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Article de méthode

Isolement, culture et génie génétique de cellules épithéliales pigmentaires primaires de mammifères pour la thérapie génique non virale

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DOI :

10.3791/62145

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26 février 2021

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1Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 2Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 4Max Delbrück Center for Molecular Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ici, un protocole pour isoler et transfecter les cellules épithéliales pigmentaires primaires de l’iris et de la rétine de divers mammifères (souris, rats, lapins, porcs et bovins) est présenté. La méthode est parfaitement adaptée à l’étude des approches de thérapie génique oculaire dans diverses configurations pour des analyses ex vivo et des études in vivo transférables à l’homme.

Résumé

La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA) est la cause la plus fréquente de cécité chez les patients >60 ans, affectant environ 30 millions de personnes dans le monde. La DMLA est une maladie multifactorielle influencée par des facteurs environnementaux et génétiques, qui entraînent une altération fonctionnelle de la rétine due à la dégénérescence des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) suivie d’une dégradation des photorécepteurs. Un traitement idéal comprendrait la transplantation de cellules RPE saines sécrant des facteurs neuroprotecteurs pour prévenir la mort cellulaire RPE et la dégénérescence des photorécepteurs. En raison des similitudes fonctionnelles et génétiques et de la possibilité d’une biopsie moins invasive, la transplantation de cellules épithéliales pigmentaires de l’iris (EPI) a été proposée comme substitut à l’EPR dégénérée. La sécrétion de facteurs neuroprotecteurs par un faible nombre de cellules transplantées sous-rétinales peut être obtenue par transfection à médiation transposonée par la Belle au bois dormant (SB100X)avec des gènes codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) et / ou le facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires (GM-CSF). Nous avons établi l’isolement, la culture et la transfection médiée par SB100Xdes cellules RPE et IPE de diverses espèces, y compris les rongeurs, les porcs et les bovins. Les globes sont explantés et la cornée et le cristallin sont enlevés pour accéder à l’iris et à la rétine. À l’aide d’une spatule sur mesure, les cellules IPE sont retirées de l’iris isolé. Pour récolter des cellules EPR, une incubation de trypsine peut être nécessaire, selon l’espèce. Ensuite, à l’aide d’une spatule personnalisée RPE, les cellules sont suspendues dans un milieu. Après l’ensemencement, les cellules sont surveillées deux fois par semaine et, après avoir atteint la confluence, transfectées par électroporation. L’intégration, l’expression, la sécrétion et la fonction des protéines ont été confirmées par qPCR, WB, ELISA, immunofluorescence et tests fonctionnels. Selon les espèces, 30 000 à 5 millions de cellules (EPR) et 10 000 à 1,5 million de cellules (IPE) peuvent être isolées par œil. Les cellules génétiquement modifiées présentent une surexpression significative du PEDF/GM-CSF avec la capacité de réduire le stress oxydatif et offrent un système flexible pour les analyses ex vivo et les études in vivo transférables à l’homme pour développer des approches de thérapie génique oculaire.

Introduction

Notre groupe se concentre sur le développement d’approches régénératives pour traiter la dégénérescence neurorétinienne, c’est-à-dire la DMLA, par thérapie génique non virale basée sur l’EPR et l’IPE. L’établissement préclinique de telles thérapies nécessite des modèles in vitro transférables à l’homme. Ainsi, l’objectif de l’étude présentée ici est de fournir des protocoles pour l’isolement, la culture et le génie génétique des cellules PRIMAIRES RPE et IPE. La raison d’être de l’isolement des cellules PE de plusieurs espèces est de confirmer de manière robuste l’innocuité et l’efficacité de l’approche et d’accroître sa reproductibilité et sa transférabilité. La lignée cellulaire ARPE-19 humaine disponible diffère des cellules primaires (par exemple, elles sont moins pigmentées) et n’a donc qu’une valeur limitée pour les analyses précliniques1. De plus, les cellules de mammifères non humains peuvent être achetées à moindre coût et en plus grandes quantités; les tissus de donneurs humains peuvent être obtenus à partir de diverses banques d’yeux, mais la disponibilité est limitée et coûteuse. Enfin, les nouveaux médicaments de thérapie innovante (ATMP, c’est-à-dire les cellules, les tissus ou les médicaments de thérapie génique) doivent être appliqués à au moins deux espèces différentes avant d’être testés chez les patients et ces études in vivo demandent la préparation de greffes de cellules allogéniques.

Les maladies neurodégénératives de la rétine sont la principale cause de cécité dans les pays industrialisés, comprenant des maladies courantes comme la DMLA, ainsi que des maladies rares comme la rétinite pigmentaire, dans laquelle la mort cellulaire rétinienne conduit finalement à la cécité. Les lésions des cellules EPR, des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC) peuvent dans certains cas être ralenties, mais il n’existe actuellement aucun traitement curatif. Les ATMP offrent la possibilité de corriger les défauts génétiques, d’intégrer des gènes thérapeutiques ou de remplacer les cellules dégénérées, permettant ainsi le développement de thérapies régénératives et curatives pour des maladies telles que la DMLA; 13 thérapies géniques ont déjà obtenu l’autorisation de commercialisation, y compris une thérapie pour traiter la dégénérescence rétinienne associée à la mutation RPE652,3. Parmi les personnes âgées (>60 ans), environ 30 millions de personnes dans le monde sont touchées par la DMLA néovasculaire (nvAMD) ou avasculaire (aAMD)4. Les deux formes sont induites par des déclencheurs associés à l’âge, y compris des dommages oxydatifs, une altération de la fonction et une perte de cellules EPR suivies d’une dégradation des photorécepteurs, entre autres (par exemple, allèles de risque génétique, tabagisme, hypertension)5,6. Dans la nvAMD, la pathogenèse est aggravée par un déséquilibre des facteurs angiogéniques et anti-angiogéniques en faveur du facteur de croissance endothélial vasculaire angiogénique (VEGF) qui induit la néovascularisation choroïdienne (CNV). À ce jour, seule la nvAMD peut être traité par des injections intravitréennes mensuelles d’inhibiteurs de la protéine VEGF pour supprimer le CNV; aucun traitement efficace n’est encore disponible pourl’AAMD 6,7.

Plusieurs études ont évalué les thérapies cellulaires pour remplacer le traitement anti-VEGF: des études réalisées par Binder et al., dans lesquelles des cellules RPE autologues fraîchement récoltées ont été transplantées chez des patients atteints de nAMD8,9,10, ont montré une amélioration visuelle modérée, mais seul un petit groupe de patients a atteint une acuité visuelle finale suffisamment élevée pour permettre la lecture. Récemment, une étude clinique de phase I a utilisé un patch RPE dérivé de cellules souches embryonnaires pour traiter la DMLA avec des résultats prometteurs; c’est-à-dire l’efficacité, la stabilité et l’innocuité du timbre RPE jusqu’à 12 mois chez 2 des 10 patients traités11. En outre, plusieurs groupes ont publié des études dans lesquelles des plaques autologues de la membrane-choroïde de BRUCH ont été récoltées dans la rétine périphérique et transplantées dans la macula12,13,14; et des patchs d’EPR induits dérivés de cellules souches pluripotentes (iPSC) ont été générés pour la transplantation15. Pour l’aAMD, des anticorps ciblant la voie du complément ont été testés dans les essais cliniques6,16 et une étude de phase I utilisant une seule injection intravitréenne d’un vecteur viral adéno-associé (AAV) codant le gène du facteur CD59 (AAVCAGsCD59) chez des patients atteints d’atrophie géographique (GA) a été réalisée17; l’étude de phase II a récemment débuté et vise à recruter 132 patients atteints de DMA avancée et à évaluer le résultat à 2 ans après l’intervention18. Enfin, le groupe d’étude FocuS a entamé un essai clinique multicentrique de phase I/II évaluant l’innocuité, la dose-réponse et l’efficacité d’un vecteur AAV recombinant non répliquant codé pour un facteur de complément humain19.

Principalement, l’objectif d’une thérapie régénérative de la DMLA est la transplantation de cellules RPE fonctionnelles, qui ont été endommagées ou perdues. Cependant, les cellules IPE et RPE partagent de nombreuses similitudes fonctionnelles et génétiques (par exemple, la phagocytose et le métabolisme du rétinol), et comme les cellules IPE sont plus facilement récoltées, elles ont été proposées comme substitut RPE20. Même s’il a déjà été démontré que la greffe de cellules IPE retarde la dégénérescence des photorécepteurs dans les modèles animaux21,22 et stabilise la fonction visuelle chez les patients atteints de nvAMD en phase finale, aucune amélioration significative n’a été observée chez ces patients23. Le manque d’efficacité peut être dû au faible nombre de cellules transplantées et/ou au déséquilibre des facteurs rétiniens neuroprotecteurs. Une autre approche consisterait à transplanter des cellules épithéliales pigmentaires transfectées qui surexpriment les facteurs neuroprotecteurs pour restaurer l’homéostasie rétinienne, maintenir les cellules EPR restantes et protéger les photorécepteurs et les CRG de la dégénérescence. Par conséquent, nous proposons une nouvelle thérapie qui comprend la transplantation de cellules RPE ou IPE fonctionnelles qui ont subi un génie génétique pour sécrétiser des protéines neuroprotectrices et anti-angiogéniques, telles que le PEDF, le GM-CSF ou les facteurs de croissance analogues à l’insuline (IGF). L’avantage de développer et d’analyser cette approche chez plusieurs espèces au lieu d’utiliser une lignée cellulaire, une seule espèce, ou un tissu humain est : 1) une reproductibilité et une transférabilité accrues des résultats comme le montrent de nombreuses études réalisées dans des laboratoires indépendants et différentes espèces1,24,25; 2) les cellules de porc ou de bovin sont jetables sans le sacrifice d’animaux supplémentaires; 3) la disponibilité de cellules de porc et de bovins en particulier permet à de grandes séries d’essais de produire des résultats robustes; 4) la connaissance de l’isolement, de la culture et de la modification génétique des cellules à partir des modèles les plus utilisés permet des analyses in vivo chez plusieurs espèces24,25,26 et offre ainsi un meilleur rapport bénéfice-risque pour les premiers patients traités; 5) la flexibilité du protocole présenté permet son utilisation dans divers modèles et dispositifs expérimentaux et pour toutes les thérapies à base de cellules oculaires avec et sans génie génétique. En revanche, les techniques alternatives telles que les lignées cellulaires ou les tissus humains ne sont que d’une transférabilité limitée et/ou d’une jetabilité limitée. Les lignées cellulaires telles que l’ARPE-19 sont idéales pour les expériences préliminaires; cependant, une faible pigmentation et une prolifération élevée diffèrent significativement des cellules primaires1. Les cellules RPE et IPE, qui sont isolées à partir de tissus de donneurs humains, constituent une source précieuse pour des expériences in vitro transférables; cependant, nous obtenons du tissu humain auprès d’une banque d’yeux américano-américaine, ce qui signifie que le tissu a au moins deux jours (après l’énucléation) et nécessite un transport long et coûteux, mais que le tissu du donneur local n’est pas disponible en quantité suffisante pour une recherche productive. L’avantage de l’utilisation de cellules primaires est confirmé par de multiples études d’autres groupes27,28.

Pour le développement d’une thérapie génique non virale à base de cellules utilisant le système de transposon SB100X pour transfecter les cellules RPE et IPE primaires avec les gènes codant pour PEDF et / ou GM-CSF pour traiter nvAMD et aAMD, respectivement29,30,31,32, nous avons d’abord établi la transfection des cellules ARPE-191 . Ensuite, les protocoles d’isolement et de transfection ont été établis dans des cellules primaires bovines et porcines facilement accessibles. Maintenant, l’isolement et la transfection des cellules primaires RPE et IPE de cinq espèces différentes ont été établis, des petits (comme la souris) aux grands mammifères (comme le bétail). Elle a été confirmée dans des cellules primaires RPE et IPE dérivées d’yeux de donneurs humains30. La production conforme aux Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) de l’ATMP a également été validée à l’aide de tissus de donneurshumains 33. Enfin, l’innocuité et l’efficacité de l’approche ont été évaluées in vivo chez trois espèces différentes pour lesquelles le protocole a été adapté : la souris, le rat et le lapin. Dans la configuration clinique, une biopsie de l’iris sera prélevée sur le patient et les cellules IPE seront isolées et transfectées dans la salle blanche, avant que les cellules ne soient transplantées par voie sous-rétinale chez le même patient. L’ensemble du processus aura lieu au cours d’une seule séance chirurgicale d’une durée d’environ 60 minutes. Le développement de l’approche thérapeutique et l’évaluation de son efficacité ont demandé d’excellents modèles in vitro et ex vivo pour mettre en œuvre des méthodes d’administration de gènes robustes et efficaces, pour analyser l’efficacité de l’administration de gènes, la production de protéines thérapeutiques et les effets neuroprotecteurs, et pour produire des greffes de cellules pour testerl’approche in vivo1,24, 25,29,30 . Il convient de mentionner que la thérapie a l’approbation éthique pour un essai clinique de phase Ib/IIa de la commission éthique pour la recherche du canton de Genève (n° 2019-00250) et que les dernières données précliniques actuellement demandées pour autorisation par les autorités réglementaires suisses sont collectées à l’aide du protocole présenté. À cet égard, les données précliniques in vivo ont démontré une réduction significative de la CNV et une excellente sécurité24,25,31.

Ici, l’isolement et la culture de cellules RPE/IPE de bovins, de porcs, de lapins, de rats et de souris, ainsi que l’utilisation du système de transposition intégratif SB100X combiné à l’électroporation comme méthode efficace d’administration de gènes sont décrits. En particulier, les cellules PE primaires ont été transfectées pour surexprimer le PEDF et le GM-CSF. La collecte de ces protocoles permet de réalisées dans toutes les phases précliniques du développement de l’ATMP. De plus, la configuration a le potentiel d’être adaptée à d’autres gènes d’intérêt et maladies.

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Protocole

Les protocoles dans lesquels les animaux ont été impliqués ont été réalisés par du personnel certifié et après autorisation du Département cantonal de la sécurité, de l’emploi et de la santé (DSES), Domaine de l’expérimentation animale de Genève, Suisse, et conformément à la Déclaration de l’ARVO pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle (approbation no. GE/94/17). Des rats bruns de Norvège adultes en bonne santé, des souris C57BL/6 et des lapins blancs néo-zélandais ont été euthanasiés par une surdose de Pentobarbital (150 mg/kg) dilué dans du NaCl injecté par voie intrapéritonéale à 0,9 % et les yeux ont été énucléés immédiatement après le sacrifice. Les yeux de porc et de bovin ont été obtenus dans un abattoir local dans les 6 heures suivant le sacrifice et ont été transportés au laboratoire sur de la glace.

1. Avant la préparation

  1. Préparer un milieu complet (DMEM/Ham’s F12 complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 80 U/mL de pénicilline / 80 μg/mL de streptomycine et 2,5 μg/mL d’amphotéricine B). Chauffer le fluide, 1x PBS, et 0,25% de trypsine (si nécessaire) dans un bain-marie à 37 °C.
  2. Mettez un drap stérile dans la capuche pour préparer un lieu de travail aseptique. Introduisez tous les instruments et matériaux stériles nécessaires à l’intérieur du capot.
    REMARQUE: Seule l’énucléation des yeux et le nettoyage du tissu musculaire et de la peau restants sont les procédures effectuées à l’extérieur de la hotte, le reste des étapes doit être effectué à l’intérieur de la hotte.

2. Isolement des cellules PE de rat/souris

  1. Utilisez des ciseaux incurvés et des pinces Colibri pour énucléer les yeux après l’euthanasie de l’animal. Nettoyez le tissu musculaire et la peau restants des yeux à l’aide de ciseaux et de pinces (non stériles).
    REMARQUE: La taille des ciseaux et des pinces utilisés pour l’énucléation et le nettoyage des yeux dépend de l’espèce (par exemple, pour le rat et la souris, les instruments seront plus petits que ceux utilisés pour les porcs et les bovins) (voir figure S1).
    1. Recueillir les yeux dans un tube de 50 mL rempli de PBS non stérile et transférer le tube dans la hotte à écoulement laminaire. Désinfectez les yeux en les immergeant pendant 2 min dans une solution à base d’iode, puis transférez-les dans une boîte de Petri remplie de PBS stérile.
  2. Ouverture de l’ampoule
    1. Après avoir transféré les yeux dans une boîte de Petri stérile, tenez-en une fermement près du nerf optique avec Colibri ou une pince pointue. Percez un trou près de la limite de l’iris (entre pars plana et ora serrata) avec une aiguille de 18 G. Insérez de petits ciseaux dans le trou et coupez autour de l’iris. Retirez le segment antérieur (cornée, lentille et iris) et mettez-le dans une boîte de Pétri. Laissez le bulbe avec le vitré jusqu’à ce que les cellules RPE soient isolées.
  3. Isolement des cellules IPE
    1. Retirez la lentille et, à l’avec de fines pinces, retirez délicatement l’iris contenant les cellules IPE. Placez l’iris dans une boîte de Pétri, lavez-le avec du PBS stérile et laissez-le dans du PBS jusqu’à ce que plus d’iris soit préparé.
    2. Répétez les étapes 2.2.1 à 2.3.1 pour que tous les yeux soient préparés ce jour-là.
    3. Ajouter 50 μL de trypsine à 0,25 % par iris et incuber pendant 10 min à 37 °C. Retirer la trypsine, ajouter 150 μL de milieu complet par iris et gratter délicatement l’IPE avec une pipette Pasteur plate polie au feu; utiliser des pinces fines pour immobiliser le tissu. Recueillir la suspension cellulaire et la mettre dans un tube de 1,5 mL. Utilisez 10 μL de la suspension cellulaire diluée 1:3 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer34,35.
    4. S’ils ne sont pas transfectés immédiatement, ensemencer 200 000 cellules/puits dans une plaque de 24 puits (100 000 cellules/cm2)dans 1 mL de milieu complet (10 % FBS) (pour l’ensemencement, voir tableau 1). Placez la plaque dans un incubateur et culturez-la à 37 °C, 5% de CO2.
      REMARQUE: Il peut être nécessaire de regrouper plusieurs yeux pour avoir suffisamment de cellules pour l’ensemencement.
  4. Isolement des cellules RPE
    1. Enlevez l’humeur vitrée et la rétine du segment postérieur avec une pince mince. Évitez d’endommager l’épithélium pigmentaire rétinien.
    2. Coupez le segment en deux avec un scalpel #10 pour que le globe soit complètement ouvert et lavez-le avec du PBS stérile.
    3. Ajouter 50 μL de trypsine à 0,25 % par œil et incuber pendant 10 min à 37 °C. Retirer la trypsine et ajouter 150 μL de milieu complet par globe et gratter délicatement les cellules RPE avec un scalpel rond; utiliser des pinces fines pour immobiliser le tissu. Recueillez la suspension cellulaire et mettez-la dans un tube de 1,5 mL. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire; diluer 1:4 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
    4. Voir l’étape 2.3.4.
      REMARQUE: Il peut être nécessaire de regrouper plusieurs yeux pour avoir suffisamment de cellules pour l’ensemencement.

3. Isolement des cellules PE du lapin

  1. Effectuer le nettoyage et la désinfection comme décrit aux étapes 2.1 à 2.1.1.
  2. Placez un œil sur une compresse de gaze stérile et maintenez-la fermement près du nerf optique. Ouvrez l’œil avec le scalpel #11 et des ciseaux à environ 2 mm sous les limbes. Retirez le segment antérieur (cornée, lentille et iris) et mettez-le dans une boîte de Pétri. Laissez le bulbe avec le vitré jusqu’à ce que les cellules RPE soient isolées.
  3. Isolement des cellules IPE
    1. Effectuez l’étape 2.3.1. Retirez le corps ciliaire de l’iris en coupant avec un scalpel #10.
    2. Après la préparation de 2 iris, incuber avec 1 mL de trypsine à 0,25 % à 37 °C pendant 10 min; pendant ce temps, les cellules RPE peuvent être isolées (voir l’étape 3.4). Retirer la trypsine et ajouter 1 mL de milieu complet à l’iris et isoler les cellules en les grattant soigneusement avec une pipette Pasteur plate polie au feu. Resuspendez soigneusement les cellules par pipetage et transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer 1:3 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
    3. Voir l’étape 2.3.4.
  4. Isolement des cellules RPE
    1. Effectuez l’étape 2.4.1.
    2. Mettez une gaze stérile dans une plaque de 12 puits et mettez l’ampoule sur la gaze.
    3. Lavez avec PBS et effectuez l’étape 2.4.3.
      REMARQUE: Utilisez une pipette Pasteur incurvée polie au feu.
    4. Centrifuger les cellules 10 min à 120 x g.
    5. Voir l’étape 2.3.4.

4. Isolement des cellules PE du porc

  1. Effectuez le nettoyage comme décrit à l’étape 2.1. Laver avec du PBS et désinfecter les yeux en les immergeant pendant 2 min dans une solution à base d’iode, rincer avec du PBS. Passez à l’étape 3.2.
  2. Isolement des cellules IPE
    1. Effectuez l’étape 3.3.1. Après la préparation de 2 iris, ajouter 1 mL de milieu complet et isoler les cellules en les grattant soigneusement avec une pipette Pasteur plate polie au feu. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer 1:4 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
    2. Voir l’étape 2.3.4.
  3. Isolement des cellules RPE
    1. Effectuez l’étape 2.4.1. Placez l’ampoule dans une boîte de Pétri et lavez-la avec du PBS. Remplissez l’ampoule avec 1 mL de milieu complet.
    2. À l’aide d’une pipette Pasteur incurvée polie au feu, retirez soigneusement les cellules RPE. Assurez-vous de gratter du bas vers le haut pour éviter de glisser vers le bas du complexe membranaire choroïde-Bruch. Recueillir la suspension cellulaire à l’intérieur de l’ampoule à l’aide d’une pipette de 1 000 μL et la transférer dans un tube de 1,5 mL pour la remise en suspension. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer 1:8 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
    3. Voir l’étape 2.3.4.

5. Isolement des cellules PE bovines

  1. Effectuez le nettoyage comme décrit à l’étape 2.1. Laver avec du PBS et désinfecter les yeux en les immergeant pendant 2 min dans une solution à base d’iode, rincer avec du PBS. Passez à l’étape 3.2.
  2. Isolement des cellules IPE
    1. Effectuez l’étape 3.3.1. Après la préparation de deux iris, incuber avec 2 mL de trypsine à 0,25 % à 37 °C pendant 10 min. Pendant ce temps, les cellules RPE peuvent être isolées (voir l’étape 5.3).
    2. Retirer la trypsine et ajouter 2 mL de milieu complet à l’iris et isoler les cellules en les rayant soigneusement avec une pipette Pasteur plate polie au feu. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 15 mL. Centrifuger les cellules 10 min à 120 x g. Prendre 10 μL de la suspension cellulaire et diluer 1:4 avec du bleu de trypan pour compter les cellules dans la chambre de Neubauer.
    3. S’ils ne sont pas transfectés immédiatement, semer 320 000 cellules/puits dans une plaque de 6 puits dans 3 mL de milieu complet (10 % FBS) (pour l’ensemencement voir tableau 1). Placez la plaque dans un incubateur et culturez-la à 37 °C, 5% de CO2.
  3. Isolement des cellules RPE
    1. Suivez l’étape 2.4.1. Placez l’ampoule dans une boîte de Pétri et lavez-la avec du PBS. Après préparation de 2 yeux, remplissez le bulbe environ 3/4 de trypsine et incubez pendant 25 min à 37 °C avec le couvercle de la boîte de Petri sur le dessus du bulbi.
    2. Retirer la trypsine et ajouter 1 mL de milieu complet. Effectuez l’étape 4.3.2. Centrifuger les cellules 10 min à 120 x g.
    3. Voir l’étape 5.2.3.

6. Culture - changement moyen

  1. Culture des cellules dans le F12 de DMEM/Ham, complété par 10 % de FBS, 80 U/mL de pénicilline /80 μg/mL de streptomycine et 2,5 μg/mL d’amphotéricine B, à 37 °C et 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié. Après 3-4 jours, pipettez de haut en bas pour recueillir les cellules non adhérentes et mettez la moitié du volume dans un autre puits. Remplir jusqu’à 1 mL avec un milieu complet.
    REMARQUE: Cela permet d’avoir une surface suffisamment grande pour que toutes les cellules isolées se fixent et maximisent la sortie.
  2. Après 3-4 jours supplémentaires, répétez la collecte de cellules, mais cette fois en remettant en commun les cellules non adhérentes de deux puits en un seul puits (par exemple, A1 + B1 dans C1). Ajouter du milieu à tous les puits. Observez les cellules et changez le milieu 2 fois par semaine (pour les plaques de 6 et 24 puits, utilisez respectivement 3 et 1 mL / puits). Lorsque les cellules atteignent la confluence, passez à un milieu complet avec 1% de FBS ou utilisez les cellules pour des expériences (par exemple, transfection).
    REMARQUE: Les cellules RPE et IPE sont confluentes après 3-4 et 4-5 semaines après l’isolement, respectivement. La pureté de la culture cellulaire a été corroborée en vérifiant la morphologie cellulaire (cellules pigmentées) et les marqueurs spécifiques tels que décrits par Johnen et ses collègues36.

7. Électroporation des cellules PE primaires

  1. Effectuer l’électroporation comme décrit avant1,37.
  2. Selon le nombre de cellules transfectées, utilisez des plaques de 6, 24 ou 48 puits (voir tableau 2)pour ensemencer les cellules dans un milieu sans antibiotiques ni antimycotiques. Pendant les 2 semaines suivantes, ajouter des gouttes contenant du milieu contenant de la pénicilline (80 U/mL), de la streptomycine (80 μg/mL) et de l’amphotéricine B (2,5 μg/mL) deux fois par semaine. Échangez complètement le milieu 2 semaines après la transfection.
  3. Pour déterminer la croissance cellulaire, l’efficacité de la transfection et la sécrétion de protéines, surveillez les cellules chaque semaine par microscopie et analysez le surnageant de culture cellulaire par transfert western. Avant la fin de la culture, prendre un surnageant de culture cellulaire de 24 heures pour quantifier la sécrétion de protéines par ELISA, compter les cellules, mesurer la fluorescence par cytométrie basée sur l’image (dans le cas des cellules transfectées de Vénus)en suivant les instructions des fabricants (voir Tableau des matériaux),et collecter la pastille cellulaire pour l’analyse de l’expression génique basée sur la RT-qPCR.
    NOTE: Ces méthodes ne sont pas incluses dans le présent document car il ne s’agit pas d’expliquer en détail l’analyse des cellules, mais plutôt leur isolement. La densité d’ensemencement cellulaire est la même pour toutes les espèces (100 000cellules/cm2)mais comme le nombre de cellules isolées varie, différentes plaques ont été utilisées. De plus, pour les souris, les rats et les lapins, il peut être nécessaire de mettre en commun 2-3 yeux pour avoir suffisamment de cellules pour l’ensemencement.
EspèceTraitement à la trypsineN° Cellules IPEN° Cellules RPEPlaque pour l’ensemencement (100 000 cellules/cm2)
Souris/ratOuiEnviron 50 000~150 000Plaques de 24 puits
LapinOuiEnviron 350 000~2 500 000Plaques de 24 puits
CochonNon~1 000 000~3 000 000Plaques de 24 puits
BovinOui~1 700 000~5 000 000Plaques à 6 puits

Tableau 1 : Nombre de cellules PE primaires isolées à partir d’yeux de différentes espèces.

NomAireVolume moyenTrypsineMilieu volumique pour arrêter l’action de la trypsineDensité d’ensemencement
Plaque à 6 puits9,6 cm²3,0 mL0,5 mL1,0 mL3x105
Plaque de 24 puits2,0 cm²1,0 mL0,2 mL0,8 mL5x104
Plaque de 48 puits1,1 cm²0,5 mL0,1 mL0,4 mL0,5-1x104

Tableau 2 : Volumes de culture cellulaire et densités d’ensemencement.

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Résultats

Isolement de l’EP de différentes espèces de mammifères
En utilisant les protocoles susmentionnés, les cellules IPE et RPE ont été isolées et cultivées avec succès à partir de cinq espèces différentes. Le nombre de cellules obtenues à partir de chaque procédure dépend de l’espèce et de la taille de l’œil (Tableau 1). Comme le montre la figure 1,les cellules présentent une morphologie et une pigmentation typiques des cellules PE (à l’exception des cellules ...

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Discussion

Avoir des méthodes normalisées pour isoler et mettre en culture des cellules PE est fondamental dans le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les maladies dégénératives de la rétine. Avec les protocoles présentés ici, les cellules PE peuvent être isolées avec succès de différentes espèces et cultivées pendant de longues périodes (jusqu’à présent, la culture la plus longue était maintenue pendant 2 ans1,38); la morphologie, la pigmentation et la...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Un grand merci à Gregg Sealy et Alain Conti pour leur excellente assistance technique. Ces travaux ont été soutenus par la Commission européenne dans le cadre du septième programme-cadre, du Fonds national suisse de la recherche scientifique et de la Fondation Schmieder-Bohrisch. Z.I. a reçu un financement du Conseil européen de la recherche, ERC Advanced [ERC-2011-ADG 294742] et B.M.W. d’une bourse de recherche Fulbright et d’une bourse d’excellence de la Confédération suisse.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques 12 puitsCorning353043
Plaques 24 puitsCorning353047
Plaques 48 puitsThermoFisher Scientific150687
Plaque 6 puitsGreiner7657160
BetadineMundipharma
Bonn micro pince plate
Pince Colibri (stérile)
CytoTox-Glo Cytotoxicity AssayPromegaG9291
DMEM/Ham’s F12Sigma-AldrichD8062
Drape (stérile)Mö ; lnlycke Health Care800530
Tampon d’électroporation 3P.143P Pharmaceutique
FBSBrunschwigP40-37500
Pince (de différentes tailles) (stérile)
Compresse de gazePROMEDICAL AG25403
NaCl (0.9 %)Laboratorium Dr. Bichsel AG1000090
Aiguille (18G)  ;TerumoTER-NN1838R
Neon Transfection Kit 10 µ ; LThermoFisher ScientificMPK1096
Neon Transfection SystemThermoFisher ScientificMPK5000S
Neubauer ChamberMarienfeld-superior640010
Pipette Pasteur (poli au feu)Witeg4100150
PBS 1XSigma-AldrichD8537
Pénicilline/StreptomycineSigma-AldrichP0781-100
Pentobarbital (Thiopental Inresa)Ospedalia AG31408025
Boîte de PétriThermoFisher Scientific150288
pFAR4-PEDF
pFAR4-SB100X
pFAR4-VenusPastor et al., 2018. Aimablement fourni par le Prof. Scherman et le Prof.
Marie pSB100X (250 ng/µ ; L)Má ; té ; S et coll., 2009. Fournir par Prof. Izsvak
pT2-CAGGS-VenusJohnen et al., 2012
pT2-CMV-GMCSF-His ADN plasmidique (250 ng/µ ; L)Cloné dans notre laboratoire
: ADN plasmidique pT2-CMV-PEDF-His (250 ng/µ ; L)Pastor et al., 2018
scarpelle n° 10Swann-Morton501
scarpelle n° 11Swann-Morton503
Pointe pointue-pointue courbée Ciseaux de Bonn extra fins (stériles)  ;
Pointe pointue droite Ciseaux de Bonn extra fins (stériles)
Tali Cytomètre basé sur l’imageThermoFisher ScientificT10796
Trypsine 0,25 %  ;ThermoFisher Scientific25050014
Trypsine 5 %/EDTA 2 %Sigma-AldrichT4174
Ciseaux à ressort Vannas courbés (stériles)

Références

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