Observation de la fonction des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires dans les tranches de tissu pancréatique vivant

Summary

Cette étude présente l’application de tranches de tissu pancréatique vivant à l’étude de la physiologie des îlots et des interactions entre les îlots et les cellules immunitaires.

Abstract

Les tranches de tissu pancréatique vivant permettent d’étudier la physiologie et la fonction des îlots dans le contexte d’un microenvironnement intact des îlots. Les tranches sont préparées à partir de tissu pancréatique humain et souris vivant incorporé dans l’agarose et coupées à l’aide d’un vibratome. Cette méthode permet au tissu de maintenir sa viabilité et sa fonction en plus de préserver les pathologies sous-jacentes telles que le diabète de type 1 (DT1) et le diabète de type 2 (DT2). La méthode des tranches permet de nouvelles directions dans l’étude du pancréas grâce au maintien des structures complexes et des diverses interactions intercellulaires qui composent les tissus endocriniens et exocrines du pancréas. Ce protocole montre comment effectuer la coloration et la microscopie en accéléré de cellules immunitaires endogènes vivantes dans des tranches pancréatiques ainsi que des évaluations de la physiologie des îlots. De plus, cette approche peut être affinée pour discerner les populations de cellules immunitaires spécifiques aux antigènes des cellules des îlots à l’aide de réactifs complexes-multimères d’histocompatibilité majeurs.

Introduction

L’implication du pancréas est pathognomonique à des maladies telles que la pancréatite, le DT1 et le DT21,2,3. L’étude de la fonction dans les îlots isolés implique généralement l’élimination des îlots de leur ^{environnement4}. La méthode de la tranche de tissu pancréatique vivant a été développée pour permettre l’étude du tissu pancréatique tout en maintenant des microenvironnements intacts des îlots et en évitant l’utilisation de procédures stressantes d’isolement des îlots5,6,7.

Protocol

NOTES: Tous les protocoles expérimentaux utilisant des souris ont été approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride (201808642). Des coupes pancréatiques humaines de donneurs de tissus des deux sexes ont été obtenues via la banque de tissus Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) de l’Université de Floride. Le pancréas humain a été prélevé sur des donneurs d’organes cadavériques par des organisations d’approvisionnement en organes certifiées en partenariat avec nPOD conformément aux lois et règlements sur le don d’organes et classé comme « sujets non humains » par le Conseil d’examen institutionnel de l’Unive....

Results

Ce protocole produira des tranches de tissu pancréatique vivant adaptées à la fois aux études de fonctionnalité et aux enregistrements de cellules immunitaires. L’apparence des tranches en champ clair et sous la lumière réfléchie est illustrée à la Figure 1A,B. Comme nous l’avons vu, les îlots peuvent être trouvés en tranches en utilisant la lumière réfléchie en raison de leur granularité accrue qui se produit en raison de leur teneur en insuline (Figure.......

Discussion

L’objectif de ce protocole est d’expliquer la génération de tranches de pancréas et les procédures nécessaires pour utiliser les tranches dans des études fonctionnelles et immunologiques. Il y a de nombreux avantages à utiliser des tranches pancréatiques vivantes. Cependant, plusieurs étapes critiques sont essentielles pour que le tissu reste viable et utile au cours des protocoles d’expérience décrits. Il est impératif de travailler rapidement. Le temps entre l’injection du pancréas et la génération des tranches sur le .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 Style Scalpel Manche	Fisherbrand	12-000-163
1 M HEPES	Fisher Scientific	BP299-100	HEPES Buffer, 1M Solution
10 cm Plat de culture non traité	Corning	430591
10 mL Seringue Luer-Lok	BD	301029	Seringue BD avec embouts Luer-Lok
27 G Aiguille	BD	BD 305109	BD Utilisation générale et PrecisionGlide Aiguilles hypodermiques
35 mm Couverture Fond de verre Boîte de Pétri	Ibidi	81156	µ ;-Dish 35 mm,
haute Seringue de 50 mL	BD	309653
Couverture à 8 puits	Ibidi	80826	µ ;-Slide 8 Well
APC anti-souris CD8a anticorps	Biolegend	100712
BSA	Fisher Scientific	199898
Chlorure de calcium	Sigma	C5670	CaCl2
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma	C7902	CaCl2 (dihydraté)
Compact Digital Rocker	Thermo Fisher Scientific	88880020
Microscope confocal à balayage laser	Leica	SP8	Sténopé&thinsp ;= 1,5-2 unités aérées ; acquis avec des objectifs HC PL APO CS2 dry à ouverture numérique 10x/0,40 et des objectifs HC PL APO CS2 dry à ouverture numérique 20x/0,75 à 512&thinsp ; & fois ; &thinsp ; Résolution de 512 pixels
D-(+)-Glucose	Sigma	G7021	C6H12O6
ddiH2O
Dithizone	Sigma-Aldrich	D5130-10G
DMSO	Invitrogen	D12345	Diméthyl sulfoxyde
Ethanol	Decon Laboratories	2805
Falcon 35 mm Boîte de culture tissulaire	Corning	353001	Falcon Easy-Grip Boîtes de culture
tissulaire FBS	Gibco Gibco	10082147
Feather No. 10 Lame chirurgicale	Microscopie électronique Sciences	7204410
fluo-4-AM	Invitrogen	F14201	perméable aux cellules Ca2+ indicateur
Gel Control Super Glue	Loctite	45198
Pince Graefe Fine	Science Tools	11049-10
Ciseaux fins trempés	de science fine	14090-09
HBSS	Gibco	14025092	Hanks Solution saline équilibrée
HEPES	Sigma	H4034	C8H18N2O4S
Seau à glace	Fisherbrand	03-395-150
Isoflurane	Patterson Vétérinaire	NDC 14043-704-05
Johns Hopkins Bulldog Clamp	Roboz Surgical Store	RS-7440	; Droit; pression de 500 à 900 grammes ; 1,5" de longueur
Kimwipes	Kimberly-Clark Professional	34705	Kimtech Science&trade ; Kimwipes&commerce ; Essuie-glaces Delicate Task, kit de
viabilité/cytotoxicité LIVE/DEAD	Invitrogen	L3224	Ce kit contient le colorant à cellules vivantes calcein-AM.
Faible teneur en glucose DMEM	Corning	10-014-CV
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma	M9272	MgCl2 (hexahydraté)
Sulfate de magnésium heptahydraté	Sigma	M2773	MgSO4 (heptahydraté)
Plate-forme chauffée magnétique	Warner Instruments	PM-1 Plate-forme	pour chambre d’imagerie pour stimulation dynamique enregistrements
Micro-ondes	GE	JES1460DSWW
Nalgene Seringue Filtre	Thermo Fisher Scientific	726-2520
No.4 Pinceau	Michaels	10269140
Open Diamond Bath Chambre d’imagerie	Warner Instruments	RC-26	Chambre d’imagerie pour enregistrements de stimulation dynamique
Oregon Green 488 BAPTA-1-AM	Invitrogen	O6807	Indicateur Ca2+ perméable
aux cellules Chambre d’imagerie de nuit	Okolab	H201-LG
PBS	Thermo Fisher Scientific	Pour fabriquer de l’agarose pour la génération de tranches
Tétramère d’insuline marqué PE	Emory Tetramer Research Séquence de base	YAIENYLEL
Pénicilline Streptomycine	Gibco	15140122
Chlorure	de potassium Sigma	P5405	KCl
Phosphate de potassium monobasique	Sigma	P5655	KH2PO4
Lames de rasoir	Microscopie électronique Sciences	71998	Pour vibratome ; Acier inoxydable à double tranchant, non revêtu
RPMI 1640	Gibco	11875093
SeaPlaque agarose à bas point de fusion	Lonza	50101	Pour fabriquer de l’agarose pour la génération de tranches
Ancre	en tranches Warner Instruments	64-1421
Ancre en tranches (imagerie dynamique)	Warner Instruments	640253	Ancre en tranches pour chambre
d’imagerie dynamiqueBicarbonate	de sodium Sigma	S5761	NaHCO3
Chlorure de sodium	Sigma	S5886	NaCl
Phosphate de sodium monohydraté	Sigma	S9638	NaH2PO4 (monohydrate)
Inhibiteur de trypsine de soja	Sigma	T6522-1G	Inhibiteur de la trypsine de Glycine max (soja)
Stade Adaptateur	Warner Instruments	SA-20MW-AL	Pour l’installation d’une chambre d’imagerie pour les enregistrements de stimulation dynamique sur la platine du microscope
Incubateur de scène	Okolab	H201
Stéréoscope	Leica	IC90 E MSV266
SYTOX Blue Dead Cell Stain	Invitrogen	S34857	Colorant d’acide nucléique bleu-fluorescent
Pipette de transfert	Falcon	357575	Falcon&trade ; Pipettes de transfert jetables en plastique
Système de contrôle de soupape	Warner Instruments	VCS-8	Système pour les enregistrements de stimulation dynamique
Vibratome VT1000 S	Leica	VT1000 S
Bain d’eau	Fisher Scientific	FSGPD02	Fisherbrand Isotemp Bain d’eau de luxe à usage général GPD 02