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Article de méthode

Établir un système de culture de sphéroïdes épidermiques à haut débit pour modéliser la plasticité des cellules souches kératinocytes

3.1K vues

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DOI :

10.3791/62182

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30 janvier 2021

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1Department of Pathology, Microbiology and Immunology, University of South Carolina School of Medicine, 2Department of Dermatology, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine Baltimore, 4Department of Pathology, Albert Einstein College of Medicine, 5Department of Pediatrics, Vanderbilt University Medical Center, 6Department of Drug Discovery and Biomedical Sciences, College of Pharmacy, University of South Carolina

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici un protocole pour la culture systématique de sphéroïdes épidermiques en culture en suspension 3D. Ce protocole a de nombreuses applications pour une utilisation dans une variété de types de tissus épithéliaux et pour la modélisation de plusieurs maladies et affections humaines.

Résumé

La dérégulation épithéliale est un nœud pour une variété de conditions et de maux humains, y compris les blessures chroniques, l’inflammation et plus de 80% de tous les cancers humains. En tant que tissu de la muqueuse, l’épithélium cutané est souvent sujet à des blessures et s’est adapté à l’évolution en acquérant la plasticité cellulaire nécessaire pour réparer les tissus endommagés. Au fil des ans, plusieurs efforts ont été déployés pour étudier la plasticité épithéliale à l’aide de modèles cellulaires in vitro et ex vivo. Cependant, ces efforts ont été limités dans leur capacité à récapituler les différentes phases de la plasticité des cellules épithéliales. Nous décrivons ici un protocole pour générer des sphéroïdes épidermiques 3D et des cellules dérivées de sphéroïdes épidermiques à partir de kératinocytes humains néonatals primaires. Ce protocole décrit la capacité des cultures de sphéroïdes épidermiques à modéliser fonctionnellement des stades distincts de la plasticité générative des kératinocytes et démontre que le repoingage des sphéroïdes épidermiques peut enrichir les cultures hétérogéniques normales de kératinocytes humains (NHKc) pour les sous-populations de kératinocytes intégriens (NHKc) pour les sous-populations de kératinocytesintégriens hi/EGFRlo présentant des caractéristiques améliorées semblables à celles de la tige. Notre rapport décrit le développement et le maintien d’un système à haut débit pour l’étude de la plasticité kératinocytaire cutanée et de la régénération épidermique.

Introduction

L’épithélium stratifié des mammifères est l’architecture épithéliale la plus complexe de tous les systèmes vivants et est le plus souvent sujet à des dommages et à des blessures. En tant que tissu protecteur, l’épithélium stratifié a évolué pour générer une réponse complexe et efficace aux lésions tissulaires. En cas de blessure, ces cellules doivent activer des programmes de plasticité de lignée, qui leur permettent de migrer vers le site blessé et d’effectuer des réparations1,2,3. Cette réponse multiforme se produit en plusieurs étapes séquentielles qui restent mal comprises.

Un obstacle majeur dans l’étude du processus complexe de régénération épithéliale réside dans la pénurie de systèmes modèles à haut débit qui peuvent capturer les activités cellulaires dynamiques à des stades définis de la régénération cellulaire. Alors que les modèles murins in vivo offrent des informations pertinentes sur la cicatrisation des plaies et récapitulent le plus fidèlement le processus de régénération humaine, leur développement nécessite des efforts laborieux et des coûts importants, limitant leur capacité de débit. Il existe donc un besoin critique d’établir des systèmes qui permettent l’étude fonctionnelle de la régénération des tissus épithéliaux humains à grande échelle.

Ces dernières années, plusieurs tentatives ont été faites pour relever le défi de l’évolutivité. Cela se voit à travers une grande expansion de modèles cellulaires in vitro et ex vivo innovants qui imitent étroitement le contexte régénératif in vivo. Cela inclut les progrès dans les organes sur puce4,le sphéroïde5,l’organoïde6et les cultures organotypiques7. Ces systèmes à base de cellules 3D offrent chacun des avantages uniques et présentent des limites expérimentales distinctes. À ce jour, la culture sphéroïde reste le modèle de culture cellulaire 3D le plus rentable et le plus utilisé. Et bien que plusieurs rapports aient indiqué que les cultures de sphéroïdes peuvent être utilisées pour étudier les caractéristiques des cellules souches de la peau, ces études ont été menées en grande partie avec des tissus animaux8,9ou avec des fibroblastes dermiques10,sans pratiquement aucun rapport caractérisant de manière approfondie les propriétés régénératrices des cultures de sphéroïdes épidermiques humains. Dans ce protocole, nous détaillons le développement fonctionnel, la culture et le maintien des cultures de sphéroïdes épidermiques à partir de kératinocytes humains normaux (NHKc). Nous décrivons également l’utilité de ce système pour modéliser les phases séquentielles de la régénération épidermique et de la plasticité des cellules souches kératinocytes in vitro.

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Protocole

Le protocole de prélèvement et de manipulation des échantillons de peau et d’isolement des kératinocytes humains a été examiné par l’IRB de l’Université de Caroline du Sud (UofSC) et classé comme « recherche n’impliquant pas de sujets humains », car les échantillons de prépuce étaient des rejets chirurgicaux produits lors d’interventions chirurgicales de routine (circoncision des nouveau-nés) et étaient complètement dépourvus d’informations d’identification. Le protocole a également été examiné et approuvé régulièrement par le Comité de la biosécurité de l’Université de la Sécurité, et tout le personnel de laboratoire a suivi une formation en matière de biosécurité en laboratoire. Toutes les procédures ont été menées conformément aux normes de sécurité et d’éthique de l’UofSC.

1. Isolement et culture de kératinocytes humains à partir de tissu prépuce néonatal

  1. Préparer le milieu de lavage en ajoutant un tampon HEPES de 0,1 M à 500 mL de milieu KSFM et l’ajuster à un pH de 7,2. Stériliser le milieu dans un filtre à vide de 500 mL (taille des pores de 0,22 μm). Le milieu basal MCDB 153-LB peut également être utilisé comme solution de lavage alternative à la place de KSFM.
  2. Dans une hotte à écoulement laminaire, laver le prépuce néonatal avec 5 mL de produit de lavage dans un tube conique de 50 mL. Répétez deux fois.
  3. Transférer le prépuce lavé dans une boîte de Petri stérile. À l’aide d’un scalpel et d’une pince, grattez les tissus conjonctifs adipeux et lâches de la couche dermique. Lavez à nouveau le prépuce avec 5 mL de produit de lavage dans un tube conique de 50 mL.
  4. Placer l’épiderme du prépuce vers le haut dans une plaque de 6 puits contenant 2 mL d’enzyme dispase diluée dans un milieu de lavage (50 U / mL).
  5. Transférer la plaque dans un incubateur pendant 4 heures (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  6. Retirez le prépuce de l’incubateur et, dans des conditions stériles, transférez-le dans une boîte de Pétri. À l’aide d’une pince à pointe fine, séparez l’épiderme de la couche de derme.
  7. Placer l’épiderme dans un tube conique de 15 mL contenant 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 %. À l’aide d’une pipette sérologique de 5 mL, écrasez mécaniquement l’épiderme flottant. Incuber pendant 15 min à 37 °C avec un vortex périodique pendant 5 s toutes les 5 min.
  8. Après l’incubation, ajouter 2 mL d’inhibiteur de la trypsine de soja et mélanger par pipetage pour neutraliser la trypsine.
  9. Suspension de cellule centrifuge pendant 2 min à 450 x g,puis pendant 8 min à 250 x g.
  10. Enlevez les débris flottants avec des pinces, en veillant à ne pas déloger la pastille de cellule. Aspirer soigneusement le surnageant de la pastille cellulaire.
  11. Resuspendez la pastille dans 12 mL de milieu KSFM-scm complet et la plaque dans un plat de 10 cm. Incuber le plat pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  12. Le lendemain, retirez le milieu à l’aide d’une pipette aspirante et remplacez-le par 12 mL de KSFM-scm complet. Répétez les jours 4 et 7.
  13. Pour maintenir une croissance optimale des cultures normales de kératinocytes humains (NHKc), les cellules de passage 1:5 au jour 10 pour empêcher les cellules d’atteindre une confluence supérieure à 80%.

2. Génération de cultures d’épidermosphère cutanée in vitro

  1. Préparer un mélange d’agarose à 5 % en ajoutant 2,5 g d’agarose à 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), dans une bouteille en verre de 50 mL. Bouteille autoclave sous cycle liquide. Laisser refroidir à température ambiante.
  2. Pour préparer les plaques, placez la bouteille en verre refroidie contenant une solution d’agarose dans un bécher en plastique de 1 L rempli de 200 mL d’eau désionisée (dH2O). Faire fondre le mélange d’agarose dans un micro-ondes de qualité recherche pendant 2 minutes, en mélangeant la gélose toutes les 60 s en inclinant doucement la bouteille d’un côté à l’autre.
    ATTENTION: La fonte de la gélose au micro-ondes rendra le récipient de la fiole extrêmement chaud, ce qui entraînera une accumulation de pression. Relâchez l’accumulation de pression toutes les 30 s. Portez un équipement de protection approprié pour éviter les blessures.
  3. Ajouter 3 mL d’agarose fondue à 5 % à 12 mL de KSFM-scm préchafait à 42 °C pour une concentration finale de 1 % d’agarose (poids/vol).
    En option : préchauffez les pipettes sérologiques et les embouts de pipette pour éviter la polymérisation prématurée de la gélose souple.
  4. Pipeter rapidement 200 μL du mélange de gélose à 1 % dans des puits individuels d’une plaque à fond rond de 96 puits à l’aide d’un pipetteur multicanal(Figure 1A). Laisser la plaque dans un environnement stérile à 25 °C pendant 4 h pour permettre à l’agarose de polymériser complètement.
    REMARQUE: L’expérimentation peut être arrêtée ici et poursuivie le lendemain. Les plaques d’agarose polymérisées peuvent être maintenues à 37 °C jusqu’à 24 h ou à 4 °C jusqu’à 48 h lorsqu’elles sont scellées avec une pellicule parafilm. Plaque chaude à 37 °C dans un incubateur humidifié pendant au moins 1 h avant utilisation.
  5. Passage de NHKc formant des sphéroïdes par aspiration de milieux et cellules de lavage dans 2 mL de PBS. Aspirer le PBS et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % aux cellules lavées. Incuber pendant 5 min à 37 °C ou jusqu’à ce que toutes les cellules se détachent complètement. Ajouter 2 mL d’inhibiteur de la trypsine de soja à la plaque et laver les cellules de la plaque dans un tube de 15 mL. Centrifuger à 250 x g pendant 5 min.
  6. Resuspendez la pastille dans 1 mL de PBS. Quantifiez la viabilité cellulaire à l’aide d’une coloration au bleu de trypan et d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
  7. Aliquote 2 x 104 NHKc dans 100 μL de KSFM-scm et ensemencer dans des puits individuels de plaque à fond rond de 96 puits préalablement préparée. Incuber la plaque pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  8. À l’aide d’un microscope à contraste de phase inversée, analysez bien ensemencé pour la formation d’épidermosphère.
    REMARQUE: Les épidermosphères humaines provenant de kératinocytes humains normaux peuvent rester viables en culture en suspension 3D jusqu’à 96 h, bien qu’avec une diminution considérable de la viabilité cellulaire (Figure 2).

3. Test de re-placage sphéroïde épidermique

  1. 24-48 h après la formation de l’épidermosphère 3D, ajoutez 4 mL de KSFM-scm préwarmed à un plat de 6 cm. Utilisez une pointe de pipette de 1 mL à large alésage pour transférer un seul sphéroïde sur la plaque, en veillant à ne pas la briser. Alternativement, élargissez une pointe de pipette de 1 mL à l’aide d’une lame de rasoir stérile pour couper la pointe.
  2. Incuber la plaque pendant la nuit (37 °C, 5 % de CO2,95 % d’humidité).
  3. Analyser le sphéroïde ensemencé pour la fixation au bas de la plaque et observer la propagation des cellules à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé (Figure 3). Cellules d’alimentation toutes les 96 h en retirant doucement 2 mL de média à l’intérieur de la plaque et en ajoutant lentement 2 mL de média KSFM-scm frais à la plaque.
  4. Passage dérivé de sphéroïde (SD) NHKc une fois qu’ils atteignent 70-80% de confluence et continuent avec le test de choix. Surveillez fréquemment le SD-NHKc pour empêcher les cellules d’atteindre leur pleine confluence en culture, car cela entraîne une différenciation prématurée et un arrêt de la croissance cellulaire(Figure 3E-F).
  5. Le test de replaquage épidermique sphéroïde modélise la réparation de la plaie médiée par les kératinocytes en capturant chacune des phases séquentielles clés de la plasticité régénérative épidermique : a) entretien homéostatique, b) arrêt/inversion de la différenciation c) mobilité de la lignée de stress, et d) restauration tissulaire (Figure 1B; Tableau 2). Ce test peut également être utilisé pour produire des populations cellulaires pour des cultures organotypiques en radeau ou pour modéliser la néoplasie médiée par le VPH comme démontré dans nos travaux précédents 11,12.

4.3D suivi des cellules de fluorescence

  1. Dans une boîte de 6 cm, transfecter des cultures NHKc monocouches 2D formant des sphéroïdes avec 1 μg de vecteur plasmidique pMSCV-IRES-EGFP portant le gène de la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP). Plaque incubée pendant la nuit (37 °C, 5 % DE CO2,95 % d’humidité) au microscope(Figure 4A).
    REMARQUE: Il est important que la transfection soit effectuée dans des conditions sans antibiotiques sans sérum.
  2. Sans retirer le mélange de transfection, ajoutez 2 mL de KSFM-scm préwarmé aux cellules. Incuber la plaque pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  3. Aspirer tous les milieux de transfection des plaques et des cellules d’alimentation avec 3 mL de KSFM-scm préwargé. Évaluer la présence de cellules exprimant l’EGFP sous le canal FITC d’un microscope fluorescent.
  4. Passage et ensemencement de 2 x10 4 cellules transfectées par l’EGFP dans des puits individuels d’une plaque à fond rond de 96 puits préalablement préparée. Incuber la plaque pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité). Visualiser et surveiller le mouvement des cellules sphéroïdes EGFPpos sous le canal FITC d’un microscope à fluorescence(Figure 4B-C).
  5. 24 h après le placage, ajouter 3 mL de KSFM-scm préwargé à un plat de 6 cm. Utilisez une pointe de pipette de 1 mL à large alésage pour transférer un seul sphéroïde sur la plaque, en veillant à ne pas la briser. Incuber la plaque pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  6. Observez et analysez la propagation del’EGFP SD-NHKc à l’aide d’un microscope à fluorescence. Cellules d’alimentation toutes les 96 h en retirant doucement 2 mL le média à l’intérieur de la plaque et en ajoutant lentement 2 mL de média KSFM-scm frais à la plaque.
  7. Récolte SD-NHKCEGFP pour l’isolement FACS ou les tests de choix.

5. Caractérisation des sous-populations dérivées des sphéroïdes (ET) par FACS

  1. Passage SD-NHKc et cultures monocouches 2D autologues correspondantes en aspirant de vieux milieux et en lavant les cellules dans 2 mL de PBS. Retirer le PBS et ajouter 2 mL de Trypsine-EDTA à 0,25 % aux cellules lavées. Incuber à 37 °C pendant 5 min ou jusqu’à ce que toutes les cellules se détachent complètement.
  2. Ajouter 2 mL d’inhibiteur de la trypsine de soja à la plaque et transférer les cellules dans un tube de 15 mL. Centrifuger à 250 x g pendant 5 min.
  3. Resuspendez les granulés dans 1 mL de PBS. Quantifier la viabilité cellulaire à l’aide du bleu de trypan et d’un compteur cellulaire automatisé d’hémocytomètre.
  4. Aliquote 100 μL contenant 0,1-4 x 106 cellules NHKc à des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL. Placez le tube sur la glace dans un environnement sombre, créé en éteignant les lumières vives dans la hotte laminaire.
  5. Ajouter 2 μL d’anti-intégrine6 conjuguée au FITC et 2 μL d’anti-EGFR conjugué au PE aux tubes pour obtenir une dilution de 1:50. Préparez un tube sans anticorps ajouté pour servir de contrôle non coloré. Incuber des tubes sur de la glace dans l’obscurité ou à 4 °C pendant 30 min. L’utilisation de perles ou d’une ligne de CSC de la peau peut servir de contrôle positif, car les cellules de CSC de la peau expriment des niveaux élevés d’intégrine6 et d’EGFR.
  6. Effectuer une analyse de cytométrie en flux à l’aide du cytomètre en flux de choix contenant avec des lasers appropriés.
  7. Utilisez les contrôles négatifs et positifs pour établir des portes. Trier la sous-population de cellules integrinα6hi/EGFRlo ; il s’agit de la fraction des cellules souches épidermiques. Les cellules integrinα6hi/EGFRhi sont la fraction cellulaire progénitaire proliférative. Les cellules integrinα6lo/EGFRhi sont la fraction cellulaire progéniteur engagée(Figure 4D). Le ou les tubes FACS de tri doivent contenir au moins 1 mL de KSFM-scm glacé.
  8. Tester la capacité proliférative des sous-populations cellulaires triées en transférant le contenu de chaque tube de tri respectif dans un tube conique de 15 mL contenant 10 fois le volume des cellules triées dans PBS. REMARQUE: Il est important d’enlever toutes les cellules attachées au bord en pipetant la paroi du ou des tubes FACS de tri plusieurs fois, car les kératinocytes peuvent souvent y adhérer.
  9. Centrifuger des tubes de 15 mL à 250 x g pendant 5 min. Retirer le surnageant et remettre en caisse la pastille dans 12 mL de KSFM-scm. Transférer les cellules remises en caisse dans une plaque de 6 cm et incuber toute la nuit (37 °C, 5 % deCO2,95 % d’humidité).
  10. Le lendemain, retirer le support dans des plaques et ajouter 8 mL de KSFM-scm préchauffé. Incuber à 37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité. Ré-alimenter les cellules avec un milieu de 12 mL tous les 3 jours jusqu’à 70-80% confluent (Figure 4E).

6. Immunofluorescence et coloration des épidermosphères pour les marqueurs de cellules souches basales

  1. Transférer les épidermosphères sur des couvercles recouverts de poly-lysine. Laissez le SD-NHKc se propager jusqu’à 75% de confluent.
  2. Lavez les cellules deux fois dans du PBS (4 °C) pendant 5 min chacune.
  3. Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA) pendant 20 min à température ambiante.
  4. Perméabiliser les cellules avec 0,5% de Triton X-100 dans 1% de glycine. Bloquer en utilisant 0,5% de BSA et 5% de sérum de chèvre pendant 30 min à température ambiante.
  5. Incuber des échantillons avec des anticorps contre P63 (1:200) et cytokératine 14 (1:200) dans une solution bloquante pendant la nuit à 4 °C.
  6. Laver trois fois avec du PBS (4 °C) contenant du Tween 20 (PBST), suivi d’une incubation avec des anticorps secondaires conjugués FITC et Alexa 568 (dilution 1:1000).
  7. Coloration des noyaux avec du 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (dilution 1:5000) avant de monter les cellules.
  8. Observez les cellules à l’aide d’un microscope fluorescent avec des raies laser FITC et PE (Figure 4F).

7. Analyse transcriptionnelle des cultures d’épidermosphère

  1. Mettre en place des plaques triples de cultures NHKc à faible passage pour isoler l’ARN peut provenir de cultures monocouches, sphéroïdes et dérivées de sphéroïdes de la même lignée cellulaire autologue.
  2. Regrouper 3 à 5 épidermosphères correspondantes dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Récoltez séparément les cultures autologues SD-NHKc et monocouches 2D.
  3. Isoler l’ARN total des trois groupes.
  4. Effectuer une transcription inverse avec 1 μg d’ARN total.
  5. À l’aide de l’ADNc, effectuez une PCR en temps réel, en utilisant GAPDH comme contrôle interne (Tableau 1).
  6. Valider la taille du produit amplicon par électrophorèse sur gel d’agarose (2% v / v).
    REMARQUE: Pour le profilage transcriptomique des cultures d’épidermosphère à l’aide de l’analyse de microréseaux du génome entier, isolez l’ARN total à partir de cultures de masse d’un seul donneur nhKc et le SD-NHKc correspondant du même donneur, en six répliques chacune.
  7. Évaluer la qualité de l’ARN à l’aide d’un bioanalyseur pour obtenir des nombres d’intégrité de l’ARN (RIN) allant d’au moins 9,0 à 9,1.
  8. Effectuer des expériences de microréseaux en amplifiant et en biotinylant des échantillons d’ARN total.
  9. Transcrire à l’envers 100 ng d’ARN total par échantillon en ds-ADNc à l’aide d’amorces aléatoires NNN contenant une séquence promotrice d’ARN polymérase T7.
  10. Ajouter l’ARN polymérase T7 aux échantillons d’ADNc pour amplifier l’ARN, puis copier l’ARN dans l’ADNcs-SS. Dégrader l’excès d’ARN en utilisant la RNase H.
  11. Fragmenter les molécules d’ADNSc et étiqueter avec de la biotine.
  12. Amplifier les échantillons marqués pendant 16 h à 45 °C.
  13. Hybridez les échantillons à l’aide d’un four d’hybridation et d’un kit de lavage et de teinture.
  14. Laver et colorer les matrices hybrides.
  15. Analysez les baies à l’aide d’un système et d’un poste de travail informatique.
  16. Une fois les analyses de matrice terminées, importez les fichiers d’intensité cellulaire de sonde (CEL) dans le logiciel de console d’expression et traitez-les au niveau du gène à l’aide d’un fichier de bibliothèque et d’un algorithme d’analyse multipuce robuste (RMA) pour générer des fichiers de cogénération.
  17. Après avoir confirmé la qualité des données dans Expression Console, importez des fichiers CHP contenant des signaux d’expression log2 pour chaque sonde dans un logiciel d’analyse de transcriptome afin d’analyser les réponses transcriptionnelles spécifiques au type de cellule à l’aide d’une analyse unidirectionnelle de la variance entre les sujets.

8. Évaluation de l’efficacité de la formation de colonies SD-NHKc

  1. Aspirer les milieux des plaques lorsque les cellules atteignent 70 à 80% de confluence. Lavez les cellules trois fois dans du PBS (4 °C) pendant 5 min chacune.
  2. Fixez les cellules avec 3 mL de méthanol à 100 % (4 °C) pendant 15 min. Laver trois fois dans PBS pendant 5 min chacun.
  3. Colorez les cellules dans 3 mL de Giemsa à 10% pendant 30 min. Laver trois fois dans PBS pendant 5 min chacun. Laissez les cellules sécher à l’air libre pendant la nuit.
  4. Analyser la formation des colonies le lendemain et quantifier le nombre de colonies obtenues

9. Déterminer les doublons de la population SD-NHKc

  1. Passage SD-NHKc et cultures monocouches 2D autologues correspondantes en aspirant de vieux milieux et en lavant les cellules dans 2mL PBS. Retirer le PBS et ajouter 2 mL de trypsine-EDTA à 0,25 % aux cellules lavées. Incuber pendant 5 min ou jusqu’à ce que toutes les cellules se détachent complètement (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  2. Ajouter 2 mL d’inhibiteur de la trypsine de soja à la plaque et transférer les cellules dans un tube de 15 mL.
  3. Centrifuger à 250 x g pendant 5 min.
  4. Retirer le surnageant et resussuspender la pastille dans 12 mL de KSFM-scm.
  5. Ensemencez des cellules à faible densité 1-2 x10 4 NHKc dans des plats individuels de 10 cm et incubez pendant la nuit (37 °C, 5% de CO2,95% d’humidité).
  6. Plaques d’alimentation avec 8 mL KSMF-scm le lendemain. Nourrissez tous les 4 jours jusqu’à ce qu’au moins 25% de confluent, puis nourrissez tous les 2 jours.
  7. Cellules de passage en série 1:5 dans des plats de 60 cm jusqu’à épuisement de la capacité proliférative cellulaire. Quantifier la viabilité cellulaire par coloration au bleu trypan. Déterminer les doublons de population à chaque passage à l’aide de la formule : log(N/N0) / log2, où N représente le nombre total de cellules obtenu à chaque passage et N0 représente le nombre de cellules plaquées au début de l’expérience.

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Résultats

Au cours du dosage de l’épidermosphère cutanée, les cultures de NHKc sont ensemenc dans des puits recouverts d’agarose d’une plaque de 96 puits(figure 1A). Les cellules formant des sphéroïdes devraient s’auto-agréger dans les 48h. La formation autonome de sphéroïdes peut être évaluée dès 24 heures à l’aide d’un microscope à contraste de phase inversé standard. la formation de l’épidermosphère cutanée et le modèle de test de re-placage de différentes phases de la régénération du tissu épiderm...

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Discussion

L’utilisation de systèmes de culture sphéroïde 3D a eu une grande utilité dans l’évaluation de la souche cellulaire. Il a été démontré que ces systèmes améliorent l’enrichissement des cellules souches tissulaires13, mais leur utilité pour l’étude des cellules souches épidermiques humaines a été peu explorée. Nous décrivons ici une stratégie d’enrichissement des cellules souches kératinocytes humaines à l’aide de techniques de culture 3D. Dans ce système, les NHKc sont cultivés sous forme de suspen...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont pas de relations financières à divulguer.

Remerciements

L’Installation de ressources en instrumentation (IRF) de l’École de médecine de l’Université de S.C. a donné accès à de l’équipement d’imagerie et de tri cellulaire et à une assistance technique. Ce travail a été soutenu en partie par la subvention 1R21CA201853. Le MCF et l’IRF reçoivent un soutien partiel de la subvention P20GM103499 du NIH, SC INBRE. Le MCF reçoit également le soutien de la subvention P20GM109091 des NIH. Yvon Woappi a été soutenu en partie par les subventions 2R25GM066526-06A1 (PREP) et R25GM076277 (IMSD) des NIH, et par une bourse du grace Jordan McFadden Professors Program à l’UofSC. Geraldine Ezeka et Justin Vercellino ont été soutenus par les subventions 2R25GM066526-10A1 (PREP) des NIH à l’Université de La CSI. Sean M. Bloos a été soutenu par le Magellan Scholar Award 2016 à l’UofSC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plateforme AffymetrixAffymetrixPour les expériences sur puces
Affymetrix' s HuGene-2_0-st fichier de bibliothèqueAffymetrixProcess
Agilent 2100 BioanalyseurAgilentPour les expériences sur microréseaux
All Prep DNA/RNA Mini KitQiagen80204Utilisé pour l’isolement de l’ARN
Console d’analyse Console Logiciel version 3.0.0.466Analysez les réponses transcriptionnelles spécifiques au type de cellule à l’aide de l’analyse de variance unidirectionnelle entre les sujets
Cytomètre en flux BD FACSAria IIBeckmanPour la cytométrie en flux
Console Logiciel version 3.0.0.466/Console d’expression LogicielAffymetrix/Thermo Fisher ScientificPour la confirmation de la qualité
des données Cytokératine 14Santa Cruz Biotechnologysc-53253Dilution 1:200
DispaseSigma-AldrichD4818Pour les milieux cellulaires
Anti-intégrine&alpha conjuguée à la FITC ; 6Abcamab30496Pour l’analyse FACS
GeneChip Command Console 4.0 LogicielAffymetrix/Thermo Fisher ScientificPour la confirmation de la qualité des données
GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific)Affymetrix/Thermo Fisher ScientificPour le lavage et la coloration des réseaux hybrides
GeneChip HuGene 2.0 ST ArraysAffymetrix/Thermo Fisher ScientificPour l’hybridation et l’amplification de l’ARN total
GeneChip Hybridization Oven 640Thermo Fisher ScientificPour l’hybridation et l’amplification de l’ARN total | Amplifiez les échantillons marqués
GeneChip Hybridization Wash et Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific).Affymetrix/Thermo Fisher ScientificPour le lavage et la coloration des réseaux hybrides
GeneChip Scanner 3000 Système 7GAffymetrix/Thermo Fisher ScientificScanning Réseaux hybrides
GeneChip WT PLUS Kit de réactifsAffymetrix/Thermo Fisher ScientificPour l’amplification de l’ARN total biotinylant Facteur de
croissance des fibroblastes de base humain (hFGF basic/FGF2)Cellule Technologie de signalisation8910Pour les milieux cellulaires
Facteur de croissance épidermique humain (hEGF)Technologie de signalisation cellulaire8916Pour les milieux cellulaires
Insuline humaineMillipore Sigma9011-MPour les milieux cellulaires
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad)Bio-Rad1708880Utilisé pour la RT-qPCR
Kit de synthèse d’ADNciScript Bio-Rad1708890utilisé pour RT-qPCR
KSFMThermoFisher Scientific17005041Complété par 1 % de pénicilline/streptomycine, 20 ng/ml d’EGF, 10 ng/ml
de facteur de croissance des fibroblastes basiques, 0,4 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 4 µ ; g/ml d’insuline
KSFM-scmThermoFisher Scientific17005042Supplémenté en pénicilline/streptomycine à 1 %, 20 ng/ml d’EGF, 10 ng/ml
facteur de croissance des fibroblastes basiques, 0,4 % d’albumine sérique bovine (BSA) et 4 µ ; g/ml insuline
MCDB 153-LB milieu basalSigma-AldrichM7403MCDB 153-LB milieu basal avec tampon HEPES
NEST Scientific Lame de chambre de culture cellulaire à 1 puits, parois NOIRES sur lame de verre, 6/PK, 12/CSStellar ScientificNST230111Pour l’immunocoloration
P63Thermo Scientific703809dilution 1:200
anti-EGFR conjugué au PE ( San Jose, CA ; numéro de catalogue )BD Pharmingen555997Pour l’analyse FACS
Vecteur plasmidique pMSCV-IRES-EGFP Addgene20672Pour la transfection
Promega TransFast kitPromegaE2431Pour la transfection
Qiagen RNeasy Plus Micro KitQiagen Pour lesexpériences sur microréseaux
Thermo Scientific&trade ; Unités de filtration sous vide stériles à usage uniqueThermo Scientific09-740-63DPour les milieux
cellulaires Microscope à fluorescence Zeiss Axionvert 135Zeisslogiciel Axiovision Rel. 4.5
Utilisation avec le

Références

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Cellules souches k ratinocytesessai de r empotage en sph ro dessyst me haut d bitr g n ration pidermiquecytom trie en fluxk ratinocytes humains normauxint grine alpha sixcellules EGFR lowculture cellulaire 3D
Établir un système de culture de sphéroïdes épidermiques à haut débit pour modéliser la plasticité des cellules souches kératinocytes
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