Utilisation de l’outil E1A Minigene pour étudier les changements d’épissage de l’ARNm

Résumé

Ce protocole présente un outil rapide et utile pour évaluer le rôle d’une protéine avec la fonction uncaracterized dans le règlement d’épissage alternatif après traitement chimiothérapeutique.

Résumé

Le traitement de l’ARNm implique plusieurs étapes simultanées pour préparer l’ARNm à la traduction, telles que le capsulage 5', l’addition de poly-A et l’épissage. Outre l’épissage constitutif, l’épissage alternatif de l’ARNm permet l’expression de protéines multifonctionnelles à partir d’un gène. Comme les études d’interactome sont généralement la première analyse pour des protéines nouvelles ou inconnues, l’association de la protéine appât avec des facteurs d’épissage est une indication qu’elle peut participer au processus d’épissage de l’ARNm, mais déterminer dans quel contexte ou quels gènes sont régulés est un processus empirique. Un bon point de départ pour évaluer cette fonction est l’utilisation de l’outil minigène classique. Ici nous présentons l’utilisation adenoviral de minigene d’E1A pour évaluer les changements alternatifs d’épissage après différents stimulus cellulaires d’effort. Nous avons évalué l’épissage du minigène E1A dans HEK293 surexprimant de manière stable la protéine Nek4 après différents traitements de stress. Le protocole comprend la transfection de minigène e1A, le traitement cellulaire, l’extraction d’ARN et la synthèse d’ADNc, suivis de l’analyse de PCR et de gel et de la quantification des variantes épissées d’E1A. L’utilisation de cette méthode simple et bien établie combinée à des traitements spécifiques est un point de départ fiable pour faire la lumière sur les processus cellulaires ou sur les gènes qui peuvent être régulés par l’épissage de l’ARNm.

Introduction

L’épissage est parmi les étapes les plus importantes dans le traitement eucaryote de l’ARNm qui se produit simultanément au capsulage de l’ARNm 5 et à la polyadénylation de l’ARNm 3', comprenant l’élimination de l’intron suivie d’une jonction d’exon. La reconnaissance des sites d’épissage (SS) par l’spliceosome, un complexe ribonucléoprotéine contenant de petites ribonucléoprotéines (snRNP U1, U2, U4 et U6), de petits ARN (snRNAs) et plusieurs protéines régulatrices¹ est nécessaire pour l’épissage.

Outre l’élimination des introns (épissage constitutif), chez les eucaryotes, les introns peuvent être conservés et les e....

Protocole

1. Placage des cellules

REMARQUE: Dans ce protocole décrit, les lignées cellulaires stables HEK293, précédemment générées pour une expression inductible stable de Nek4 ont été utilisées^21,cependant, le même protocole convient à de nombreuses autres lignées cellulaires, telles que HEK293^22,HeLa^{23, 24,25, 26,}U-2 OS^27,COS7^28,SH-SY5Y^29. Le modèle d’expression des isoformes du minigène E1A dans des cond....

Résultats

Un 5' l’analyse d’emplacements d’épissure utilisant le minigene d’E1A a été exécutée pour évaluer des changements de l’épissage du profil en cellules après exposition de chimiothérapie. Le rôle de Nek4 - isoform 1 dans la régulation AS dans les cellules stables HEK293 après que le traitement de paclitaxel ou de cisplatin ait été évalué.

La région adénovirale E1A est responsable de la production de trois ARNm principaux à partir .......

Discussion

Les minigènes sont des outils importants pour déterminer les effets de l’épissage alternatif global in vivo. Le minigène adénoviral E1A est utilisé avec succès depuis des décennies pour évaluer le rôle des protéines en augmentant la quantité de celles-ci dans la cellule^13,14. Ici, nous proposons l’utilisation du minigene E1A pour évaluer l’épissage alternatif après exposition chimiothérapeutique. Une variété de cellule stable exprimant l’isoforme 1 de Nek4 a été .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Échelle à ADN 100 pb	Invitrogen	15628-050
Plaque 6 puits	Sarstedt	833920
Agarose	Sigma	A9539-250G
Cisplatine	Sigma	P4394
DEPC eau	ThermoFisher	AM9920
DMEM	ThermoFisher	11965118
dNTP mix	ThermoFisher	10297-018
Sérum fœtal bovin - FBS	ThermoFisher	12657029
Microscope fluorescent	Leica	DMIL LED FLUO
Système d’acquisition d’imagerie sur gel - ChemiDoc Gel Imagin System	Bio-Rad
GFP - pEGFPC3	Clontech
HEK293 cellules stables - HEK293 Flp-In			Généré par Flp-In&trade ; T-REx&commerce ; 293 - Invitrogen et décrit dans la réf 21
Hygromycine B	ThermoFisher	10687010	Utilisé pour la maintenance des cellules Flp-In
Logiciel de traitement et d’analyse d’images - Logiciel			réf. 32
Réactif de transfection à base de lipides - jetOPTIMUS Polyplus Réactif	Polyplus	117-07
Oligo DT	ThermoFisher	18418020
Paclitxel	Invitrogen	P3456
Lecteur de plaques/ Absorbance UV	Biotech		Epoch Biotek/ Take3
pMTE1A plasmide			Fourni par Dr. Adrian Krainer
pMTE1A F	Invitrogen	; 5' -ATTATCTGCCACGGAGGTGT-3
pMTE1A R	Invitrogen	5' -GGATAGCAGGCGCCATTTTA-3'
Centrifugeuse réfrigérée	Eppendorf	F5810R
Transcriptase inverse - M-MLV	ThermoFisher	28025013
Transcriptase inverse - Exposant IV	ThermoFisher	18090050
Inhibiteur de la ribunucase ARNASE OUT	ThermoFisher	10777-019
Réactif à base de phénol-chloroforme d’extraction d’ARN - Trizol	ThermoFisher	15596018
SybrSafe Coloration au gel d’ADN	ThermoFisher	S33102
Taq Platinum	Thermo	10966026
Tetracyclin	Sigma	T3383	Utilisé pour l’induction de l’expression du drapeau vide ou Nek4-
Flag Thermocycleur Bio-Rad	Bio-Rad	T100
Trypsine	Sigma	T4799

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