Method Article

Analyse multiplexée de l’expression génique rétinienne et de l’accessibilité de la chromatine à l’aide de scRNA-Seq et scATAC-Seq

DOI:

10.3791/62239

⸱

March 12th, 2021

 ,  ,  , 
1Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Psychiatry and Behavioral Science, The Johns Hopkins Hospital, 3Department of Ophthalmology, The Johns Hopkins Hospital, 4Department of Neurology, The Johns Hopkins Hospital, 5Institute for Cell Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 6Kavli Neuroscience Discovery Institute, Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, les auteurs démontrent l’utilité de MULTI-seq pour le phénotypage et les scRNA-seq et scATAC-seq appariés ultérieurs dans la caractérisation des profils d’accessibilité transcriptomique et chromatine dans la rétine.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De puissantes techniques de séquençage de nouvelle génération offrent une analyse robuste et complète pour étudier le fonctionnement des réseaux de régulation des gènes rétiniens pendant le développement et dans les états pathologiques. Le séquençage de l’ARN unicellulaire nous permet de profiler de manière exhaustive les changements d’expression génique observés dans le développement rétinien et la maladie au niveau cellulaire, tandis que l’ATAC-Seq unicellulaire permet de profiler l’analyse de l’accessibilité de la chromatine et de la liaison au facteur de transcription à une résolution similaire. Ici, l’utilisation de ces techniques dans la rétine en développement est décrite, et MULTI-Seq est démontré, où les échantillons individuels sont marqués avec un complexe oligonucléotide-lipide modifié, permettant aux chercheurs à la fois d’augmenter la portée des expériences individuelles et de réduire considérablement les coûts.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprendre comment les gènes peuvent influencer le devenir cellulaire joue un rôle clé dans l’interrogation de processus tels que la maladie et la progression embryonnaire. Les relations complexes entre les facteurs de transcription et leurs gènes cibles peuvent être regroupées dans des réseaux de régulation des gènes. De plus en plus de preuves placent ces réseaux de régulation des gènes au centre de la maladie et du développement à travers les lignées évolutives1. Alors que les techniques précédentes telles que la qRT-PCR se concentraient sur un seul gène ou un ensemble de gènes, l’application de la technologie de séquençage à haut débit permet le profilage de transcriptomes cellulaires complets.

RNA-seq offre un aperçu de la transcriptomique à grande échelle 2,3. Le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) donne aux chercheurs la possibilité non seulement de profiler les transcriptomes, mais aussi de relier des types cellulaires spécifiques aux profils d’expression génique4. Ceci est réalisé bioinformatiquement en alimentant des profils cellulaires individuels dans des algorithmes de tri à l’aide de marqueurs de gènes connus5. Le multiplexage à l’aide du séquençage d’indices marqués par les lipides (MULTI-seq) offre une diversité sans précédent dans le nombre de profils scRNA-Seq pouvant être collectés6. Cette technique à base de lipides diffère des autres techniques d’indexation des échantillons telles que le hachage cellulaire qui reposent sur la présence d’antigènes de surface et d’anticorps de haute affinité au lieu de l’intégration de la membrane plasmique7. Non seulement il est maintenant possible de profiler les profils d’expression génique en types de cellules, mais différentes expériences peuvent être combinées en une seule bibliothèque de séquençage, ce qui réduit considérablement le coût d’une expérience individuelle scRNA-seq6. Le coût de scRNA-seq peut sembler prohibitif pour une utilisation dans des expériences de phénotypage où de nombreux génotypes, conditions ou échantillons de patients différents sont analysés, mais le multiplexage permet de combiner jusqu’à 96 échantillons dans une seule bibliothèque6.

Le profilage de l’expression des gènes via scRNA-seq n’a pas été la seule technique basée sur le séquençage à haut débit à révolutionner la compréhension actuelle de la façon dont les mécanismes moléculaires dictent le destin cellulaire. Bien que la compréhension des transcriptions génétiques présentes dans une cellule permette d’identifier le type de cellule, il est tout aussi important de comprendre comment l’organisation génomique régule le développement et la progression de la maladie. Les premières études reposaient sur la détection d’un clivage médié par la DNase de séquences non liées aux histones, suivie d’un séquençage des fragments d’ADN résultants pour identifier les régions de chromatine ouverte. En revanche, le test unicellulaire pour le séquençage de la chromatine accessible aux transposons (scATAC-seq) permet aux chercheurs de sonder l’ADN avec un transposon domestiqué pour profiler facilement la chromatine ouverte au niveau de nucléotide unique8. Cela a subi une mise à l’échelle similaire à scRNA-seq et maintenant les chercheurs peuvent identifier des types de cellules individuelles et profiler des phénotypes sur des milliers de génomes individuels8.

L’appariement de scRNA-seq et scATAC-seq a permis aux chercheurs de profiler des milliers de cellules pour déterminer les populations cellulaires, l’organisation génomique et les réseaux de régulation des gènes dans les modèles de maladie et les processus de développement 9,10,11,12. Ici, les auteurs expliquent comment utiliser d’abord MULTI-seq pour condenser le phénotypage d’une myriade de modèles animaux et utiliser scRNA-seq et scATAC-seq appariés pour mieux comprendre le paysage de la chromatine et les réseaux de régulation dans ces modèles animaux.

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Protocol

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L’utilisation d’animaux pour ces études a été menée à l’aide de protocoles approuvés par le Comité de soins et d’utilisation des animaux de Johns Hopkins, conformément aux lignes directrices d’ARRIVE, et a été effectuée conformément aux lignes directrices et aux règlements pertinents.

1. MULTI-seq

  1. Préparation des médias
    1. Préparer et équilibrer l’inhibiteur ovomucoïde, 10 mg d’inhibiteur ovomucoïde et 10 mg d’albumine par mL de solution saline équilibrée (EBSS) d’Earle, pendant 30 minutes avant utilisation13. Équilibrer avec 95% O2:5% CO2 dans un incubateur.
      1. Préparer une solution de dissociation de la papaïne, 20 unités/mL de papaïne et 0,005 % de DNase dans l’EBSS, au cours de cette étape d’incubation13.
        REMARQUE: Un flacon de solution de DNase sera suffisant pour 5 échantillons. Des flacons supplémentaires peuvent devoir être reconstitués si vous effectuez MULTI-seq sur plus de 5 échantillons.
    2. Préparer des solutions de codage à barres oligo modifiées par les lipides.
      1. Effectuez une dilution unique du code-barres pour chaque échantillon en combinant 0,5 μL de solution mère de code-barres de 100 μM avec 4,5 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
      2. Pour préparer une solution d’ancrage:code-barres à un rapport molaire de 1:1, mélanger 4,4 μL de dilution de code-barres de 10 μM, 0,9 μL de solution d’ancrage de 50 μM et 16,7 μL de PBS et placer sur de la glace. La concentration finale pour les brins de code-barres et les brins d’ancrage doit être de 2 μM.
      3. Pour préparer la solution de co-ancrage, mélanger 0,88 μL de solution de co-ancrage de 50 μM et 21,12 μL de PBS et placer sur de la glace. La concentration finale de la co-ancre doit être de 2 μM. Multipliez les volumes de cette étape par 1,1 fois le nombre d’échantillons.
    3. Pour produire 1 % de BSA dans le PBS, dissoudre 0,1 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 10 mL de PBS et placer sur de la glace.
    4. Pour fabriquer du PBS avec un inhibiteur de la RNase, combinez 2,5 μL d’inhibiteur de 40 U/μL de RNase avec 197,5 μL de PBS et stockez-le sur de la glace. Multipliez les volumes de cette étape par 1,1 fois le nombre d’échantillons.
  2. Dissociation de l’échantillon
    1. Euthanasier les animaux par luxation cervicale et/ou asphyxie au CO2 conformément aux exigences institutionnelles de l’IACUC. La méthode d’euthanasie dépendra des exigences institutionnelles et de l’organisme modèle utilisé.
    2. Disséquer la rétine des deux yeux dans un PBS froid sous un microscope à dissection et transférer dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL à l’aide d’une pipette de transfert.
    3. Transférer 500 μL de la solution de papaïne dans un tube de 1,5 mL pour chaque échantillon.
    4. Placez les échantillons dans la solution de papaïne et boucher immédiatement les tubes.
    5. Incuber les tubes contenant les échantillons à 37 °C, 5% de CO2 pendant 30 min. Inverser les flacons 3 fois toutes les 10 minutes. Les échantillons doivent se dissocier progressivement à chaque cycle d’inversions.
    6. Remettre les flacons à température ambiante et triturer chaque échantillon 3 à 4 fois avec une pipette de 1 mL réglée sur 300 μL.
    7. Laissez les morceaux de tissu non dissocié restant après la trituration se déposer.
    8. Retirez la suspension cellulaire trouble tout en évitant tout morceau de tissu non dissocié et placez la suspension cellulaire de chaque échantillon dans un nouveau tube stérile à bouchon vissé de 15 mL.
    9. Centrifuger les suspensions de cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
    10. Au cours de l’étape de centrifugation, préparer le milieu de remise en suspension cellulaire.
      1. Mélanger 857 μL d’EBSS (flacon 1) avec 95 μL de solution reconstituée d’inhibiteur d’albumine-ovomucoïde dans un tube stérile de 1,5 mL à bouchon vissé. Ajouter 48 μL de solution de DNase économisée à partir du 1.1.1. Multipliez les volumes de cette étape par 1,1 fois le nombre d’échantillons.
    11. Jeter le surnageant, en prenant soin de retenir les pastilles cellulaires, et remettre immédiatement en suspension les pastilles cellulaires dans une solution de remise en suspension cellulaire de 1 mL préparée à l’étape 1.2.10.
    12. Préparer un gradient de densité discontinu.
      1. Pour chaque échantillon, ajouter 1,6 mL de solution d’inhibiteur d’ovomucoïde dans un nouveau tube stérile à bouchon vissé de 15 mL et superposer soigneusement la suspension cellulaire sur le dessus. L’interface entre les deux couches du dégradé doit être visible, mais certains mélanges n’affectent pas les résultats.
    13. Centrifuger les gradients de densité discontinus à 70 x g pendant 6 min à température ambiante. Les cellules dissociées doivent s’agglomérer au fond des tubes tandis que les fragments de membrane restent à l’interface.
    14. Jeter le surnageant et ajouter 200 μL de PBS pour laver les cellules granulées. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
    15. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 180 μL de PBS avec un inhibiteur de la RNase. Faire passer les cellules à travers une passoire cellulaire de 40 μm dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL.
  3. Codage à barres cellulaire
    1. Ajouter 20 μL de solution anchor:barcode à chaque échantillon et pipette doucement pour mélanger. Assurez-vous que chaque échantillon reçoit une solution d’ancrage:code-barres unique et incuber sur de la glace pendant 5 min.
      1. Préparer les matériaux nécessaires à la génération de billes de gel en émulsion (GEM) et au codage à barres au cours de cette incubation14.
    2. Ajouter 20 μL de solution de co-ancrage à chaque échantillon et pipeter doucement pour mélanger. Incuber sur de la glace pendant 5 min.
    3. Ajouter 1 mL de BSA glacé à 1 % dans du PBS à chaque échantillon et centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
    4. Retirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire et ajoutez 400 μL glacé à 1 % de BSA dans le PBS. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
      1. Répétez l’étape 1.3.4 pour un total de 2 lavages. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 400 μL de glace froide à 1 % de BSA dans le PBS.
    5. Déterminer la concentration de cellules pour chaque échantillon à l’aide d’un hémocytomètre.
      1. Déterminez le nombre total de cellules à charger pour chaque échantillon. En règle générale, il s’agit du nombre total de cellules souhaitées divisé par le nombre d’échantillons. Cependant, si une réplique biologique pour une condition a été perdue, sa part peut être divisée entre les autres répliques biologiques de cette condition.
      2. Divisez le nombre de cellules souhaitées pour chaque échantillon par la concentration cellulaire de cet échantillon calculée à l’étape 3.5 afin de déterminer le volume requis pour charger le nombre de cellules souhaité.
    6. Combiner les volumes calculés à l’étape 3.5.2 de chaque échantillon dans un nouveau tube centrifuge stérile de 1,5 mL. Il est prudent de doubler le volume prélevé sur chaque échantillon en cas d’échec de la génération GEM.
      1. Déterminer la concentration cellulaire « finale » des échantillons combinés à l’aide d’un hémocytomètre.
  4. Génération GEM et codage à barres
    1. Utilisez des échantillons combinés pour générer et code-barres GEMs14.
  5. Nettoyage post-GEM-RT et amplification de l’ADNc
    1. Préparer les matériaux pour le nettoyage post-transcriptase inverse GEM et l’amplification de l’ADNc conformément aux instructions du fabricant avec les modifications suivantes14. Effectuez le nettoyage post-GEM-RT par sélection de taille14.
      1. Augmenter le volume d’éthanol à 80 % préparé de 2 mL.
      2. Préparer le mélange d’amplification de l’ADNc sur la glace14. Ajouter 1 μL d’amorce MULTI-seq de 2,5 μM au mélange d’amplification de l’ADNc. Vortex pendant 5 s et centrifugeuse pendant 5 s dans une mini centrifugeuse de paillasse.
    2. Effectuer une amplification de l’ADNc14. L’ADNc peut être stocké à 4 °C jusqu’à 72 h à ce stade.
    3. Effectuez le nettoyage de l’ADNc par sélection de taille14. L’ADNc transcription endogène peut être conservée à 4 °C jusqu’à 72 h ou à -20 °C jusqu’à 4 semaines à ce stade.
      1. Ne jetez pas le surnageant du premier tour de sélection de taille . Cette fraction contient les exemples de codes-barres. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL.
      2. Conservez le surnageant sur la glace.
    4. Vortex pour remettre en suspension le réactif de sélection de taille à base de billes paramagnétiques et ajouter 260 μL de réactif de sélection de taille à base de perles paramagnétiques (3,2x final) et 180 μL d’isopropanol à 100% (1,8x) au surnageant. Pipettez le mélange 10 fois et incubez à température ambiante pendant 5 min.
    5. Placez le tube sur une grille magnétique et attendez que la solution disparaisse. Ensuite, retirez et jetez le surnageant.
    6. Ajouter 500 μL d’éthanol à 80 % aux billes et laisser reposer pendant 30 s. Retirez et jetez le surnageant.
      1. Répétez l’opération pour un total de 2 lavages.
    7. Centrifugez brièvement les billes et retournez au rack magnétique. Démarrez une minuterie pendant 2 min.
    8. Retirez l’éthanol restant avec une pipette P10 et séchez à l’air libre les billes sur la grille magnétique pendant le reste des 2 minutes. Ne pas dépasser 2 min.
    9. Retirez les billes du rack magnétique et remettez en suspension dans un tampon d’élution (EB) de 100 μL. Pipette à fond pour remettre en suspension.
    10. Incuber à température ambiante pendant 2 min.
    11. Retournez au rack magnétique et attendez que la solution disparaisse.
    12. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL.
    13. Répétez les étapes 1.5.4 à 1.5.12. Réduire de moitié le volume de tampon EB utilisé à l’étape 1.5.9.
    14. Déterminer la concentration d’ADN de code-barres et la distribution de la taille à l’aide d’un kit de dosage haute sensibilité dsDNA et d’un fluoromètre et d’un analyseur defragments 15,16. L’ADNc à code-barres peut être conservé à 4 °C jusqu’à 72 h ou à -20 °C jusqu’à 4 semaines à ce stade.
  6. Construction d’une bibliothèque de codes-barres
    1. Préparer 1 mL d’éthanol à 80 %.
    2. Préparez le mélange maître PCR de la bibliothèque de codes à barres dans un tube de bande PCR stérile : combinez 26,25 μL de 2x mélange prêt pour la PCR à démarrage à chaud, 2,5 μL d’apprêt Universal i5 de 10 μM, 2,5 μL d’amorce RPI de 10 μM, 3,5 ng d’ADNc de code-barres (volume déterminé par la concentration à partir de l’étape 5.14) et suffisamment d’eau sans nucléase pour porter le volume final à 50 μL.
      1. Utilisez une introduction RPI unique pour chaque bibliothèque de codes-barres si plusieurs bibliothèques MULTI-seq sont séquencées ensemble.
    3. Soumettre le mélange maître de la bibliothèque de codes-barres à une préparation de bibliothèque PCR: 95 °C pendant 5 min; 10 cycles de 98 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 30 s, 72 °C pendant 30 s; 72 °C pendant 1 min; puis maintenir à 4 °C.
    4. Vortex pour remettre en suspension le réactif de sélection de taille à base de perles paramagnétiques.
    5. Retirez le produit PCR du thermocycleur et ajoutez 80 μL (1,6x) de réactif de sélection de taille à base de billes paramagnétiques. Pipette à fond.
    6. Incuber à température ambiante pendant 5 min. Placez le séparateur magnétique en position haute et attendez que la solution disparaisse.
    7. Retirez et jetez le surnageant.
    8. Ajouter 200 μL d’éthanol à 80% aux billes et laisser reposer pendant 30 s. Retirez et jetez le surnageant.
      1. Répétez l’étape 1.6.8 pour un total de 2 lavages.
    9. Centrifugez brièvement le tube et placez-le sur le séparateur magnétique en position basse. Démarrez une minuterie pendant 2 min.
    10. Retirez l’éthanol restant avec une pipette P20 et séchez à l’air les billes sur le séparateur magnétique pendant le reste des 2 minutes. Ne pas dépasser 2 min.
    11. Retirez le tube du séparateur magnétique et remettez en suspension les billes dans 25 μL de tampon EB. Mélangez soigneusement la pipette pour remettre les perles en suspension.
    12. Incuber pendant 2 min à température ambiante.
    13. Revenez au séparateur magnétique en position basse et attendez que la solution disparaisse. Transférez le surnageant dans un nouveau tube à bande PCR.
    14. Quantifiez la concentration de la bibliothèque d’expressions et de la bibliothèque de codes-barres et la distribution de la taille des fragments à l’aide du kit de dosage haute sensibilité adsDNA et du fluoromètre et de l’analyseur de fragments.
  7. 3' Construction de la bibliothèque d’expression génique
    1. Effectuer la construction de la bibliothèque d’expression génique 3' selon les instructions du fabricant14.
  8. Séquençage
    1. En plus de la bibliothèque d’ADNc endogène amplifiée à l’étape 7, soumettez la bibliothèque de codes-barres amplifiée à l’étape 6. Pour plus de simplicité, soumettez ces bibliothèques séparément ou, à titre de mesure rentable, incluez une aliquote de l’échantillon de matériel de codage à barres avec la bibliothèque d’ADNc endogène. Ciblez entre 20 000 et 50 000 ADNc et 3 000 à 5 000 lectures de codes-barres par cellule.
    2. Convertissez les fichiers bcl de séquençage résultants en fichiers fastq par cellranger mkfastq et comptez les matrices générées à partir de ceux-ci par cellranger count.
    3. Exemples déconvolutes après l’analyse Cellranger à l’aide du package deMULTIplex r disponible dans le référentiel GitHub MULTI-seq (https://github.com/chris-mcginnis-ucsf/MULTI-seq).

2. ScRNA-seq apparié et scATAC-seq

  1. Tissu de congélation éclair pour scATAC-seq et fixation au méthanol des cellules rétiniennes pour scRNA-seq
    1. Préparation des médias
      1. Pour préparer les solutions pour la dissociation rétinienne, répétez les étapes 1.1.1 et 1.1.4.
      2. Préparez un bain de glace carbonique à l’éthanol dans un petit seau à glace.
      3. Préparer 15 mL d’éthanol à 70 % en ajoutant 10,5 mL d’éthanol à 4,5 mL d’eau sans nucléase.
      4. Ajoutez suffisamment de glace carbonique au seau à glace (de préférence sous forme de granulés) pour que 15 ml de liquide s’élèvent pour recouvrir la glace. Ajouter les 15 mL d’éthanol.
      5. Placez le PBS sur de la glace et 1 mL d’aliquotes de méthanol à 100 % dans un congélateur pratique à -20 °C.
    2. Préparation des échantillons
      1. Suivre les étapes 1.2.1 et 1.2.2 pour isoler les rétines; cependant, cette fois, placez chaque rétine dans un tube de microcentrifugation séparé.
      2. Pour les échantillons destinés à scATAC-seq, retirer tout liquide du tube de microcentrifugation à l’aide d’une pipette P200 et immédiatement boucher et placer le tube dans un bain de glace sèche à l’éthanol pour geler l’échantillon.
      3. Pour les échantillons destinés à scRNA-seq, pour dissocier les cellules, répétez les étapes 1.2.3 à 1.2.15 sur la rétine disséquée.
      4. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 3 min à température ambiante.
      5. Retirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
      6. Ajouter 1 mL de PBS réfrigéré et mélanger doucement la pipette 10 fois ou jusqu’à ce que les cellules soient complètement en suspension.
      7. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
        1. Répétez les étapes 2.1.2.5 à 2.1.2.7 pour un total de 2 lavages.
      8. Retirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
      9. Ajouter 100 μL de PBS réfrigéré et mélanger doucement 10x ou jusqu’à ce que les cellules soient complètement en suspension.
      10. Commencez à vortexer le tube à la vitesse la plus basse. Ajouter 900 μL de méthanol réfrigéré (-20 °C) goutte à goutte tout en continuant à tourbillonner doucement le tube pour empêcher les cellules de s’agglutiner.
      11. Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 min.
      12. Déterminer la concentration des cellules fixes à l’aide d’un hémocytomètre.
      13. Évaluez l’efficacité de l’étape de fixation à l’aide du bleu de trypan. Une fraction élevée de cellules viables indique que plus de temps de fixation est nécessaire.
      14. Conservez les tissus congelés et les cellules fixes à -80 °C.
  2. Isolement des noyaux à partir de tissus congelés flash pour scATAC-seq
    1. Préparation des médias
      1. Préparer le tampon de dilution de la lyse en combinant 9,77 mL d’eau sans nucléase, 100 μL de 1 M Tris-HCl (pH 7,4), 100 μL de 1 M NaCl, 30 μL de 1 M MgCl2 et 0,1 g de BSA.
      2. Préparez le tampon de dilution de la lyse à l’avance, comme la veille, et conservez-le à 4 °C. Le jour du protocole, placer sur la glace.
      3. Equilibrer le tampon de noyaux 20x fourni par le fabricant du kit scATACde -20 °C à température ambiante. Vortex et centrifugeuse brièvement.
      4. Préparer le tampon de lyse 1x en incubant une solution de digitonine à 5 % dans un bain-marie à 65 °C jusqu’à dissolution du précipité. Combinez ensuite 2 mL de tampon de dilution de lyse, 20 μL de 10 % de Tween-20, 20 μL de Nonidet P40 Substitute (peut également être étiqueté IGEPAL) et 4 μL de Digitonin.
      5. Conservez le tampon de lyse 1x sur de la glace.
      6. Pour préparer le tampon de lyse 0,1x, mélanger 1,8 mL de tampon de dilution de lyse avec 200 μL du tampon de lyse 1x et stocker sur de la glace.
      7. Pour préparer le tampon de lavage, mélanger 2 mL de tampon de dilution de lyse et 20 μL de Tween-20 à 10 % et conserver sur de la glace.
      8. Pour préparer le tampon de noyaux dilués, combinez 950 μL d’eau sans nucléase avec 50 μL de tampon de noyaux (20x) et stockez-le sur de la glace.
    2. Isolement des noyaux
      1. Ne pas décongeler l’échantillon avant la lyse. Ajouter 500 μL de tampon de lyse 0,1x réfrigéré à un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant l’échantillon congelé. Homogénéiser immédiatement 15x à l’aide d’un pilon à granulés.
      2. Incuber pendant 5 min sur de la glace. Préparer le matériel nécessaire à la transposition de scATAC au cours de cette étape d’incubation17.
      3. Pipette mélanger 10x avec une pipette de 1 mL et incuber pendant 10 min sur de la glace. Préparation complète des matériaux nécessaires à la transposition de scATAC au cours de cette étape d’incubation si elle n’est pas déjà terminée. Il n’est pas nécessaire de préparer plus de tampon de noyaux dilués.
      4. Ajouter 500 μL de tampon de lavage réfrigéré aux cellules lysées. Mélange de pipette 5x.
      5. Faire passer la suspension à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Filtrez ~300 μL à la fois à l’aide d’une nouvelle passoire cellulaire de 70 μm à chaque fois.
      6. Passez le flux collecté à travers une passoire cellulaire de 40 μm dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL et stockez-le sur de la glace.
      7. Déterminez la concentration de noyaux à l’aide d’un hémocytomètre. Sur la base de la concentration de noyaux et du volume total de la suspension cellulaire, calculez le nombre total de noyaux dissociés.
      8. Centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant sans perturber la pastille de noyau.
      9. Pour créer le stock de noyaux en fonction du nombre total de noyaux déterminé à l’étape 2.2.2.7., remettez les noyaux en suspension dans suffisamment de tampon de noyaux dilués pour atteindre la concentration de noyaux souhaitée.
        REMARQUE: La concentration de noyaux souhaitée est basée sur la récupération ciblée des noyaux pour l’expérience scATAC-seq et est déterminée à partir des lignes directrices sur la concentration de noyaux trouvées dans le protocole17 du fabricant. Par exemple, si 10 000 noyaux sont finalement souhaités, la concentration de noyaux souhaitée pour le stock de noyaux est comprise entre 3 080 et 7 700 noyaux / μL. Il serait peut-être préférable de viser le milieu de la plage de concentration.
      10. Déterminez la concentration de noyaux à l’aide d’un hémocytomètre.
      11. Procéder immédiatement à la transposition scATAC en utilisant le stock de noyauxpréparés 17.
  3. Réhydratation des cellules fixes au méthanol pour une utilisation dans scRNA-Seq
    1. Préparation des médias
      1. Pour préparer le tampon de lavage/dilution, dissoudre 0,01 g de BSA dans 1 mL de PBS. Ajouter ensuite 12,5 μL d’inhibiteur de 40 U/μL de RNase et mélanger doucement. Conserver sur la glace.
    2. Réhydratation cellulaire
      1. Centrifuger les cellules fixes au méthanol dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL à 3000 x g pendant 10 min à 4 °C. Retirez ensuite le surnageant.
      2. Ajouter 200 μL de tampon de lavage/dilution réfrigéré au tube de microcentrifugation. Centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 4 °C et retirer le surnageant. Répétez l’opération pour un total de 2 lavages.
        REMARQUE: Préparez les matériaux requis pour la génération gem et le codage à barres au cours des deux étapes précédentes14.
      3. Pour préparer le stock cellulaire, sur la base du nombre total de cellules calculé au point 2.1.2.12., remettez les cellules en suspension dans un tampon de lavage/dilution suffisant pour atteindre la concentration cellulaire souhaitée. Les concentrations cellulaires préférées se situent entre 700 et 1200 cellules/μL.
      4. Déterminer la concentration cellulaire du stock cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre.
      5. Passez immédiatement à la génération GEM et au codage à barres à l’aide du stock de cellules14.
    3. Séquençage
      1. Lorsque vous effectuez une analyse de l’évolution temporelle (comme dans le développement ou la maladie), séquencez plusieurs échantillons dans une exécution multiplexée (c’est-à-dire plusieurs bibliothèques sur une seule cellule de flux) pour réduire les variations techniques.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce flux de travail présente une stratégie pour l’étude des phénotypes de développement et des processus de régulation à l’aide du séquençage unicellulaire. Le multiplexage d’échantillons MULTI-seq permet un test de phénotypage initial à faible coût, tandis que la collecte et la fixation appariées d’échantillons pour scRNA-seq et scATAC-seq permettent une enquête plus approfondie (Figure 1).

Le codage à barres MULTI-seq permet le séquençage combiné de plusieurs éch...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La puissance de MULTI-seq provient de l’intégration transparente des données provenant de plusieurs conditions ou modèles expérimentaux et de l’énorme avantage en termes de coût et de limitation des effets de lot. L’utilisation de MULTI-seq offre une profondeur de phénotypage sans précédent en laboratoire. Des méthodes de multiplexage non génétiques telles que le hachage cellulaire ou le hachage de noyaux ont ouvert la porte à des échantillons multiplexés grâce à l’utilisation d’anticorps à code-b...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions Linda Orzolek du Johns Hopkins Transcriptomics and Deep Sequencing Core pour son aide dans le séquençage des bibliothèques produites et Lizhi Jiang pour l’exécution des explants rétiniens ex vivo .

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 et micro ; L, 200 et micro ; L, 1000 et micro ; L pointes
filtre 10 % Tween 20Bio-Rad1662404
100 µ ; M BarcodeSolution Request from Gartner labhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform ?ts=5c47a897& edit_requested
= vrai
100 % éthanolMillipore SigmaE7023-500ML
100 % méthanolMillipore Sigma322415-100ML
10x Porte-puce10x Genomics1000195
10x contrôleur Chromium & Kit d’accessoires10x GenomicsPN-120263
15mL Tube à centrifugerQualité BiologiqueP886-229411
40 µ ; m FlowMi Cell StrainerBel-ArtH13680-0040
50 µ ; M Anchor SolutionSigma ou demande du laboratoire Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform ?ts=5c47a897& edit_requested
= vrai
50 & micro ; M Co-Anchor SolutionSigma ou demande du laboratoire Gartnerhttps://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP
rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform ?ts=5c47a897& edit_requested
= true
5200 Système d’analyse de fragmentsAgilentM5310AA
70 um FlowMi strainerBel-ArtH13680-0070
Allegra X-12R CentrifugeuseVWRBK392302
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA9647
Chromium Next GEM Chip G10x GenomicsPN-1000120
Chromium Next GEM Chip H10x GenomicsPN-1000161
Chromium Next Gem Single Cell ATAC Reagent Kit v1.110x GenomicsPN-1000175
Chromium Single Cell 3' GEM, Bibliothèque & Kit de billes de gel v3.110x GenomicsPN-1000121
DigitoninFisher ScientificBN2006
Microscope de dissectionLeica
DNA LoBind Tubes, 1,5 mLEppendorf22431021
Dry Ice
EVA Foam IcePan Tequipment04393-54
FA 12-Capillary Array Short, 33 cmAgilentA2300-1250-3355
Fisherbrand Isotemp Water BathFisher Scientific15-460-20Q
Forma CO2 Water Jacketed IncubatorThermoFisher Scientific3110
Glycerol 50 % Solution aqueuseRicca Chemical Company3290-32
Hausser Scientific Chambre de comptage Bright-LineFisher Scientific02-671-51B
Illumina NextSeq ou NovaSeqIllumina
Kapa Hifi Hotstart ReadyMixHiFi7958927001
Low TE BufferQuality Biologique351-324-721
Solution de chlorure de magnésium 1 mSigma-AldrichM1028
Séparateur magnétique Rack pour tubes de 1,5 mLMillipore Sigma20-400
Rack séparateur magnétique pour 200 & micro ; Tubes L10x GenomicsNC1469069
MULTI-seq PrimerSigma ou IDTVoir la liste
MyFuge Mini CentrifugeBenchmark ScientificC1008
Nonidet P40 SubstitutSigma-Aldrich74385
Eau sans nucléaseFisher ScientificAM9937
Micropipettes P2, P10, P20, P200, P1000Eppendorf
PapainWorthington Biochemical CorporationLK003150
PBS pH 7,4 (1X)Fisher Scientific10010-023
Tampon Qiagen EBQiagen19086
Centrifugeuse réfrigérée 5424 REppendorf2231000655
Pilon à granulés jetables sans RNaseFisher Scientific12-141-368
RNasin Plus Inhibiteur de RNasePromegaN2615
RPI amorceSigma ou IDTVoir la liste des
Kit d’index unique N, Set A10x GenomicsPN-1000212
Kit d’index unique T Set A10x GenomicsPN-1000213
Solution de chlorure de sodium 5 MSigma-Aldrich59222C
SPRIselect Kit de réactifsBeckman CoulterB23318
Pipettes de transfert jetables standardFisher Scientific13-711-7M
TempAssure PCR 8 tubesUSA Scientific1402-4700
Trizma Solution de chlorhydrate, pH 7,4Sigma-AldrichT2194
Solution de bleu de trypan, 0,4 % (p/v)Corning25-900-CI
Universal I5 primerSigma ou IDTVoir la liste des
Veriti Thermal CyclerApplied Biosystems4375786
Vortex MixerVWR10153-838
de pipettedes séquences Système de dissociation séquencesséquences

References

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