. Enregistrez le gestionnaire de retour sur investissement pour référence ultérieure sans avoir à répéter la sélection de cellule en cliquant sur Plus | Sauvegarder....
4. Calculer la fluorescence nucléaire totale corrigée (CTNF) pour la β-caténine active à l’aide de l’équation 1.
   CTNF = Densité intégrée - (Aire × moyenne des zones d’arrière-plan moyennes) (1)
5. Calculez la fluorescence cellulaire totale corrigée (CTCF) pour mTurquoise2 à l’aide de l’équation 2.
   CTCF = Densité intégrée - (Aire × moyenne des zones d’arrière-plan moyennes) (2)
6. Différencier la β-caténine nucléaire active de la β-caténine cytoplasmique en soustrayant les valeurs de β-caténine nucléaire obtenues à l’étape 8.2.3.3. à partir des valeurs cellulaires totales de β-caténine obtenues à l’étape 8.3.2.5 pour obtenir la β-caténine cytoplasmique inactive.
   REMARQUE : Assurez-vous que les mesures sont effectuées dans la même cellule.
   1. Calculez la moyenne de l’intensité moyenne des zones d’arrière-plan. Calculez CTNF et CTCF à l’aide des équations 1 et 2. Considérez IntDen (la somme de tous les pixels de la zone sélectionnée) comme la densité intégrée et non RawIntDen.
   2. Si nécessaire, calculez l’écart type des valeurs IntDen pour le traçage des graphiques. Considérez jusqu’à 200 cellules distinctes pour l’analyse statistique à l’aide du test U de Mann-Whitney.
7. Tracez les résultats dans un graphique de points de données individuel et étiquetez l’axe des y avec les valeurs CTNF ou CTCF en unités fluorescentes relatives (RFU).

Résultats

Pour étudier le rôle de la signalisation canonique Wnt, un modèle de rapporteur canonique Wnt Axin2-mTurquoise2 a été testé en combinaison avec l’expression de la protéine β-caténine. Les thymocytes sont connus pour être fragiles, présentent une faible signalisation canonique Wnt à plusieurs stades du processus de maturation des thymocytes et ont un faible rapport cytoplasmique/nucléaire ; tous ces facteurs entravent la détection de la mTurquoise2 cytoplasmique ou de la β-caténine. En suivant le protocole, les thymocytes...

Discussion

Plusieurs rapporteurs canoniques Wnt sont disponibles avec une sensibilité de rapporteur différente et des protéines rapporteures réelles. Des modèles rapporteurs utilisant des sites de liaison TCF/LEF multimérisés introduits synthétiquement sont disponibles avec des protéines rapporteures fluorescentes ; cependant, de telles répétitions de transgènes peuvent être perdues lors de la sélection ou de longues expériences in vivo et peuvent être sensibles aux signaux non-Wnt des séq...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cytomètre en flux BD FACScantoII	BD Biosciences	non applicable	Numéro de série V96300710. La configuration du cytomètre en flux dans ce protocole contient une ligne laser de 405 nm avec un filtre passe-long 505 et un filtre passe-bande 530/30 nm, et un filtre passe-bande 470/20 nm ; un laser 488 nm avec filtre passe-long de 735 nm et filtre passe-bande 780/60 nm, filtre passe-long 670 nm et filtre passe-long 655 nm, filtre passe-long 610 nm, filtre passe-long 550 nm et filtre passe-bande 575/26 nm, filtre passe-large 505 nm et filtre passe-bande 530/30 nm, et filtre passe-bande 488/10 nm ; et une ligne laser de 633 nm avec un filtre passe-long de 735 nm et un filtre passe-bande 780/60 nm, un filtre passe-long de 685 nm et un filtre passe-bande 660/20 nm.
BSA  ;	Sigma  ;	A9647
Corning 70 &mu ; crépine à cellules M  ;	Faucon/Corning  ;	352350
Cytospin 4 Type A78300101	Thermo Scientific	non adaptable
DMSO	Sigma Aldrich  ;	D5879-1L
DNAse I	Sigma  ;	A9647
Falcon 50 mL Conique Tubes à centrifuger	Greiner bio-one	227261
Falcon à fond rond Polystyrène Tubes à essai avec filtre à cellules capuchon à pression	Fisher Scientific  ;
sérum de veau fœtal (FCS)	Greiner Bio-One B.V.  ;	non applicable  ;	Dépend de l’origine
Fiji software  ;	ImageJ	non applicable  ;	Édition 1.53
Carte filtrante blanche (pour cytospin)	VWR	SHAN5991022
FlowJo 10 logiciel	Treestar	non adaptable  ;	Édition 10.5.3
Glissements de glace  ;	Klinipath
Gibco IMDM medium  ;	Fisher Scientific  ;
HCX PL APLO 40x 1.4 OIL objectif	Leica microsystems  ;	non applicable  ;
Stylo hydrophobe : Omm Edge pen  ;	Vecteur	non applicable  ;
Leica TCS SP5 DMI6000	Microsystèmes Leica  ;	non applicable  ;	La configuration du microscope dans ce protocole se composait d’un objectif à immersion dans l’huile HCX PL APO 40x/1.2 avec une résolution de 8 bits, 1024 pixels x 1024 pixels, vitesse de 400 Hz, sténopé 68 et micro ; m et un facteur de zoom de 1,5 à température ambiante. Ce système contient un laser à diode 405, un laser à argon, un laser DPSS 561, un laser HeNe 594 et un laser HeNe 633 avec 4 détecteurs hybrides (HyDs) et 5 tubes photomultiplicateurs (PMT).  ;
Méthanol  ;	VWR	1060091000
NaN3/azoture de sodium	Ferme hospitalière	non applicable  ;
Sérum de souris normal	Souris	propres non adaptables  ;
PBS  ;	Lonza	BE17-517Q
ProLong Diamond Antifade Mountant	Fisher Scientific  ;	P36965
Souris purifiée anti-&bêta ;-caténine (CTNNB1)	BD Biosciences	610154
TO-PRO-3 Iodure	Thermofisher	T3605
Vernis à ongles transparent	dans n’importe quelle pharmacie	non aplicable  ;
Tween-20	Sigma Aldrich  ;	P1379-500ml  ;
Zenon Alexa Fluor 568 Souris IgG1 kit d’étiquetage	Thermofisher	Z25006