Dissection efficace et culture des cellules épithéliales rétiniennes primaires de pigment de souris

Résumé

Ce protocole, qui a été initialement rapporté par Fernandez-Godino et coll. en 2016¹, décrit une méthode pour isoler efficacement et culturer les cellules RPE de souris, qui forment un monocouche RPE fonctionnel et polarisé en moins d’une semaine sur les plaques Transwell. La procédure dure environ 3 heures.

Résumé

Les troubles oculaires affectent des millions de personnes dans le monde, mais la disponibilité limitée des tissus humains entrave leur étude. Les modèles murins sont des outils puissants pour comprendre la pathophysiologie des maladies oculaires en raison de leurs similitudes avec l’anatomie et la physiologie humaines. Les altérations de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), y compris les changements de morphologie et de fonction, sont des caractéristiques communes partagées par de nombreux troubles oculaires. Cependant, l’isolement et la culture réussis des cellules primaires de RPE de souris sont très provocants. Cet article est une version audiovisuelle mise à jour du protocole précédemment publié par Fernandez-Godino et coll. en 2016 pour isoler et culture efficacement les cellules primaires de l’EPR de souris. Cette méthode est hautement reproductible et se traduit par des cultures robustes de monomères RPE fortement polarisés et pigmentés qui peuvent être maintenus pendant plusieurs semaines sur Transwells. Ce modèle ouvre de nouvelles voies pour l’étude des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux maladies oculaires. En outre, il fournit une plate-forme pour tester des approches thérapeutiques qui peuvent être utilisées pour traiter les maladies oculaires importantes avec des besoins médicaux non satisfaits, y compris les troubles rétiniens héréditaires et les dégénérescences maculaires.

Introduction

Ce protocole, qui a été initialement rapporté par Fernandez-Godino et coll. en 2016¹, décrit une méthode pour isoler efficacement et culturer les cellules d’épithélium rétinien de pigment de souris (RPE), qui forment un monocouche RPE fonctionnel et polarisé en moins d’une semaine sur les plaques Transwell. Le RPE est un monocouche situé dans l’œil entre la rétine neurale et la membrane du Bruch. Cette seule couche se compose de cellules épithéliales fortement polarisées et pigmentées reliées par des jonctions serrées, présentant une forme hexagonale qui ressemble à un nid^{d’abeilles 2}. Malgré cette apparente simplicité h....

Protocole

Les lignes directrices de l’Énoncé arvo sur l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle ont été suivies.

REMARQUE : Cette méthode a été prouvée réussie avec des souris de différents milieux génétiques, y compris C57BL/6J, B10. D2-Hc^o H2^d H2-T18^c/oSnJ, et souris albinos, à différents âges. Utilisez de préférence des souris âgées de 8 à 12 semaines pour obtenir des cellules RPE. Les cellules RPE de souris plus âgées prolifèrent moins en culture et les souris plus jeunes ont des cellules de moins en moins petites, ce qui nécessite la mise en commun des yeux de différents animaux pour avo....

Résultats

Ce protocole a été utilisé pour isoler et culturer les cellules RPE des souris génétiquement modifiées¹. Aucune différence n’a été observée entre les souches de souris ou le sexe. Les résultats ont aidé à comprendre certains aspects importants du mécanisme sous-jacent aux maladies oculaires telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge, qui est la cause la plus fréquente de perte de vision chez les^{personnes âgées 9}. Les cellules de RPE isolées suivant ce protocole ont.......

Discussion

Alors que plusieurs méthodes d’isolement cellulaire et de culture de l’EPR de souris avaient été^{développées avant 1,13,20,22,26,27}, la méthode fernandez-Godino a d’abord utilisé des inserts membranaires permettant la croissance efficace des cellules RPE en culture pendant les semaines^1,

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringue à embout Luer-Lok BD de 10 ml, jetable	BD Biosciences	309604
Tube à centrifuger de 15 ml	VWR International	21008-103
Tube à centrifuger de 50 ml	VWR International	21008-951
Alpha Minimum Essential Medium	Sigma-Aldrich	M4526-500ML
Micro pince coudée	WPI	501727
Centrifugeuse de paillasse	n’importe quel
incubateur de CO2	Thermo	HERA VIOS 160I CO2 SST TC 120V
Microscope de dissection	Tout
Dulbecco' s Phospate Buffered Saline sans calcium, sans magnésium	Gibco	14190144
Dumont #5 45° ; Pince à épiler de biologie médicale, pointe de 0,05 x 0,01 mm, longueur 11 cm	WPI	14101
Éthanol	Sigma-Aldrich	E7023-500ML
Falcon Easy-Grip Plat de culture cellulaire en polystyrène transparent, 35 mm	BD Biosciences	353001
Sérum de veau fœtal	Hyclone	SH30071.03	Chaleur inactivée.
Hank' solution saline équilibrée plus calcium et magnésium, sans Phenol Red	Life Technologies	14175095
Hank' s Solution saline équilibrée plus calcium et magnésium, sans rouge de phénol B6	Life Technologies	14025092
HEPES 1M	Gibco	15630106
Hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H-3506 1G
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H-0396
Hotte à flux laminaire	Thermo	CLASSE II A2 4 115V PACKAGECLA
Laminin 1mg/ ml	Sigma-Aldrich	L2020-1 MG	Dilué dans du PBS à 37°C à 1mg/ml
McPherson-Vannas Micro Ciseaux 8 cm de long		WPI 503216
Acides aminés non essentiels 100X	Gibco	11140050
N1 Supplément 100X	Sigma-Aldrich	N6530-5ML
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15140-148
Lame chirurgicale stérile en acier au carbone Bard-Parker taille 11	Fisher-Scientific	08-914B
Taurine	Sigma-Aldrich	T-0625
Plaques 12 puits traitées par culture tissulaire	Fisher-Scientific	08-772-29
Plaques 6 puits traitées par culture tissulaire	Fisher-Scientific	14-832-11
Supports Transwell 6,5 mm	Sigma-Aldrich	CLS3470-48EA
Triiodo-thyronine	Sigma-Aldrich	T-5516
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge phénol	Gibco	25200056
pince à épiler, Dumont #5 Medical Biology 11 cm, incurvé, acier inoxydable 0,02 x 0,06 mm Mod tips	WPI	500232
Vannas Ciseaux 8cm de long, acier inoxydable	WPI	501790
Whatman Puradisc 25mm Filtres Seringue 0.45&mu ; taille des pores	Fisher-Scientific	6780-2504