Article de méthode

Préparation à grande échelle d’exosomes dérivés de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial par culture de bioréacteur 3D

DOI :

10.3791/62221

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26 juillet 2022

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1Department of Orthopedics, The First affiliated hospital of Shenzhen University, Shenzhen Second People's Hospital, 2Guangdong Provincial Research Center for Artificial Intelligence and Digital Orthopedic Technology, Shenzhen Second People's Hospital, 3Department of Child and Adolescent Psychiatry, Shenzhen Kangning Hospital, Shenzhen Mental Health Center, Shenzhen Key Laboratory for Psychological Healthcare & Shenzhen Institute of Mental Health

Dans cet article

Résumé

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Ici, nous présentons un protocole pour produire un grand nombre d’exosomes de qualité GMP à partir de cellules souches mésenchymateuses du liquide synovial à l’aide d’un bioréacteur 3D.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les exosomes sécrétés par les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été suggérés comme des candidats prometteurs pour les lésions cartilagineuses et le traitement de l’arthrose. Les exosomes pour application clinique nécessitent une production à grande échelle. À cette fin, des CSM du liquide synovial humain (hSF-MSC) ont été cultivées sur des billes microporteuses, puis cultivées dans un système de culture dynamique en trois dimensions (3D). En utilisant la culture dynamique 3D, ce protocole a réussi à obtenir des exosomes à grande échelle à partir de surnageants de culture SF-MSC. Les exosomes ont été récoltés par ultracentrifugation et vérifiés par un microscope électronique à transmission, un test de transmission de nanoparticules et un transfert Western. En outre, la sécurité microbiologique des exosomes a été détectée. Les résultats de la détection des exosomes suggèrent que cette approche peut produire un grand nombre d’exosomes de qualité Bonnes pratiques de fabrication (BPF). Ces exosomes pourraient être utilisés dans la recherche sur la biologie des exosomes et le traitement clinique de l’arthrose.

Introduction

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L’arthrose, résultant du cartilage articulaire et de la dégradation osseuse sous-jacente, demeure un défi de taille menant à l’invalidité 1,2. Sans apport sanguin et nerveux, la capacité d’auto-guérison du cartilage est minime une fois blessé 3,4. Au cours des dernières décennies, les thérapies basées sur l’implantation de chondrocytes autologues (ICA) ont fait des progrès dans le traitement de l’arthrose5. Pour l’isolement et l’expansion des chondrocytes, il est nécessaire de prélever le petit cartilage de la zone non portante de l’articulation arthrose, ce qui provoque des lésions au cartilage. En outre, la procédure nécessitera une deuxième opération pour implanter les chondrocytes dilatés6. Ainsi, les thérapies en une étape pour le traitement de l’arthrose sans lésions cartilagineuses font l’objet d’une exploration approfondie.

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) ont été suggérées comme alternatives prometteuses pour le traitement de l’arthrose 7,8. Provenant de plusieurs tissus, les CSM peuvent se différencier en chondrocytes avec une stimulation spécifique. Il est important de noter que les CSM peuvent moduler les réponses immunitaires via un anti-inflammation9. Par conséquent, les CSM présentent des avantages significatifs dans le traitement de l’arthrose en réparant les défauts du cartilage et en modulant la réponse immunitaire, en particulier dans le milieu de l’inflammation. Pour le traitement de l’arthrose, les CSM du liquide synovial (SF-MSC) ont récemment attiré beaucoup d’attention en raison de leur capacité de différenciation des chondrocytes plus forte que les autres sources de CSM10,11. Notamment, à la clinique orthopédique, l’extraction de SF inflammatoire de la cavité articulaire est une thérapie de routine pour soulager le symptôme de douleur des patients atteints d’arthrose. Le SF inflammatoire extrait est généralement éliminé comme un déchet médical. Les patients et les médecins sont prêts à considérer les CSM autologues isolées du SF inflammatoire comme traitement de l’arthrose avec très peu de conflits éthiques. Cependant, le traitement SF-MSC est compromis en raison des risques tumorigènes, du stockage à long terme et des barrières d’expédition éloignées.

Les exosomes, sécrétés par de nombreux types de cellules, y compris les CSM, transportent la plupart des informations biologiques de la cellule mère. Il a été étudié en profondeur en tant que thérapie acellulaire12,13. Selon les ressources mises à jour disponibles sur le site Web du gouvernement des essais cliniques (ClinicalTrials.gov), des études cliniques plus approfondies sur les exosomes sont lancées et entreprises dans les domaines de recherche du cancer, de l’hypertension et des maladies neurodégénératives. Le traitement par exosomes SF-MSC pourrait être un essai passionnant et difficile pour faire face à l’arthrose. Les bonnes pratiques de fabrication (BPF) et la production d’exosomes à grande échelle sont essentielles pour la traduction clinique. L’isolement d’exosomes à petite échelle a été largement réalisé sur la base d’une culture cellulaire bidimensionnelle (2D). Cependant, les stratégies de production d’exosomes à grande échelle doivent être optimisées. Une méthode de fabrication d’exosomes à grande échelle a été développée dans cette étude, basée sur une culture massive de SF-MSC dans des conditions sans xéno. Après ultracentrifugation à partir de surnageants de culture cellulaire, l’innocuité et la fonction des exosomes ont été validées.

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Protocole

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Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique humaine du deuxième hôpital populaire de Shenzhen. Un diagramme schématique des exosomes isolés à partir du protocole in vitro hSF-MSCs est présenté à la figure 1.

1. Culture et identification des SF-MSC humaines

  1. Prélever 20 mL de SF à l’aide d’une seringue et d’une aiguille provenant de patients atteints d’arthrose clinique.
    1. Désinfecter l’articulation du genou du patient atteint d’arthrose. Ponction du tendon du quadriceps fémoral à l’extérieur de la rotule dans la cavité articulaire avec une aiguille 7#.
    2. Extraire 10 mL du liquide articulaire. Couvrir le site de ponction avec le bâtonnet de transfusion et appuyer pendant 5 min.
  2. Éliminer le surnageant SF après centrifugation à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C.
  3. Resuspendre la pastille cellulaire avec 10 mL de 1x solution saline tampon phosphate (PBS), centrifuger à 1 500 x g pendant 10 min à 4 °C et jeter le PBS.
  4. Remettez la pastille en suspension avec 10 mL de milieu de culture CSM humain à une densité cellulaire de 5 x 104 cellules/mL (voir le tableau des matériaux), puis plaquez la suspension dans une boîte de 100 mm.
  5. Incuber la capsule à 37 °C dans une atmosphère contenant 5% de CO2.
  6. Après 48 h, retirez les cellules non adhérentes en changeant le milieu et lavez avec 1x PBS. Remplacez le milieu tous les 3 jours pendant 2 semaines.
  7. Recueillir les surnageants de culture cellulaire.
  8. Identifier les SF-MSC à l’aide de la cytométrie en flux.
    1. Digérer la troisième génération (P3) de SF-MSC, centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Jetez le surnageant et recueillez la pastille de cellule.
      NOTE: Un passage est reconnu comme la sous-culture des cellules vers une autre boîte de culture. Les cellules primaires isolées de SF et ensemencées sur des boîtes sont étiquetées comme passage zéro (P0). À environ 75% de confluence, les cellules sont digérées et détachées des plats, ensemencées sur d’autres plats et étiquetées comme P1.
    2. Ajouter 400 μL de tampon bloquant (1% BSA dans 1x PBS) à la pastille de cellule (5 x 104) et laisser reposer pendant 15 min à température ambiante (RT).
    3. Centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 100 μL de 1x PBS.
    4. Ajouter 1 μL d’anticorps fluorescents monoclonaux CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, HLA-DR (rapport de dilution de 1:100) (voir le tableau des matières) par tube et incuber à TA pendant 30 min.
    5. Laver deux fois avec 1x PBS et jeter le surnageant. Recueillir la pastille de cellule et la remettre en suspension dans 100 μL de 1x PBS.
    6. Détecter sur un cytomètre en flux jusqu’à 10 000 cellules à l’aide de filtres de 525/50 et 585/40 pour détecter les fluorophores.

2.3D culture cellulaire de bioréacteur

  1. Préparation des microporteurs
    1. Gonfler les 0,75 g secs de microtransporteurs (voir le tableau des matériaux) et hydrater dans 1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) (50 mL/g de microporteurs) pendant au moins 3 h à TA.
    2. Décanter le surnageant et laver les microporteurs pendant 5 min dans du DPBS frais (50 mL/g de microporteurs). Jetez le PBS et remplacez-le par 1x DPBS frais (50 mL/g de microsupports).
    3. Stériliser les microporteurs par autoclavage (121 °C, 15 min, 15 psi). Laissez les microporteurs stérilisés s’installer, décanter le surnageant.
    4. Rincer brièvement les microporteurs dans le milieu de culture (50 mL/g de microporteurs) à TA. Laisser les microporteurs s’installer, jeter le surnageant.
  2. Bioréacteur de perfusion
    1. Stériliser le bioréacteur par autoclavage (121 °C, 15 min, 15 psi).
    2. Compter le nombre de CSF-CSF et allouer 2,5 x 107 CSF-CSF et microporteurs au bioréacteur perfusé avec un milieu de culture MSC de qualité GMP (250 mL).
    3. Placer le bioréacteur dans un incubateur contenant 5% de CO2 à 37 °C. Faire pivoter le bioréacteur à une vitesse de 15 tr/min. Changez le milieu de culture tous les 6 jours.
    4. Recueillir les surnageants de culture cellulaire et les microporteurs pour une analyse plus approfondie après la culture pendant 14 jours.

3. Identification des exosomes et détection de sécurité

  1. Ultracentrifugation
    1. centrifuger le surnageant de culture cellulaire à 300 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant; Jetez les débris cellulaires.
    2. Centrifuger les surnageants à 2 000 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant; jeter les plus grandes vésicules (corps apoptotiques et certaines microvésicules plus grandes).
    3. Centrifuger à nouveau le surnageant à 10 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour enlever les vésicules plus grosses; recueillir les granulés et les remettre en suspension dans 40 ml de 1x PBS.
    4. Centrifuger les pastilles en suspension à 120 000 x g pendant 70 min à 4 °C, jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles contenant des exosomes dans 500 μL de 1x PBS.
  2. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
    REMARQUE : Pour chaque passage, 500 μL de l’échantillon ont été injectés dans la chambre à un débit de 30 μL/min. Effectuer l’analyse à 24,4 °C-24,5 °C.
    1. Diluer les échantillons d’exosomes fraîchement isolés avec 1x PBS stérile à 1 mL contenant 107-10 9 /mL de particules et les injecter dans le système d’analyse de suivi des nanoparticules (voir le tableau des matériaux).
    2. Réglez manuellement le système de capture et d’analyse selon le protocole du fabricant. Visualisez les particules par diffusion laser de la lumière et capturez leur mouvement brownien sur vidéo numérique.
    3. Analysez les bandes vidéo enregistrées à l’aide d’un logiciel (voir le tableau des matériaux) en suivant au moins 200 particules individuelles par exécution.
  3. Microscopie électronique à transmission
    1. Fixer les exosomes dans 4% de paraformaldéhyde (dans froid 1x DPBS) pendant 5 min.
    2. Monter 5 μL des exosomes sur des grilles de cuivre. Dans cette expérience, la concentration d’exosomes est de 1 mg/mL quantifiée par un kit de dosage des protéines (voir Tableau des matériaux).
    3. Incorporer les exosomes dans de l’acide phosphotungstique à 3% pendant 10 minutes sur de la glace. Retirer l’excès d’acide et sécher les échantillons à TA.
    4. Imager les échantillons d’exosomes par un TEM à une tension d’accélération de 100 kV.
  4. Western blotting
    1. Ajouter 300 μL de tampon de lyse (1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,1 M Tris HCl, pH 7) et cocktail d’inhibiteurs de protéase (voir Tableau des matériaux) aux exosomes.
    2. Mélangez les exosomes dans le tampon de lyse en pipetant de haut en bas et laissez-le reposer sur la glace pendant 20 minutes.
    3. Centrifuger le mélange à 9 391 x g pendant 10 min à 4 °C et recueillir le surnageant. Mesurer la concentration en protéines à l’aide d’une trousse d’analyse des protéines (voir le tableau des matériaux).
    4. Ajouter 100 μL de tampon de charge protéique 4x et chauffer à 100 °C pendant 10 min.
    5. Charge de 15 μL de protéines à une concentration de 10 mg/mL et fonctionnement par électrophorèse sur gel (120 V, 70 min) et électrobuvardage à 100 V, 60 min à 4 °C.
    6. Détecter les marqueurs non spécifiques aux exosomes (calnexine) et les biomarqueurs exosomiques (CD9, CD63 et CD81) par transfert Western fluorescent (voir le tableau des matériaux).
  5. Test de sécurité
    1. Pour la détection des bactéries, des champignons et de Mycobacterium tuberculosis , suivez les étapes 3.5.2 à 3.5.5.
    2. Ensemencer 100 μL de la solution d’exosomes (1 mg/mL) sur une plaque de culture de gélose au sang (voir le tableau des matières) et incuber la plaque de culture à 37 °C pendant 24 h.
    3. Ensemencer 100 μL de la solution d’exosomes (1 mg/mL) sur une plaque de sabouraud gélose moyenne (voir tableau des matières) et incuber à 35 °C pendant 48 h.
    4. Ensemencer 100 μL de la solution d’exosomes (1 mg/mL) sur une plaque de milieu de culture Lowenstein-Jensen (voir le tableau des matières) et incuber à 37 °C pendant 3 semaines.
    5. Détecter l’apparition de bactéries, de champignons et de colonies de Mycobacterium tuberculosis par observation macroscopique.
      NOTE: Les critères d’évaluation de l’innocuité des exosomes sont l’absence de micro-organismes sur la plaque de culture.
    6. Pour la détection des mycoplasmes, suivez les étapes 3.5.7 à 3.5.9.
    7. Resuspendre les exosomes dans 50 μL de solution tampon incluse dans le kit et chauffer à 95 °C pendant 3 min.
    8. Amplifier le mycoplasme dans une solution d’exosomes à l’aide d’un kit de détection de mycoplasmes PCR (voir le tableau des matériaux).
    9. Détecter les produits PCR sur électrophorèse sur gel d’agarose à 1,5% (30 min, 120 V).

4. Détection in vitro de la fonction exosome

  1. Marquage des exosomes
    1. Étiqueter 100 μL d’exosomes (1 mg/mL) avec 1 mM Dil (1000x) (voir le tableau des matières) et incuber à TA pendant 30 min.
    2. Récupérer les exosomes par ultracentrifugation à 100 000 x g pendant 70 min. Remettez la pastille en suspension dans 500 μL de 1x PBS.
  2. Chargement de mimères Cy3-miR-140 dans des exosomes
    1. Mélanger 1 μg/μL de protéine exosomale et 5 μmol/mL de Cy3-miR-140 dans un volume final de 400 μL de tampon d’électroporation (1,15 mM de phosphate de potassium (pH 7,2), 25 mM de chlorure de potassium et 21 % (v/v) (voir le tableau des matières).
    2. Transférer le mélange dans des cuvettes d’électroporation froides de 0,4 cm et électropoter à une capacité de 300 V/100 μF à l’aide d’un système de transfection génique (voir Tableau des matériaux).
    3. Immédiatement après l’électroporation, maintenir le mélange à TA pendant 30 minutes pour s’assurer que la membrane exosomique est complètement restaurée.
    4. Traiter les mélanges avec une unité de RNase A (voir le tableau des matières) pendant 20 minutes pour éliminer les imitations miARN à l’extérieur des exosomes.
    5. Ultracentrifuger le mélange d’exosomes à 120 000 x g pendant 90 min, jeter le surnageant et remettre les exosomes en suspension dans 500 μL de 1x PBS.
  3. Dosage de l’absorption des exosomes
    1. Ensemencer les chondrocytes (1 x 107) dans des boîtes confocales de 35 mm avec 1 mL de DMEM/F12 contenant 10 % de FBS.
    2. Après 24 h, traiter les chondrocytes avec des exosomes marqués DiI (100 ng / mL) ou des exosomes chargés de cy3-miR-140 (100 ng / mL) pendant 1 h.
    3. Laver avec 1x PBS trois fois, puis étiqueter avec DAPI (10 ng / mL) pendant 10 minutes à TA.
    4. Enregistrer le signal de fluorescence en microscopie confocale à fluorescence à balayage laser (CLSM) à l’aide des filtres appropriés (voir le tableau des matériaux).

5. Analyse statistique

  1. Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un logiciel statistique approprié.
    NOTA : Les données représentatives de chaque figure ont été exprimées sous forme de moyenne ± écart-type. Le test t de Student a été utilisé pour comparer deux groupes à l’aide d’un logiciel de statistiques. Une ANOVA unidirectionnelle suivie du multiple de Tukey a été réalisée dans le cas de comparaisons entre plusieurs groupes. P valeurs <0,05 (*), <0,01 (**) ou <0,001 (***).

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cytométrie en flux a été utilisée pour identifier les marqueurs de surface des SF-MSC, selon les critères minimaux pour définir les CSM humaines recommandés par l’International Society for Cellular Therapy14,15. L’analyse par cytométrie en flux a révélé que les CSF-CSF cultivées dans cette étude répondaient aux critères d’identification des CSM. Ils étaient négatifs pour CD34, CD45 et HLA-DR (inférieurs à 3 %) et positifs pour CD73, CD90 et CD105 (supérieurs à...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules souches mésenchymateuses ont été largement utilisées en médecine régénérative en raison de leur auto-renouvellement, différenciées en cellules tissulaires ayant des fonctions spécialisées et des effets paracrines16,17. Notamment, les effets paracrines exercés par les exosomes ont attiré beaucoup d’attention18. Les exosomes transportent la bio-information des CSM et remplissent leur fonction biologique et surmontent les lacunes...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81972116, n° 81972085, n° 81772394); Programme clé de la Fondation des sciences naturelles de la province du Guangdong (n ° 2018B0303110003); Projet de coopération internationale du Guangdong (No.2021A0505030011); Projets scientifiques et technologiques de Shenzhen (No. GJHZ20200731095606019, No. JCYJ20170817172023838, No. JCYJ20170306092215436, No. JCYJ20170413161649437); Fondation chinoise des sciences postdoctorales (No.2020M682907); Fondation pour la recherche fondamentale et appliquée du Guangdong (n° 2021A1515010985); Projet Sanming de médecine à Shenzhen (SZSM201612079); Fonds spéciaux pour la construction d’hôpitaux de haut niveau dans la province du Guangdong.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit de dosage BCAThermoFisher23227Dosage de la concentration en protéines
Plaque de gélose au sangNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0903Culture bactérienne
Anticorps CD105ElabscienceE-AB-F1243CCytométrie en flux
Anticorps CD34ElabscienceElabscience E-AB-F1143CCytométrie en flux
Anticorps CD45BD Bioscience555483Cytométrie
en flux Anticorps CD63Abclonal  ; A5271Western blot
Anticorps CD73ElabscienceE-AB-F1242CCytométrie en flux
Anticorps CD81ABclonal  ; A5270Western blot
CD9anticorps Abclonal  ; A1703Western blot
Anticorps CD90ElabscienceE-AB-F1167C
Cytométrie en flux CentrifugeuseEppendorfCentrifuge 5810R
Incubateur CO2ThermoCell culture
Confocale laser à balayage fluorescenceZEISSLSM 800
CytodexGE HealthcareMicrocarrier
DilThermoFisherD1556Étiquette d’exosome
EZ-PCR Kit de détection de mycoplasmesBI20-700-20Détection de mycoplasmes
Cytométrie en fluxBeckmanIdentification MSC
Gene Pulser II SystemBio-Rad Laboratories1652660Transfection de gènes
GraphPad Prism 8.0.2GraphPad Software, Inc.Version 8.0.2
Anticorps HLA-DRElabscienceE-AB-F1111CCytométrie en flux
Milieu de culture Lowenstein-JensenNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.T0573Culture de Mycobacterium tuberculosis
MesenGroStemRDMGro-500Culture MSC
Nanosight NS300MalvernNanosight NS300Analyse de suivi des nanoparticules
Logiciel NTA 2.3MalvernAnalyse de données
Odyssey FCGene Company LimitedTransfert occidental fluorescent
OptiPrep tampon d’électroporationSigmaD3911Transfection de gènes
Cocktail d’inhibiteurs de protéaseSigmaP8340Inhibiteur de protéinase
RNase AQiagen158924Élimination de l’ARN
Plaque de gélose SabouraudNanjing Yiji Biochemical Technology Co., Ltd.P0919Culture de champignons
TEMJEM-1200EX
Le système de culture cellulaire rotatif (RCCS)SyntheconRCCS-4HDUltracentrifugeuse de culture 3D
BeckmanOptima XPN-100Centrifugeuse à exosomes

Références

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Exosomes du liquide synovialcellules souches m senchymateusesculture en bior acteur 3Disolement d exosomesbilles de microporteursultracentrifugationsuivi des nanoparticulesWestern blotcytom trie en fluxmarqueurs d exosomes

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