Production de nanogouttelettes de décafluorobutane à déphasage filtrées par membrane à partir de microbulles préformées

Résumé

Ce protocole décrit une méthode de génération de grands volumes de microbulles de décafluorobutane encapsulées par lipides en utilisant la sonication de la pointe de la sonde, puis de les condenser en nanogouttelettes à déphasage à l’aide d’une extrusion à haute pression et d’une filtration mécanique.

Résumé

Il existe de nombreuses méthodes qui peuvent être utilisées pour la production de gouttelettes à déphasage vaporisables pour l’imagerie et la thérapie. Chaque méthode utilise des techniques différentes et varie en prix, en matériaux et en objectif. Bon nombre de ces méthodes de fabrication aboutissent à des populations polydispersées avec des seuils d’activation non uniformes. De plus, le contrôle de la taille des gouttelettes nécessite généralement des liquides perfluorocarbures stables avec des seuils d’activation élevés qui ne sont pas pratiques in vivo. La production de gouttelettes uniformes à l’aide de gaz à faible point d’ébullition serait bénéfique pour les expériences d’imagerie et de thérapie in vivo. Cet article décrit une méthode simple et économique pour la formation de nanogouttelettes à déphasage stabilisées par lipides filtrées avec du décafluorobutane à point d’ébullition bas (DFB). Une méthode courante de génération de microbulles lipidiques est décrite, en plus d’une nouvelle méthode de condensation par extrusion à haute pression en une seule étape. Cette méthode est conçue pour gagner du temps, maximiser l’efficacité et générer de plus grands volumes de solutions de microbulles et de nanogouttelettes pour une grande variété d’applications utilisant des équipements de laboratoire courants trouvés dans de nombreux laboratoires biologiques.

Introduction

Les agents de contraste à ultrasons (UCA) gagnent rapidement en popularité pour les applications d’imagerie et de thérapie. Les microbulles, les UCA originales, sont actuellement les agents courants utilisés dans les applications de diagnostic clinique. Les microbulles sont des sphères remplies de gaz, généralement de 1 à 10 μm de diamètre, entourées de lipides, de protéines ou de coquilles de ^polymères1. Cependant, leur taille et leur stabilité in vivo peuvent limiter leur fonctionnalité dans de nombreuses applications. Les nanogouttelettes à déphasage, qui contiennent un noyau liquide surchauffé, peuvent surmonter certaines de ces limitations....

Protocole

1. Faire des films lipidiques

1. Préparer des films lipidiques pour la génération de microbulles en utilisant 90% de DSPC et 10% de DSPE-PEG2K en mélangeant les lipides au bon rapport en utilisant les instructions suivantes:
   1. Fabriquer des lipides de DSPC et de DSPE-PEG2K dans le chloroforme. Peser 50 mg de chaque poudre lipidique dans des flacons séparés. Ajouter 1 mL de chloroforme à chaque flacon à l’aide d’une seringue en verre de 1 mL.
   2. Ajouter 287 μL de bouillon DSPC et 113 μL de bouillon DSPE-PEG2K (tous deux 50 mg/mL) dans un flacon de scintillation de 20 mL à l’aide d’une seringue en verre.
   3. Sécher les lipides mélangés pour é....

Résultats

Les résultats représentatifs de la distribution granulométrique sont inclus à l’aide de la diffusion dynamique de la lumière (DLS) et de l’analyse par détection d’impulsions résistives accordables (TRSP). La figure 5 montre la distribution granulométrique des solutions de bulles condensées avec et sans extrusion. Sans extrusion, le protocole se termine à l’étape 5.3. Les bulles réfrigérées sont condensées en évacuant l’échantillon à la pression atmosphérique lorsqu’il fait froid. L’échantill.......

Discussion

Un corpus complet de littérature est disponible qui traite de la formulation, de la physique et des applications potentielles des microbulles et des gouttelettes à déphasage pour l’imagerie et la thérapie in vivo. Cette discussion porte explicitement sur la génération de microbulles lipidiques et leur conversion en gouttelettes à déphasage submicroniques à l’aide d’un gaz DFB à faible point d’ébullition et d’une extrusion à haute pression. La méthode décrite ici vise à fournir une méthode relativement simple de productio.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes à centrifuger de 15 mL	Falcon	352095	Collecte et centrifugation des gouttelettes
Filtre en polycarbonate 200 nm	Filtres d’extrudeuse	Whatman	110606
Fisher	Chemical	03551-4	Pré-refroidissement rapide de la solution de microbulles avant l’extrusion
Pinces à 3 broches X2	Fisher	02-217-002	Maintien des flacons de scintilation en place pour la sonication de l’extrémité de la sonde
Sonicateur analogique de pointe de sonde 400W avec corne	Branson	101-063-198R	Utilisé pour générer des microbulles lipidiques à partir d’une solution lipidique
Sonicateur	de bain Fisher Scientific	15337402	Utilisé pour aider à décomposer les liposomes en vésicules unilamellaires
Chloroforme	Fisher Bioréactifs	C298-4	Utilisé pour fabriquer un film lipidique pour la préparation des microbulles
Décafluorobutane (Perfluorobutane) Gaz	FluoroMed L.P.	1 kg	générant des microbulles par sonication de l’extrémité de la sonde
Glace carbonique	-	-	Prérefroidissement rapide de la solution de microbulles avant l’extrusion
DSPC Poudre lipidique	NOF America COATSOME	MC-8080	Composant du film lipidique
DSPE-PEG-2K Poudre lipidique	NOF America SUNBRIGHT	DSPE-020CN	Composant du film lipidique
Thermomètre général	-	-	Utilisé pour mesurer la température du bain de glace et la température du 2-méthylbutane (doit s’adapter à des températures de -20 °C)
Seringues en verre	Hamilton	81139	Utilisé pour mélanger les lipides dans le chloroforme
Glycérol	Fisher Bioréactifs	BP229-1	Réduit la température de congélation de la solution PBS
Bloc chauffant	Produits scientifiques VWR Scientific Films		chauffants et gouttelettes de vaporisation
Lipex 10 mL Extrudeuse	Evonik		Système d’extrusion commercial à haute pression
Mini Vortex Mixer	Fisher marque	14-955-151	Utilisé pour éliminer l’excès de chloroforme des films lipidiques
Réservoir d’azote	-		Utilisé pour faire fonctionner l’extrudeuse
Tampon de phosphate Saline	Fisher Scientific		Hydrate films lipidiques et gouttelettes de lavage
Disque	de drainage en polyesterWhatman	230600	Fournit un support pour un filtre en
polycarbonate Bouchons en polypropylène	Fisher Scientific	298417	Utilisé pour le stockage
solutions Propylène glycol	Fisher Chemical	P355-1	Réduit la température de congélation de la solution PBS
Flacons de scintiliation DWK	Life Sciences Wheaton 986532		Utilisé pour les films lipidiques et la génération de microbulles
Petit marteau	-	-	Utilisé pour briser la glace carbonique pour refroidir le méthylbutane
Sonicator Microtip Attachment	Branson	101148070	Utilisé pour générer des microbulles à partir d’une solution lipidique
Récipient en acier	Medegen	79310	Pré-refroidissement rapide de la solution de microbulles avant l’extrusion (tout récipient évalué à -20C fonctionnera)
Dessicator sous vide	Bel-Art SP Scienceware	08-648-100	Élimine l’excès de chloroforme des films lipidiques
Tube à centrifuger	Fisher	02682004	Utilisé pour concentrer les nanogouttelettes

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