Article de méthode

Isolement et imagerie en accéléré de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires primaires de souris pour analyser les attributs de mouvement collectif

DOI :

10.3791/62151

⸱

13 février 2021

 ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, University of Kansas Medical Center, 2Department of Biological Physics, Eotvos University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un protocole d’isolement et de culture de cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris pour l’imagerie en accéléré de la croissance bidimensionnelle (2D) et des tests de réparation des plaies. Nous fournissons également la méthodologie d’analyse des données d’imagerie time-lapse afin de déterminer la formation de flux cellulaire et la motilité directionnelle.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement du palais est un processus dynamique, qui implique la croissance verticale des étagères palatines bilatérales à côté de la langue, suivie d’une élévation et d’une fusion au-dessus de la langue. Les défauts de ce processus entraînent une fente palatine, une anomalie congénitale courante. Des études récentes ont montré que l’élévation de la plate-forme palatale implique un processus de remodelage qui transforme l’orientation de l’étagère d’une verticale à une horizontale. Le rôle des cellules mésenchymateuses du plateau palatal dans ce remodelage dynamique a été difficile à étudier. L’analyse quantitative basée sur l’imagerie time-lapse a récemment été utilisée pour montrer que les cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris (MEPM) peuvent s’auto-organiser en un mouvement collectif. Des analyses quantitatives ont pu identifier des différences dans les cellules MEPM mutantes à partir d’un modèle murin présentant des défauts d’élévation du palais. Cet article décrit des méthodes pour isoler et mettre en culture des cellules MEPM à partir d’embryons E13.5 - spécifiquement pour l’imagerie time-lapse - et pour déterminer divers attributs cellulaires du mouvement collectif, y compris des mesures de formation de flux, d’alignement de forme et de persistance de la direction. Il postule que les cellules MEPM peuvent servir de modèle proxy pour étudier le rôle du mésenchyme du plateau palatal pendant le processus dynamique d’élévation. Ces méthodes quantitatives permettront aux chercheurs dans le domaine craniofacial d’évaluer et de comparer les attributs de mouvement collectif dans les cellules témoins et mutantes, ce qui améliorera la compréhension du remodelage mésenchymateux pendant l’élévation du plateau palatal. De plus, les cellules MEPM fournissent un modèle cellulaire mésenchymateux rare pour l’étude du mouvement cellulaire collectif en général.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement du palais a été largement étudié car les défauts de la palatogenèse conduisent à une fente palatine - une anomalie congénitale courante qui survient dans des cas isolés ou dans le cadre de centaines de syndromes1,2. Le développement du palais embryonnaire est un processus dynamique qui implique le mouvement et la fusion du tissu embryonnaire. Ce processus peut être divisé en quatre étapes principales: 1) induction des étagères palatales, 2) croissance verticale des étagères palatales à côté de la langue, 3) élévation des étagères palatales au-dessus de la langue et 4) fusion des étagères palatales à la ligne médiane1,3,4. Au cours des dernières décennies, de nombreux mutants de souris ont été identifiés qui manifestent une fente palatine5,6,7,8. La caractérisation de ces modèles a révélé des défauts dans les étapes d’induction, de prolifération et de fusion du plateau palatal; cependant, les défauts d’élévation de l’étagère palatale ont été rares. Ainsi, la compréhension de la dynamique de l’élévation du plateau palatal est un domaine de recherche intrigant.

Une analyse minutieuse de certains mutants de souris présentant des défauts d’élévation de la plate-forme palatine a conduit au modèle actuel montrant que la région très antérieure de la tablette palatine semble se retourner, tandis qu’un mouvement vertical à horizontal ou un « remodelage » des étagères palatines se produit dans les régions moyennes à postérieures du palais1,3,4, 9,10,11. L’épithélium du bord médial de la plate-forme palatine initie probablement la signalisation requise pour ce remodelage, qui est ensuite entraînée par le mésenchyme de la plate-forme palatine. Récemment, de nombreux chercheurs ont identifié un retard d’élévation du plateau palatal dans des modèles murins qui ont montré des adhérences orales transitoires impliquant des étagères palatales12,13. Le remodelage mésenchymateux implique une réorganisation des cellules pour créer un renflement dans la direction horizontale, tout en rétractant simultanément la plate-forme palatine dans la direction verticale9,10,14. Parmi les nombreux mécanismes proposés pour affecter l’élévation du plateau palatal et le remodelage mésenchymateux sous-jacent figurent la prolifération cellulaire15,16,17, les gradients chimiotactiques18et les composants de la matrice extracellulaire19,20. Une question importante s’est posée : le retard d’élévation du plateau palatal observé chez les souris déficientes en Specc1l est-ilégalement dû en partie à un défaut de remodelage du plateau palatal, et ce défaut de remodelage pourrait-il se manifester par un défaut intrinsèque de comportement des cellules MEPM primaires21?

Les cellules MEPM primaires ont été utilisées dans le domaine craniofacial pour de nombreuses études impliquantl’expressiongénique 22,23,24,25,26,27,28,29, et quelques-unes impliquant la prolifération30,31 et la migration25,31,32 , mais aucun pour l’analyse collective du comportement cellulaire. L’imagerie en accéléré des cellules MEPM a été réalisée dans des tests de culture 2D et de réparation des plaies pour montrer que les cellules MEPM présentaient un mouvement directionnel et formaient des flux cellulaires dépendants de la densité - attributs du mouvement collectif21. De plus, les cellules mutantes Specc1l formaient des flux cellulaires plus étroits et présentaient des trajectoires de migration cellulaire très variables. Ce manque de motilité coordonnée est considéré comme contribue au retard d’élévation du palais chez les embryons mutants Specc1l 13,21. Ainsi, ces essais relativement simples utilisant des cellules MEPM primaires peuvent servir de proxy pour l’étude du remodelage mésenchymateux pendant l’élévation du plateau palatal. Cet article décrit l’isolement et la culture des cellules MEPM primaires, ainsi que l’imagerie et l’analyse en accéléré, pour les tests 2D et de réparation des plaies.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été réalisées avec un protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de kumc, conformément à leurs lignes directrices et règlements (numéro de protocole: 2018-2447).

1. Récolter des embryons E13.5

  1. Euthanasier les souris femelles gravides à l’aide d’une chambre d’inhalation de CO2 ou par une procédure approuvée par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux. Procédez immédiatement à la dissection.
  2. Exposez la moitié inférieure de la cavité abdominale en enlevant la peau et le péritoine. Excisez les deux cornes de l’utérus, qui contiennent les embryons E13.5.
  3. Placez brièvement l’utérus dans une solution saline tamponnée stérile au phosphate (PBS) pré-avertie à 37 °C pour rincer l’excès de sang, de cheveux ou d’autres débris. Placez l’utérus dans un plat stérile de 10 cm rempli de PBS stérile.
  4. À l’aide de petits ciseaux, coupez à travers la paroi utérine le long de l’utérus pour exposer chaque embryon, toujours dans son sac vitellin. Retirez le sac vitellin entourant l’embryon, mais conservez-le pour le génotypage, si nécessaire. Au fur et à mesure que les embryons sont retirés, placez chaque embryon dans son propre puits d’une plaque de 12 puits remplie de PBS.

2. Dissection des étagères palatales des embryons (Figure 1)

REMARQUE: Stériliser les instruments de dissection en acier inoxydable (voir le tableau des matériaux)après le traitement de chaque embryon en plaçant les instruments d’abord dans un bécher d’alcool éthylique à 100%, puis dans un stérilisateur d’instruments à 350 °C pendant 10 s, puis en les refroidissant dans un deuxième bécher de 100% EtOH.

  1. À l’aide d’une cuillère perforée stérilisée, placer l’embryon dans un nouveau plat de 10 cm rempli de milieu de culture MEPM composé du milieu essentiel minimum (DMEM) de Dulbecco contenant 10% de sérum fœtal bovin (FBS), de L-glutamine (4 mM L-Glu) et des antibiotiques-pénicilline et streptomycine (50 unités / mL).
  2. Décapiter l’embryon juste en dessous de la ligne de la mâchoire à l’aide de ciseaux stériles(Figure 1A,ligne pointillée rouge). Retirez la mâchoire inférieure en insérant un point de la pince fine stérilisée #5 dans la bouche, en la gardant juste à l’intérieur de la joue. Poussez la pointe de la pince insérée jusqu’à ce qu’elle sorte de l’arrière du crâne.
  3. Orientez la pince, le long de la ligne jaune de la figure 1B,de sorte que l’autre côté de la pince (qui est toujours à l’extérieur de l’embryon) plane juste au-dessus du conduit auditif, puis pincez la pince fermée pour couper le tissu. Si nécessaire, passez une autre pince fine le long de la couture de la pince maintenant fermée pour couper à travers tout tissu qui n’a pas été complètement sectionné par le pincement.
  4. Répétez l’étape précédente pour l’autre côté de la tête de l’embryon. Continuez la procédure de pincement pour enlever complètement la mâchoire inférieure, la langue et la partie inférieure du crâne et exposer les étagères palatales.
  5. Retirez le crâne du crâne en coupant juste au-dessus des yeux, comme le montre la figure 1C (ligne verte). Pour ce faire, placez la tête sur son côté gauche ou droit et positionnez les pointes des petits ciseaux en acier inoxydable devant et derrière le crâne juste au-dessus du niveau des yeux de l’embryon. Coupez le haut du crâne avec une seule prise rapide des ciseaux, créant une surface plane qui sera importante pour la stabilité dans les étapes ultérieures et qui devrait ressembler à la figure 1D lorsqu’elle est vue de côté.
  6. Placez la partie restante de la tête à l’envers, l’aspect supérieur de la tête (crâne enlevé) reposant à plat sur le fond du plat, ce qui fournira une surface stable pour le retrait de l’étagère palatale. Prenez un moment pour identifier les étagères palatales, qui sont maintenant exposées et tournées vers le haut et qui apparaîtront comme deux crêtes surélevées de chaque côté d’une rainure centrale dans la moitié antérieure de la tête (Figure 1E).
  7. Épinglez la partie restante de la tête au plat pour l’immobiliser pendant que les étagères sont retirées. Pour ce faire, insérez un point d’une pince fine à travers le tissu près de la région nasale de la tête, antérieure aux étagères palatales, et insérez l’autre point de la pince à travers la base du crâne, postérieure aux étagères palatales. Maintenez-les en place tout en effectuant l’excision des étagères palatales.
    1. En immobilisant la tête d’une seule main, choisissez l’une des deux étagères à retirer en premier, insérez les deux points d’une deuxième paire de pinces fines dans le tissu à la base de la surface latérale de l’étagère, et pincez pour couper le tissu (Figure 1F). Répétez cette opération le long de la base de la surface médiale de l’étagère, puis aux extrémités antérieure et postérieure de l’étagère pour vous détacher de la tête.
  8. Soulevez doucement l’étagère, en faisant des pincements supplémentaires, au besoin, pour libérer complètement l’étagère du tissu environnant.
  9. Répétez les deux étapes précédentes pour retirer la deuxième étagère palatale.
  10. Les étagères palatales pouvant maintenant être libérées des tissus environnants et placées dans du PBS(figure G),utilisez une pipette de transfert d’ampoule en plastique stérile pour aspirer les étagères de la pipette et transférez-les dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL avec environ 500 μL de PBS. Gardez les tubes contenant des étagères palatales sur de la glace pendant que le reste de la litière est traité de la même manière.
    REMARQUE: Alternativement, les étagères peuvent être placées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant de la trypsine pré-avertie (0,25%) immédiatement après la dissection (au lieu de les placer sur de la glace). Les échantillons seront plus frais, mais il faut veiller à chronométrager toutes les étapes de la procédure pour chaque échantillon individuel plutôt que de traiter les échantillons collectivement.

3. Culture de cellules MEPM

REMARQUE: Dans les conditions décrites ici, les cellules épithéliales du palais ne survivent pas au premier passage, ce qui entraîne une culture cellulaire mésenchymateuse du palais pur. Utilisez une technique stérile pour effectuer toutes les étapes dans une hotte de culture tissulaire.

  1. Aspirer et jeter le PBS du tube de 1,5 mL, en prenant soin de ne pas jeter les étagères dans le processus. Ajouter immédiatement 200 μL de trypsine préchavée (37 °C) (0,25 %) à chaque tube contenant des étagères palatines. Pipetez brièvement les étagères de haut en bas dans la trypsine à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 μL pour accélérer la trypsinisation.
  2. Incuber les tubes pendant 5 min à 37 °C, puis pipet chaque échantillon de haut en bas pour aider à briser le tissu. Incuber les tubes pendant encore 5 min à 37 °C, et pipet de haut en bas une fois de plus pour compléter la dissociation du tissu.
    REMARQUE: Les étagères doivent être complètement ou presque complètement dissociées et suspendues dans la trypsine sans qu’il ne reste de morceaux de tissu visibles.
  3. Ajouter 800 μL de milieu de culture MEPM (étape 2.1) à chaque tube de 1,5 mL. Centrifuger le tube de 1,5 mL à 200 × g pendant 5 min pour granuler les cellules. Retirer le surnageant et ressusser la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture MEPM.
  4. Plaquer les cellules MEPM dans une plaque traitée par culture tissulaire de 6 puits contenant un milieu de culture MEPM. Laisser les cellules adhérer à la surface plastique pendant 12 h à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2.
    REMARQUE: Après une incubation d’une nuit, la grande majorité (~ 90%) des cellules se fixeront. À ce stade, les cellules adhérentes auront l’air assez homogènes, avec une forme triangulaire ou légèrement allongée.
  5. Changez le milieu tous les jours en aspirant doucement l’ancien milieu et en le remplaçant immédiatement par 1 mL de PBS stérile chaud sans calcium ni magnésium pendant environ 1 min. Aspirer le PBS et le remplacer par 3 mL de milieu de culture MEPM préwargé.
  6. Passage des cellules une fois qu’elles deviennent 100% confluentes.
    REMARQUE: Les cellules MEPM devraient proliférer en doublant en nombre presque quotidiennement.
    1. Pour passer les cellules, aspirez doucement l’ancien milieu et remplacez-le immédiatement par du PBS chaud sans calcium ni magnésium pendant environ 1 min. Aspirez le PBS et remplacez-le par 0,5 mL de trypsine préwarmée à 0,25%.
    2. Incuber à 37 °C pendant environ 5 min, ou jusqu’à ce que les cellules se détachent de la surface du plat lorsqu’elles sont doucement bercées d’avant en arrière à la main. Une fois que les cellules se sont détachées, ajoutez immédiatement 5 mL de milieu de culture MEPM pré-averti aux cellules trypsinisées.
    3. À l’aide d’un tuyau sérologique de 10 mL, prélever doucement les cellules dans un tube conique de 15 mL et centrifuger le tube à 200 × g pendant 5 min pour granuler les cellules. Aspirer la trypsine et le milieu, et ressusser les cellules dans 3 mL de milieu de culture MEPM préwarmé. Pipetez doucement 1 mL de cellules dans un seul puits d’un plat de 6 puits et ajoutez 2 mL de milieu de culture MEPM pour porter le volume total à 3 mL.
      REMARQUE : Il s’agit d’une division 1:3 des cellules. Les députés européens peuvent être adoptés jusqu’à trois fois. La densité d’ensemencement des MEPM est quelque peu flexible et le nombre de cellules présentes varie en fonction du récipient de culture. Cependant, les DÉPUTÉS ne prolifèrent pas correctement lorsqu’ils sont divisés trop peu et devraient être confluents d’au moins 20 à 25% dans leur nouveau plat une fois qu’ils adhèrent.

4. Cryoconservation des cellules MEPM

  1. Une fois que les cellules MEPM trypsinisées sont granulées, ressuspendez les cellules dans un milieu de culture MEPM pour obtenir une concentration de ~ 1 × 106 cellules / mL. Pipet les cellules en cryoviales et ajouter une concentration finale de 5% de diméthylsulfoxyde dans le stock cellulaire. Coiffez le cryovial, mélangez brièvement en inversant et placez immédiatement les flacons dans un récipient de congélation qui refroidit à une vitesse de 1 °C/min.
  2. Placez la glacière dans un congélateur à -80 °C pendant la nuit. Le lendemain, déplacez les cryoviaux dans un réservoir d’azote liquide pour un stockage à long terme.
  3. Décongélation des cellules MEPM cryoconservées
    1. Retirez les cryoviaux du réservoir d’azote liquide et décongelez à température ambiante jusqu’à ce que le contenu commence à devenir liquide. Videz le contenu dans un tube conique de 15 mL contenant 9 mL de milieu de culture MEPM préwarmé.
    2. Centrifugez le tube à 200 × g pour granuler les cellules. Resuspendez les cellules dans 1 mL de milieu de culture MEPM et pipetez les cellules dans un seul puits d’une plaque de 6 puits. Ajouter 2 mL de milieu de culture MEPM chaud pour porter le volume total à 3 mL.
    3. Culture des cellules à 37 °C dans un incubateur avec 5% de CO2. Changez le support tous les jours.

5. Imagerie en direct des cellules MEPM - Essai de migration collective 2D (Figure 2)

  1. Préparez une plaque à utiliser pour l’imagerie en direct.
    1. Utilisez de petits ciseaux chirurgicaux ou un scalpel pointu pour raccourcir un insert stérile en silicone à 2 puits à une hauteur d’environ 1 mm. Préparez un encart pour chaque échantillon utilisé.
    2. À l’aide d’une pince, placez l’insert en silicone raccourci à 2 puits au centre d’un puits d’une plaque à 6 puits. Appuyez sur tous les bords pour vous assurer qu’il est entièrement adhéré.
  2. Décongeler les cellules cryoconservées en suivant les étapes de la section 4.3 du présent protocole. Compter les cellules MEPM et ensemencer 300 cellules/mm2 des inserts en silicone raccourcis dans un volume total de 40 à 50 μL de milieu de culture MEPM par puits. Culture des cellules pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur avec 5% de CO2.
  3. Le lendemain, préparez-vous à l’imagerie time-lapse en direct.
    1. Utilisez un microscope à contraste de phase avec un incubateur sur scène et une capacité d’imagerie automatique. Ajouter de l’eau au réservoir de l’incubateur sur scène pour réduire l’évaporation du milieu de culture; régler la température à 37 °C et le CO2 à 5 %. Laissez ~30 min pour que l’humidité s’accumule avant de placer le plat à 6 puits dans l’incubateur sur scène.
  4. Utilisez des paramètres équivalents aux suivants pour l’imagerie accélérée.
    1. Sélectionnez l’objectif 4x pour avoir de grands champs de vision et un filtre de contraste de phase.
      REMARQUE: L’autofocus, l’échantillon de recherche automatique, la pile z et l’éclairage automatique ne sont généralement pas nécessaires.
    2. Sélectionnez deux champs microscopiques par puits pour capturer la lumière des inserts en silicone raccourcis. Assurez-vous que toutes les positions d’imagerie ont la mise au point correcte.
      REMARQUE: Les plans d’image peuvent être ajustés pendant l’imagerie, mais un tel ajustement n’est généralement pas nécessaire.
    3. Sélectionnez le type de fichier de sortie d’image souhaité, puis sélectionnez ou désélélez les options de post-imagerie, telles que la création vidéo automatique et les filigranes, selon vos besoins. Le cas échéant, sélectionnez le contraste de phase comme mode d’imagerie.
      REMARQUE : L’utilisation de filigranes peut entraver les étapes de traitement d’image ultérieures.
    4. Réglez la durée de l’enregistrement sur 72 h. Configurez le programme pour capturer des images toutes les 10 minutes.
      REMARQUE: Habituellement, seulement 48 heures d’imagerie sont nécessaires, mais l’imagerie peut être arrêtée à tout moment avant la marque de 72 heures sans perdre les images qui ont déjà été prises.
    5. Assurez-vous que la chambre environnementale est opérationnelle comme l’exige la section 5.3.1. Enregistrez ces paramètres(la routine)et commencez l’imagerie.
  5. Poursuivez l’imagerie jusqu’à 72 h (ou l’heure spécifiée).

6. Imagerie en direct des cellules MEPM dans un essai de réparation des plaies (Figure 3)

  1. Préparez une plaque à utiliser pour l’imagerie en direct. À l’aide d’une pince, placez un insert stérile en silicone à 2 puits au centre d’un puits d’une plaque à 6 puits et appuyez sur tous les bords pour vous assurer qu’il est pleinement adhéré. Préparez un insert à 2 puits pour chaque échantillon utilisé.
  2. Décongeler les cellules cryoconservées en suivant les étapes de la section 4.3 du présent protocole. Compter les cellules MEPM et, si nécessaire, concentrer les cellules à au moins 350 cellules/μL.
  3. Ensemencez 1400 cellules/mm2 dans les inserts en silicone dans un volume de 100 μL de milieu de culture MEPM par puits. Culturez les cellules pendant 48 h à 37 °C dans un incubateur avec 5% de CO2, et changez le milieu tous les jours.
  4. Après 48 h, préparez un microscope pour l’imagerie time-lapse en direct comme décrit aux rubriques 5.3 et 5.4. Immédiatement avant de placer les cellules dans l’incubateur sur scène, ajoutez 3 mL de milieu de culture MEPM préwarmé au puits (mais à l’extérieur des inserts), puis retirez soigneusement les inserts en silicone.
    NOTE: Le mur séparant les 2 chambres laisse un espace qui est la « plaie ».
  5. Démarrez l’imagerie time-lapse comme décrit à la section 5.4, avec les différences suivantes :
    1. Utilisez un objectif de grossissement plus élevé (p. ex., 10x). Pour capturer la fermeture de la plaie, sélectionnez 5 champs de vision le long de chaque plaie, de sorte que la plaie soit parallèle à l’axe vertical de l’image.
  6. Arrêtez l’imagerie après 72 h ou lorsque les plaies sont complètement fermées.

7. Analyse computationnelle de séquences d’images time-lapse

Remarque : Effectuez les procédures suivantes sur un ordinateur équipé d’outils de calcul standard, tels que l’interpréteur python, le compilateur C et un shell (voir la Table des matériaux).

  1. Analyse de la confluence
    REMARQUE: Cette procédure peut être utilisée pour estimer la prolifération cellulaire dans une culture clairsemée ou pour quantifier les expériences de fermeture de plaie. Pour détecter les zones occupées par les cellules, un seuil de segmentation est appliqué à l’écart type local de luminosité de l’image. Le code a été décrit précédemment par Wu et al.33 et Neufeld et al.34 et est disponible à http://github.com/aczirok/cellconfluency.
    1. Déterminez le seuil de segmentation des images. Par exemple, pour voir la segmentation avec un seuil 4, exécutez la commande
      segment.py -i inout-image.jpg -S 4 -test sortie.jpg
      puis vérifiez la sortie (sortie.jpg).
      REMARQUE: Si le seuil est trop bas, les zones d’arrière-plan de la micrographie sont classées comme étant couvertes de cellules. En revanche, si le seuil est trop élevé, les zones couvertes de cellules ne sont pas classées comme telles. La valeur seuil optimale réduit au minimum les deux erreurs.
    2. Utilisez le script area.sh fourni pour calculer les valeurs de confluence d’une séquence d’images en tant que
      area.sh -S 4 img_001.jpg img_002.jpg .... > la confluence.dat
      Remarque : La valeur de seuil de discrimination 4 est vérifiée à l’étape 1 et les résultats sont stockés dans la confluencedu fichier.dat . En triant les images dans les dossiers appropriés, la liste des noms de fichiers image peut être remplacée par une notation générique :
      area.sh -S4 * .jpg > la confluence.dat
    3. Pour les expériences de fermeture de plaie, transformer les données de confluence A(t)- la taille de la zone couverte de cellules exprimée en pourcentage en fonction de la vitesse de propagation du temps dans le bord de la plaie V comme
      figure-protocol-1
      où w indique la largeur du champ et dA/dt est la dérivée temporelle de A(t), c’est-à-dire le taux d’expansion de la zone couverte de cellules.
  2. Carte de motilité cellulaire
    1. Exécutez un algorithme de vélocimétrie d’image de particules (PIV) pour caractériser la motilité cellulaire et extraire l’étendue du mouvement local « flux optique » entre les paires d’images, mais pas pour identifier les cellules individuelles.
      REMARQUE: Ici, une taille de fenêtre initiale de 50 μm est utilisée, comme décrit en détail par Zamir et al.35 et Czirok et al.36, avec une taille de fenêtre initiale de 50 μm. L’analyse PIV donne un champ de vitesse v(x,t) pour chaque image d’image t et emplacement (dans l’image) x.
    2. Extraire la vitesse moyenne de la motilité cellulaire de v(x,t) sous forme de moyenne spatiale calculée sur la zone occupée par la cellule, telle que déterminée à la section 7.1.
  3. Suivi manuel des cellules
    REMARQUE: Bien que l’analyse PIV fournisse une évaluation automatique de la motilité cellulaire, se concentrer sur le comportement des cellules individuelles nécessite souvent un suivi manuel. Bien que plusieurs outils offrent cette fonctionnalité, il est très utile que les marqueurs positionnés manuellement puissent être modifiés après leur placement initial et que le suivi puisse être effectué à la fois vers l’avant et vers l’arrière dans le temps.
    1. Effectuez un suivi des cellules avec un outil Python personnalisé (http://github.com/donnagreta/cm_track), qui fournit également des fonctions d’éditeur de base telles que la suppression de segments de trajectoire.
      REMARQUE: Cet outil de suivi manuel donne les positions P (i, t) de la cellule i au temps t dans un fichier texte et appelée comme
      cm_track.py -i images/ -o track.dat
      où les images time-lapse se trouvent dans le dossier images/ et les données de position sont collectées dans la piste de fichier.dat (Figure 4).

figure-protocol-2
Figure 4: Analyse des trajectoires cellulaires individuelles. (A) Les micrographies time-lapse à contraste de phase sont soumises à (B, C) une procédure de suivi manuel, qui marque les cellules (points verts). (D) Les positions des cellules (x,y) sont stockées pour chaque cellule distinguée par son ID et pour chaque image f. (E) Les trajectoires peuvent être superposées sur les micrographies et codées par couleur pour indiquer des informations temporelles. Par exemple, dans chaque trajectoire, une palette de couleurs bleu à rouge indique progressivement des segments de trajectoire ultérieurs, le rouge et le bleu marquant respectivement les emplacements des cellules initiales et finales. (F) Diverses propriétés statistiques des trajectoires, telles que le déplacement carré moyen, peuvent être extraites et utilisées pour caractériser la motilité de diverses populations cellulaires, qui dans cet exemple incluent les cellules MEPM de type sauvage (wt, bleu) et knockdown (kd, rouge). Les barres d’échelle représentent 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Superposer des trajectoires sur des images à l’aide d’un deuxième outil, appelé en tant que
    visdat.py -d track.dat -i images/ -o superposition/ -l999 -r3 -C2
  2. Collectez les images avec les trajectoires superposées dans la superposition de dossier.
    Remarque : Dans cet exemple, les données de position de cellule sont stockées dans la piste de fichier.dat, tandis que la séquence d’images time-lapse se trouve dans les images de dossier. Le reste des paramètres contrôle la longueur maximale des trajectoires dessinées (-l), la taille des symboles (-r) et le jeu de couleurs (-C) utilisé.
  1. Analyse des trajectoires cellulaires individuelles
    1. Caractériser les trajectoires par la longueur totale du trajet
      figure-protocol-3,
      et déplacement net vers la plaie
      figure-protocol-4,
      où X désigne la projection de P dans la direction perpendiculaire à la plaie : la coordonnée x des positions lorsque la plaie est parallèle à l’axe y.
    2. Calculer l’efficacité de guidage comme figure-protocol-5 pour chaque cellule i et point de temps t37. Caractériser les cultures par la moyenne de population de ces mesures unicellulaires, évaluées à un point temporel approprié t.
  2. Mouvement de flux collectif des cellules
    1. Caractériser les corrélations spatiales locales des mouvements cellulaires par la vitesse moyenne d’autres cellules qui se trouvent à proximité d’une cellule en mouvement, comme décrit précédemment38,39.
      REMARQUE: Le code de calcul est disponible à https://github.com/aczirok/flowfield.
      1. Aligner un système de référence avec les directions avant, arrière, gauche et droite à chaque vecteur v(x,t) (Figure 5A). Assignez chacune des cellules environnantes ou vecteur de vitesse PIV à la cellule spatiale appropriée du système de référence (Figure 5B). Répétez la procédure car chaque vecteur sert d’origine aux systèmes de référence(Figure 5C,D)afin qu’un vecteur vitesse donné soit affecté à plusieurs bacs.
        REMARQUE : Un point de données peut se présenter devant un vecteur et à gauche d’un autre.
      2. Faites pivoter les systèmes de référence dans une orientation commune (Figure 5C, F) et mettez-les en commun ( Figure5G).
        REMARQUE: La moyenne de chaque bac des données de vitesse regroupées est un vecteur de vitesse (U) qui est indicatif de corrélation spatiale: la moyenne est une mesure d’une composante de vitesse partagée (Figure 5H).
      3. Ajuster les champs d’écoulement U(x) avec une fonction exponentielle figure-protocol-6 , où a, x0 et U0 sont des paramètres d’ajustement. Parmi les trois paramètres d’ajustement, concentrez-vous sur x0, la longueur de corrélation(Figure 5I,J),qui est la distance caractéristique où les corrélations vitesse-vitesse locales disparaissent.

figure-protocol-7
Figure 5: Caractérisation de la formation de flux de cellules cultivées. (A,D) Des images time-lapse à contraste de phase de la figure 4A sont utilisées pour identifier les mouvements cellulaires. Pour chaque cellule en mouvement, un cadre de référence (bleu) et des bacs spatiaux (blancs) ont été co-alignés pour catégoriser les cellules adjacentes comme étant à l’avant, à l’arrière, à gauche ou à droite. (B,E) La vitesse des cellules adjacentes (vecteurs noirs) était liée au même cadre de référence (C,F). Cette procédure a été répétée pour chaque cellule et chaque point temporel. (G) Après avoir regroupé ces informations locales, chaque bac contiendra plusieurs vecteurs de vitesse (gris), qui peuvent être moyenés pour déterminer la vitesse moyenne de co-déplacement (flèches magenta) à divers endroits par rapport à une cellule mobile moyenne. (H) La carte de vitesse moyenne caractérise donc les vitesses typiques des cellules à divers endroits par rapport à une cellule en mouvement. (I,J) Enfin, ce champ a été échantillonné le long de l’axe avant-arrière (parallèle) et également le long de l’axe gauche-droite (perpendiculaire). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Résultats

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La dissection des étagères palatales est illustrée à la figure 1. La séquence d’incisions est conçue pour minimiser le glissement du tissu. Après le retrait de la tête (Figure 1A, B), la mâchoire inférieure est retirée ( Figure1B, C). L’incision de la partie supérieure de la tête (Figure 1C, D) est faite pour stabiliser le tissu lorsqu’il est placé à l’...

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Discussion

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L’élévation du plateau palatal constitue un événement de remodelage vertical à horizontal1,3,4,9,11. Il est postulé que ce processus de remodelage nécessite que les cellules mésenchymateuses du plateau palatal se comportent de manière coordonnée. Les analyses avec des cellules MEPM de type sauvage montrent que ce comportement cellulaire est intrinsèque et peut...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce projet a été soutenu en partie par les subventions des National Institutes of Health DE026172 (I.S.) et GM102801 (A.C.). I.S. a également été soutenu en partie par la subvention du Center of Biomedical Research Excellence (COBRE) (National Institute of General Medical Sciences P20 GM104936), la subvention du Kansas IDeA Network for Biomedical Research Excellence (National Institute of General Medical Sciences P20 GM103418) et la subvention du Kansas Intellectual and Developmental Disabilities Research Center (KIDDRC) (U54 Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, HD090216).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bécher, 250 mL (x2)Fisher ScientificFB-100-250
CO2Matheson GasUN1013
Tubes coniques, 15 mL (x1)Midwest ScientificC15B
Systèmeanalyse computationnelle d’images en accéléré
Dulbecco’s Modified Eagles Medium/High Glucose avec 4 mM L-glutamine et pyruvate de sodiumCytiva Life SciencesSH30243.01
EtOH, 100 %Decon Laboratories2701
EVOS FL AutoThermoFisher ScientificAMAFD1000
EVOS Onstage Vessel Holder, plaques multi-puitsThermoFisher ScientificAMEPVH028
Sérum fœtal bovinCorning35-010-CV
Pointe fine #5 Pince en acier inoxydable (x2)Fine Science Tools11295-10
Dissection Instrument stérilisateur bain de perlesFine Science Tools18000-45
Tubes de micro-cetterie, 1.5mLAvant2925
Ciseaux de micro-dissection en acier inoxydable, droitsRobozRS-5910Dissection
NucBlue (Hoechst) Sondes Live Ready ThermoFisherScientificR37605
Pénicilline Streptomycine Solution, 100xCorning30-002-CI
Insert en silicone, 2 puitsIbidi80209
Petite cuillère perforée en acier inoxydableOutils scientifiques finsMC17Cdissection
Ciseaux, 4 mmOutils de science fine15018-10
Dishe(s) stérile(s) de 10 cm(s)Corning430293
Plaque(s) stérile(s) à 12 puitsPR1MA667512
Plaque(s) stérile(s) à 6 puitsThermoFisher Scientific140675
Stérile PBSCorning21-031-CV
Pipettede transfert à bulbe stérile en plastiqueThermoFisher Scientific202-1S
Trypsine, 0,25 %ThermoFisher Scientific25200056
d’exploitation Debian EVOS Onstage Incubator ThermoFisher Scientific AMC1000 Ressort de

Références

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