Production de nanogouttelettes de décafluorobutane à déphasage filtrées par membrane à partir de microbulles préformées

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de génération de grands volumes de microbulles de décafluorobutane encapsulées par lipides en utilisant la sonication de la pointe de la sonde, puis de les condenser en nanogouttelettes à déphasage à l’aide d’une extrusion à haute pression et d’une filtration mécanique.

Résumé

Il existe de nombreuses méthodes qui peuvent être utilisées pour la production de gouttelettes à déphasage vaporisables pour l’imagerie et la thérapie. Chaque méthode utilise des techniques différentes et varie en prix, en matériaux et en objectif. Bon nombre de ces méthodes de fabrication aboutissent à des populations polydispersées avec des seuils d’activation non uniformes. De plus, le contrôle de la taille des gouttelettes nécessite généralement des liquides perfluorocarbures stables avec des seuils d’activation élevés qui ne sont pas pratiques in vivo. La production de gouttelettes uniformes à l’aide de gaz à faible point d’ébullition serait bénéfique pour les expériences d’imagerie et de thérapie in vivo. Cet article décrit une méthode simple et économique pour la formation de nanogouttelettes à déphasage stabilisées par lipides filtrées avec du décafluorobutane à point d’ébullition bas (DFB). Une méthode courante de génération de microbulles lipidiques est décrite, en plus d’une nouvelle méthode de condensation par extrusion à haute pression en une seule étape. Cette méthode est conçue pour gagner du temps, maximiser l’efficacité et générer de plus grands volumes de solutions de microbulles et de nanogouttelettes pour une grande variété d’applications utilisant des équipements de laboratoire courants trouvés dans de nombreux laboratoires biologiques.

Introduction

Les agents de contraste à ultrasons (UCA) gagnent rapidement en popularité pour les applications d’imagerie et de thérapie. Les microbulles, les UCA originales, sont actuellement les agents courants utilisés dans les applications de diagnostic clinique. Les microbulles sont des sphères remplies de gaz, généralement de 1 à 10 μm de diamètre, entourées de lipides, de protéines ou de coquilles de ^polymères1. Cependant, leur taille et leur stabilité in vivo peuvent limiter leur fonctionnalité dans de nombreuses applications. Les nanogouttelettes à déphasage, qui contiennent un noyau liquide surchauffé, peuvent surmonter certaines de ces limitations en raison de leur plus petite taille et de leur durée de vie ^améliorée2. Lorsqu’il est exposé à la chaleur ou à l’énergie acoustique, le noyau liquide surchauffé se vaporise pour former une microbulle de gaz2,3,4,5. Étant donné que le seuil de vaporisation est directement lié à la taille des ^{gouttelettes5,6}, il serait hautement souhaitable de formuler des suspensions de gouttelettes de taille uniforme pour atteindre des seuils d’activation cohérents. Les méthodes de formulation qui produisent des tailles de gouttelettes uniformes sont souvent complexes et coûteuses, tandis que les approches plus rentables aboutissent à des solutions polydispersées7. Une autre limitation est la capacité de générer des gouttelettes à déphasage stables avec des gaz perfluorocarbonés (PFC) à faible point d’ébullition, ce qui est essentiel pour une activation efficace in ^vivo8. Dans ce manuscrit, un protocole est décrit pour générer des gouttelettes de déphasage vaporisables à point d’ébullition filtrées stables pour des applications d’imagerie et de thérapie in vivo.

Il existe de nombreuses méthodes de production de gouttelettes à déphasage submicroniques monodispersées7. L’une des méthodes les plus robustes de contrôle de la taille est l’utilisation de dispositifs microfluidiques. Ces appareils peuvent être coûteux, avoir des taux de production de gouttelettes lents (~104-106 gouttelettes/s)⁷, et nécessiter une formation approfondie. Les dispositifs microfluidiques nécessitent également généralement des gaz à point d’ébullition élevé pour éviter la vaporisation spontanée et le colmatage du ^système7. Cependant, une étude récente de de Gracia Lux et ^al.9 démontre comment le refroidissement d’un microfluidisateur peut être utilisé pour générer des concentrations élevées de déphasage submicronique (1010-1012 / mL) en utilisant du décafluorobutane à point d’ébullition bas (DFB) ou de l’octafluoropropane (OFP).

En général, les gaz à point d’ébullition bas tels que le DFB ou l’OFP sont plus faciles à manipuler à l’aide de bulles de gaz préformées. Des gouttelettes vaporisables peuvent être produites à partir de bulles stabilisées par les lipides précurseurs en condensant le gaz à basse température et à pression ^élevée5,10. La concentration de gouttelettes produites à l’aide de cette méthode dépend de la concentration en microbulles précurseurs et de l’efficacité de la conversion des bulles en gouttelettes. Des microbulles concentrées ont été rapportées à partir d’une sonication de pointe approchant > ¹⁰¹⁰ MB / ^mL11, tandis qu’une étude distincte a rapporté des concentrations de gouttelettes allant de ~ 1-3 ^x1011 gouttelettes / mL de bulles condensées OFP et ^DFP12. Lorsque les gouttelettes monodispersées ne sont pas préoccupantes, les méthodes de condensation sont les méthodes les plus simples et les moins coûteuses pour générer des gouttelettes à déphasage stabilisées par les lipides à l’aide de PFC à point d’ébullition bas. Les méthodes de génération de bulles de taille uniforme avant la condensation peuvent aider à créer des populations de gouttelettes plus monodispersées. Cependant, la génération de bulles précurseurs monodispersées est également difficile, nécessitant des approches plus coûteuses telles que la microfluidique ou les techniques de centrifugation différentielle ^répétée11. Une approche alternative pour produire des nanogouttelettes DFB et OFB a récemment été publiée en utilisant la nucléation spontanée de gouttelettes dans les ^liposomes13. Cette méthode, utilisant un effet « Ouzo », est un moyen simple de générer des gouttelettes de PFC à faible point d’ébullition sans avoir besoin de condenser des bulles. La distribution granulométrique des gouttelettes de PFC peut être contrôlée par un titrage délicat et un mélange de composants PFC, lipidiques et éthanol utilisés pour initier la nucléation des gouttelettes. Il convient également de noter que le mélange de perfluorocarbures peut être utilisé pour contrôler la stabilité et les seuils d’activation des nanogouttelettes14,15. Des travaux plus récents de Shakya et al. démontrent comment l’activation des nanogouttelettes peut être réglée en émulsionnant des PFC à point d’ébullition élevé dans un endosquelette d’hydrocarbures pour faciliter la nucléation hétérogène dans le noyau de ^{gouttelettes16}, ce qui est une approche qui peut être envisagée avec d’autres formes de filtration de la taille des gouttelettes.

Une fois formées, les gouttelettes à déphasage peuvent être extrudées après la formation pour créer des populations plus monodispersées. En fait, un protocole similaire à la méthode décrite ici a été publié précédemment par Kopechek et ^al.17 en utilisant le dodécofluorpentane à point d’ébullition élevé (DDFP) comme noyau de gouttelettes. Les lecteurs qui cherchent à utiliser des gouttelettes à déphasage avec des perfluorocarbures à point d’ébullition élevé (stables à température ambiante) devraient plutôt se référer à l’article ci-dessus. La génération et l’extrusion de gouttelettes avec des gaz à faible point d’ébullition, tels que DFB et OFP, sont plus compliquées et sont mieux approchées en condensant des bulles de gaz préformées.

Dans ce protocole, une méthode courante de génération de microbulles lipidiques préformées avec un noyau de gaz DFB à l’aide de la sonication de la pointe de la sonde est décrite. Ensuite, une extrudeuse commerciale est utilisée pour condenser des microbulles préformées en nanogouttelettes à déphasage submicroniques (Figure 1). Les gouttelettes résultantes sont ensuite activables par la chaleur et les ultrasons. Cette méthode peut produire de plus grands volumes de solution de nanogouttelettes que les méthodes de condensation conventionnelles avec des distributions de taille plus étroites sans avoir besoin de dispositifs microfluidiques coûteux. La production de solutions de nanogouttelettes avec des distributions de taille étroite peut probablement générer des seuils de vaporisation plus uniformes. Cela maximisera leur potentiel pour de nombreuses applications telles que l’imagerie, l’ablation, l’administration de médicaments et l’embolisation1,3,4,6.

Figure 1 : Schéma de la configuration d’extrusion à haute pression pour la condensation de microbulles préformées en nanogouttelettes à déphasage. Une solution de microbulles est ajoutée et contenue dans la chambre d’extrusion, et 250 psi, à partir du réservoir d’azote, sont appliqués à travers la vanne d’entrée de la chambre. L’azote gazeux poussera la solution de microbulles à travers le filtre à la base de la chambre, condensant l’échantillon en nanogouttelettes. La solution est finalement poussée hors de l’extrudeuse à travers le tube de sortie de l’échantillon et collectée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

1. Faire des films lipidiques

1. Préparer des films lipidiques pour la génération de microbulles en utilisant 90% de DSPC et 10% de DSPE-PEG2K en mélangeant les lipides au bon rapport en utilisant les instructions suivantes:
   1. Fabriquer des lipides de DSPC et de DSPE-PEG2K dans le chloroforme. Peser 50 mg de chaque poudre lipidique dans des flacons séparés. Ajouter 1 mL de chloroforme à chaque flacon à l’aide d’une seringue en verre de 1 mL.
   2. Ajouter 287 μL de bouillon DSPC et 113 μL de bouillon DSPE-PEG2K (tous deux 50 mg/mL) dans un flacon de scintillation de 20 mL à l’aide d’une seringue en verre.
   3. Sécher les lipides mélangés pour éliminer le chloroforme à l’aide d’azote. À l’aide d’une longueur appropriée de tube relié à l’azote domestique, faire circuler légèrement l’azote gazeux sur l’espace de tête du flacon pendant le mélange. Continuez jusqu’à ce qu’aucun chloroforme ne soit observé et que le film lipidique restant commence à devenir blanc. Utilisez des bouchons à vis en polypropylène, couvrez l’échantillon tout en introduisant de l’azote dans l’espace de tête.
   4. Placez les flacons sous vide pendant la nuit à l’aide d’un dessiccateur sous vide pour éliminer tout chloroforme résiduel. Il restera un mince film translucide qui recouvre le fond du flacon.
   5. Conserver les flacons à -20 °C jusqu’à ce que cela soit nécessaire.

2. Générer des microbulles à partir de films lipidiques

1. Pour fabriquer les microbulles, ajoutez 10 mL de 1x solution saline tampon phosphate (PBS) contenant 20% v/v de propylène glycol et 20% v/v de glycérol (pH final 7,2-7,4) à un film lipidique sec.
2. Rebouchez l’échantillon et réchauffez l’échantillon à 65 °C pendant 30 min sur un bloc chauffant (ou un bain-marie chauffé).
3. Pendant que l’échantillon se réchauffe, préparez le sonicateur de bain en augmentant la température du bain à 65 °C.
   REMARQUE: Ce processus est plus rapide si l’eau est préchauffée dans un micro-ondes ou une plaque chauffante avant de la placer dans le sonicator de bain.
4. Placer le flacon de scintillation contenant l’échantillon réchauffé dans le sonicator de bain de sorte que seule la partie du flacon contenant la solution lipidique soit immergée dans le bain-marie.
5. Sonicate la solution lipidique chaude pendant au moins 15 min. Assurez-vous que la température de l’eau reste à 65 °C. Continuer à soniquer à des intervalles de 10 à 15 minutes jusqu’à ce que la solution soit complètement claire (Figure 2).
   REMARQUE: Si un sonicateur de bain n’est pas disponible, la solution peut être soniquée à 10% de puissance jusqu’à ce qu’elle soit claire. Cependant, la micro-pointe s’usera plus rapidement et est plus coûteuse à remplacer.

Figure 2 : Exemple de films lipidiques hydratés. Exemple de film lipidique hydraté (A) avant et (B) après sonication par bain pour former des vésicules unilamellaires. Après la sonication du bain, la solution lipidique devrait passer d’une solution plus opaque à une solution translucide. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

6. Lorsqu’il fait encore chaud, retirez le capuchon et fixez le flacon dans le boîtier insonorisé du sonicateur afin que la fixation micro-embout du sonicator soit immergée juste sous l’interface air/liquide (Figure 3).
7. Placez le réservoir de décafluorobutane à côté de l’enceinte insonorisée du sonicator.
8. Préparez un bain de glace et placez-le à côté de l’enceinte insonorisée. Cela sera utilisé plus loin à l’étape 2.14.
9. Allumez l’interrupteur d’alimentation du sonicator.
10. Une fois le système démarré, réglez le niveau de puissance sur 70 %. Ne dépassez pas 70% d’amplitude avec la fixation micro-pointe. Ne démarrez pas le sonicator pour le moment.
11. Fixez une longueur appropriée de tuyau pour guider le gaz de la sortie du réservoir DFB dans la solution lipidique chaude maintenue dans l’enceinte. Le tube doit être placé juste dans le col du flacon pour permettre au gaz de s’écouler dans l’espace de tête pendant la sonication (Figure 3).
12. Ouvrez lentement la vanne du réservoir jusqu’à ce que le gaz puisse être vu s’écouler sur la solution lipidique. Cela provoquera de légères ondulations à la surface du liquide. Si le débit de gaz est trop élevé, la solution débordera lors de la formulation des microbulles.
13. Démarrez le sonicator et exécutez pendant 10 s en continu pour générer des microbulles. Si la solution à bulles commence à déborder pendant la sonication, arrêtez immédiatement le sonicator.
14. Éteignez le sonicator et fermez immédiatement la vanne du réservoir DFB.
15. Boucher rapidement la solution de microbulles et immerger le flacon dans le bain de glace pour refroidir l’échantillon en dessous de 55 °C (température de transition vitreuse du DSPC)
16. Laissez les échantillons de microbulles dans le bain de glace jusqu’à ce que cela soit nécessaire.

Figure 3 : Placement de la pointe de la sonde dans la solution lipidique pour optimiser la formation de microbulles. Veillez à ne pas laisser la pointe de la sonde toucher le verre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Préparation de l’extrudeuse pour la condensation des microbulles

1. Assemblez l’extrudeuse haute pression comme indiqué dans le manuel de l’utilisateur à l’aide d’un filtre en céramique de 200 nm (fourni par le fabricant).
2. Placez l’extrudeuse au centre d’un récipient étanche afin que le tube de sortie de l’échantillon ne soit pas pressé contre le côté ou serti.
3. Couplez l’extrudeuse au réservoir d’azote gazeux à l’aide de l’adaptateur fourni par le fabricant.
4. Faire un bain de glace salée à -2 °C dans le récipient étanche autour de l’extrudeuse en utilisant 400 mL d’eau et 10 g de chlorure de sodium.
5. Placez l’extrémité du tube de sortie dans un flacon de scintillation pour prélever l’échantillon extrudé.
   REMARQUE: Fixez le tube au récipient avec du ruban adhésif s’il ne repose pas à plat ou ne reste pas dans le flacon.

4. Amorçage de l’extrudeuse pour la condensation des microbulles

1. Ouvrez et fermez la vanne de déverrouillage pour vous assurer qu’il n’y a pas de pression dans l’extrudeuse.
2. Retirez le couvercle de la chambre et ajoutez 5 mL de 1x PBS à la chambre d’extrusion.
3. Remplacez le couvercle en vous assurant qu’il est remis en place en toute sécurité.
4. Ouvrez le réservoir d’azote gazeux de sorte que le manomètre indique 250 psi. Assurez-vous que la soupape de régulation de pression est en position fermée.
5. Fermez le réservoir de gaz et ouvrez la vanne d’entrée de la chambre d’extrusion. La solution PBS sera poussée à travers le système et hors du tube de sortie de l’échantillon dans le flacon de scintillation.
6. Lorsque seul du gaz sort du tube, ouvrez la soupape de dégagement et laissez la pression tomber à 0 psi.
7. Retirez le flacon de scintillation.

5. Microbulles de pré-refroidissement pour l’extrusion

1. Ouvrez et fermez la vanne de déverrouillage pour vous assurer qu’il n’y a pas de pression dans l’extrudeuse. Placez un nouveau flacon de scintillation à l’extrémité du tube de sortie.
2. Remplissez un récipient en acier avec du 2-méthyl butane et ajoutez de la glace carbonique pour ramener la température à -18 °C.
3. Insérez la solution de microbulles dans le 2-méthyl butane réfrigéré afin que l’échantillon soit immergé pendant 2 min. Déplacez le flacon de scintillation pendant 2 minutes pour mélanger doucement les bulles. Ajouter de la glace carbonique au besoin pour maintenir la température entre -15 et -18 °C. Veillez à ne pas dépasser -20 °C sinon la solution d’excipient gèlera et détruira l’échantillon de bulles.
   REMARQUE: Les étapes 5.2 et 5.3 peuvent également être effectuées en refroidissant l’échantillon de bulles dans un congélateur de laboratoire sur une période plus longue. Cependant, il faut faire preuve de prudence pour surveiller attentivement la température du congélateur et éviter de congeler l’échantillon.
4. Après 2 min, retirer les microbulles du 2-méthyl butane réfrigéré, agiter doucement le flacon pour mélanger les microbulles et utiliser une seringue réfrigérée de 10 mL pour transférer la solution à l’extrudeuse.
5. Retirez le couvercle de la chambre d’extrusion et ajoutez la solution de microbulles à la chambre en poussant lentement le piston de la seringue. Remplacez le capuchon de l’extrudeuse en vous assurant qu’il est bien en place.
6. Vérifiez que la vanne de régulation de pression et la vanne de desserrage de l’extrudeuse sont en position fermée.
7. Ouvrez le réservoir d’azote gazeux jusqu’à ce que le manomètre indique 250 psi, fermez le réservoir d’essence et tournez la soupape de régulation de pression en position ouverte.
8. Lorsque la solution a rempli le flacon de scintillation au niveau du tube de sortie et que seul le gaz sort du tube, ouvrez lentement la soupape de décompression et laissez la pression tomber à 0 psi.
9. Placez le flacon de scintillation dans un bain de glace ou un réfrigérateur pour le stockage.
10. Pour un stockage à long terme et minimiser la vaporisation spontanée, conservez l’échantillon dans un congélateur standard. Assurez-vous que la température est de -20 °C ou plus pour éviter de congeler l’échantillon (la solution d’excipient de 20 % de PPG et de 20 % de glycérol empêchera l’échantillon de geler dans la plupart des congélateurs de laboratoire).

6. Séparer les gouttelettes des liposomes par centrifugation

1. Transférer 10 mL de la solution de gouttelettes extrudées dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
2. Centrifuger l’échantillon extrudé à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C. Une pastille composée de nanogouttelettes DFB sera apparente au fond du tube (Figure 4). Des gouttelettes vaporisées spontanément apparaîtront en haut de la solution et doivent être jetées.

Figure 4 : Exemple de granulation de gouttelettes DFB à déphasage après centrifugation. Les nanogouttelettes DFB sont plus denses que les liposomes et s’accumulent au fond du tube de centrifugeuse dans une pastille (boîte rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Retirer le surnageant et remettre la pastille dans 2 mL de 1x PBS avec 20% de glycérol et 20% de propylène glycol.
4. Mélanger doucement le tube pour obtenir une solution homogène et transférer les gouttelettes dans un tube centrifugeur plus petit de 2 mL.
5. Laver l’échantillon deux fois de plus dans un tube de centrifugeuse de 2 mL.
6. Après le dernier lavage, remettez la pastille dans 100 μL de 1x PBS avec 20% de glycérol et 20% de propylène glycol et conservez-la sur de la glace ou au congélateur jusqu’à ce que nécessaire.

7. Vérification microscopique de la vaporisation des gouttelettes

1. Faire une solution de gouttelettes diluées en ajoutant 2,5 μl de gouttelettes concentrées à 7,5 μl de 1x PBS.
2. Préparer une lame de microscope avec 10 μl de l’échantillon dilué. À l’aide d’un objectif 40x, observez l’échantillon et enregistrez les images.
3. Retirez la lame du microscope et placez-la sur une plaque chauffante à 65 °C pendant 1 min pour vaporiser les nanogouttelettes en microbulles.
4. Utilisez le même objectif 40x pour observer l’échantillon après chauffage afin de vérifier la vaporisation des gouttelettes.

Résultats

Les résultats représentatifs de la distribution granulométrique sont inclus à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) et de l’analyse par détection d’impulsions résistives accordables (TRSP). La figure 5 montre la distribution granulométrique des solutions de bulles condensées avec et sans extrusion. Sans extrusion, le protocole se termine à l’étape 5.3. Les bulles réfrigérées sont condensées en évacuant l’échantillon à la pression atmosphérique lorsqu’il fait froid. L’échantill...

Discussion

Un corpus complet de littérature est disponible qui traite de la formulation, de la physique et des applications potentielles des microbulles et des gouttelettes à déphasage pour l’imagerie et la thérapie in vivo. Cette discussion porte explicitement sur la génération de microbulles lipidiques et leur conversion en gouttelettes à déphasage submicroniques à l’aide d’un gaz DFB à faible point d’ébullition et d’une extrusion à haute pression. La méthode décrite ici vise à fournir une méthode relativement simple de productio...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes à centrifuger de 15 mL	Falcon	352095	Collecte et centrifugation des gouttelettes
Filtre en polycarbonate 200 nm	Filtres d’extrudeuse	Whatman	110606
Fisher	Chemical	03551-4	Pré-refroidissement rapide de la solution de microbulles avant l’extrusion
Pinces à 3 broches X2	Fisher	02-217-002	Maintien des flacons de scintilation en place pour la sonication de l’extrémité de la sonde
Sonicateur analogique de pointe de sonde 400W avec corne	Branson	101-063-198R	Utilisé pour générer des microbulles lipidiques à partir d’une solution lipidique
Sonicateur	de bain Fisher Scientific	15337402	Utilisé pour aider à décomposer les liposomes en vésicules unilamellaires
Chloroforme	Fisher Bioréactifs	C298-4	Utilisé pour fabriquer un film lipidique pour la préparation des microbulles
Décafluorobutane (Perfluorobutane) Gaz	FluoroMed L.P.	1 kg	générant des microbulles par sonication de l’extrémité de la sonde
Glace carbonique	-	-	Prérefroidissement rapide de la solution de microbulles avant l’extrusion
DSPC Poudre lipidique	NOF America COATSOME	MC-8080	Composant du film lipidique
DSPE-PEG-2K Poudre lipidique	NOF America SUNBRIGHT	DSPE-020CN	Composant du film lipidique
Thermomètre général	-	-	Utilisé pour mesurer la température du bain de glace et la température du 2-méthylbutane (doit s’adapter à des températures de -20 °C)
Seringues en verre	Hamilton	81139	Utilisé pour mélanger les lipides dans le chloroforme
Glycérol	Fisher Bioréactifs	BP229-1	Réduit la température de congélation de la solution PBS
Bloc chauffant	Produits scientifiques VWR Scientific Films		chauffants et gouttelettes de vaporisation
Lipex 10 mL Extrudeuse	Evonik		Système d’extrusion commercial à haute pression
Mini Vortex Mixer	Fisher marque	14-955-151	Utilisé pour éliminer l’excès de chloroforme des films lipidiques
Réservoir d’azote	-		Utilisé pour faire fonctionner l’extrudeuse
Tampon de phosphate Saline	Fisher Scientific		Hydrate films lipidiques et gouttelettes de lavage
Disque	de drainage en polyesterWhatman	230600	Fournit un support pour un filtre en
polycarbonate Bouchons en polypropylène	Fisher Scientific	298417	Utilisé pour le stockage
solutions Propylène glycol	Fisher Chemical	P355-1	Réduit la température de congélation de la solution PBS
Flacons de scintiliation DWK	Life Sciences Wheaton 986532		Utilisé pour les films lipidiques et la génération de microbulles
Petit marteau	-	-	Utilisé pour briser la glace carbonique pour refroidir le méthylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Utilisé pour générer des microbulles à partir d’une solution lipidique
Récipient en acier	Medegen	79310	Pré-refroidissement rapide de la solution de microbulles avant l’extrusion (tout récipient évalué à -20C fonctionnera)
Dessicator sous vide	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Élimine l’excès de chloroforme des films lipidiques
Tube à centrifuger	Fisher	02682004	Utilisé pour concentrer les nanogouttelettes