Article de méthode

L’émulsification par gabarit de particules permet des tests de gouttelettes sans microfluidique

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DOI :

10.3791/62248

⸱

9 mars 2021

 ,  , 
1Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, California Institute for Quantitative Biosciences, University of California, 2Chan Zuckerberg Biohub

Dans cet article

Résumé

Les tests de gouttelettes eau-dans-huile sont utiles pour la chimie analytique, l’évolution enzymatique et l’analyse unicellulaire, mais nécessitent généralement une microfluidique pour former les gouttelettes. Ici, nous décrivons l’émulsification à gabarit de particules, une approche sans microfluidique pour effectuer des tests de gouttelettes.

Résumé

Les réactions effectuées dans des gouttelettes monodispersées offrent une précision et une sensibilité accrues par rapport à des réactions équivalentes effectuées en vrac. Cependant, l’exigence de la microfluidique pour former des gouttelettes contrôlées impose une barrière aux non-experts, limitant leur utilisation. Ici, nous décrivons l’émulsification par gabarit de particules, une approche pour générer des gouttelettes monodispersées sans microfluidique. À l’aide de sphères d’hydrogel à modélisation, nous encapsulons des échantillons dans des gouttelettes monodispersées par simple vortex. Nous démontrons l’approche en l’utilisant pour effectuer une PCR numérique sans microfluidique.

Introduction

La microfluidique des gouttelettes tire parti du compartimentage dans les gouttelettes de picolitre pour augmenter la sensibilité et la précision des essais par rapport aux réactions en vrac, et a de nombreuses applications dans le criblage chimique, l’ingénierie des protéines et le séquençage de nouvelle génération1,2,3. Par exemple, la réaction en chaîne par polymérase par gouttelettes numériques (ddPCR) offre une précision accrue par rapport à la réaction en chaîne par polymérase quantitative en vrac (qPCR), avec des applications pour la variation génétique des cancers, la détection des mutations causant des maladies et le diagnostic prénatal4,5,6. Un défi de la microfluidique des gouttelettes, cependant, est l’exigence de dispositifs microfluidiques pour partitionner les échantillons; Bien que la microfluidique offre un excellent contrôle sur les propriétés des gouttelettes, elle nécessite une expertise spécialisée pour construire et exploiter7,8. Par conséquent, les méthodes à base de gouttelettes sont largement limitées aux laboratoires d’experts ou, dans de rares cas, aux applications dans lesquelles un instrument commercial est disponible9,10. Pour élargir l’utilisation des essais de gouttelettes, la nécessité d’instruments microfluidiques spécialisés est un obstacle qui doit être surmonté.

Dans cet article, nous décrivons l’émulsification par gabarit de particules (PTE), une méthode sans microfluidique pour effectuer des réactions dans des gouttelettes monodispersées. Dans le PTE, les particules de modélisation engloutissent l’échantillon en gouttelettes dans l’huile porteuse par simple vortex (Figure 1). Au fur et à mesure que le système se mélange, la partie aqueuse se fragmente en gouttelettes de taille réductrice jusqu’à ce que les gouttelettes contiennent des particules uniques, auquel cas une fragmentation supplémentaire n’est pas possible car elle nécessite de casser les particules. L’échantillon englouti entoure les particules comme une coquille dans les gouttelettes, encapsulant ainsi toutes les cellules dispersées, les réactifs ou les fractions fonctionnelles (Figure 1D). Ainsi, PTE ne nécessite aucun équipement ou expertise pour effectuer des réactions de gouttelettes au-delà d’un vortexeur commun. De plus, la génération de gouttelettes prend quelques secondes par rapport aux minutes ou aux heures avec la microfluidique, et la quantité produite est proportionnelle au volume du conteneur, et non au temps de fonctionnement de l’appareil, ce qui la rend extrêmement évolutive. Ces avantages rendent le PTE idéal pour effectuer des tests de gouttelettes dans diverses circonstances dans lesquelles la microfluidique n’est pas pratique. Ici, nous démontrons le PTE et l’utilisons pour effectuer la ddPCR.

figure-introduction-1
Graphique 1. Vue d’ensemble du processus d’émulsification par modèle de particules. (A) Les particules de modélisation sont mélangées à des réactifs. (B) Les réactifs excédentaires sont éliminés après centrifugation. (C) L’ajout de molécules modèles se produit avant l’ajout d’huile. (D) Le vortex produit des gouttelettes contenant une seule molécule modèle. (E) Le thermocyclage et l’imagerie ultérieurs permettent l’analyse numérique des gouttelettes du gabarit cible. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Protocole

1. Préparation de particules d’hydrogel pour l’émulsification de particules.

Les particules d’hydrogel utilisées pour l’émulsification par gabarit de particules peuvent être préparées à l’aide de deux méthodes différentes.

  1. Préparation à l’aide de particules disponibles dans le commerce
    1. Ajouter 0,5 g de particules de polyacrylamide séchées compatibles avec le PTE (p. ex. Bio-Gel P-60 Gel (Bio-Rad), 45-90 μm de diamètre) à 30 mL d’eau stérile dans un tube conique de 50 mL et bien mélanger. Incuber à température ambiante pendant 30 min.
  2. Préparation par fabrication microfluidique de particules
    REMARQUE: Les particules de polyacrylamide compatibles avec PTE peuvent être préparées à l’aide de gouttes disponibles dans le commerce (par exemple, QX200 Drop Generator (Bio-Rad), RayDrop (Fluigent), etc.), ou par conception microfluidique personnalisée.
    1. Fabrication de maître sur mesure
      1. Concevez un masque de photolithographie souple à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). Imprimez le photomasque avec une résolution de 10 μm sur un film de carte de circuit imprimé.
      2. Verser 1 mL de résine photosensible sur le centre d’une plaquette de silicium 3 dans. Utilisez un enrobeur de spin pour créer une couche de résine photosensible de 50 μm en la faisant tourner à 500 tr/min pendant 30 secondes, puis à 1250 tr/min pendant 30 secondes. Placer la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 °C pendant 15 min pour évaporer le solvant.
      3. Fixez le photomasque sur la plaquette de silicium à l’aide d’une lame de verre de couverture et exposez la plaquette sous une LED UV collimée de 190 mW et 365 μm pendant 2,5 min. Placez la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 °C pendant 5 min pour la cuisson post-exposition.
      4. Développer la plaquette de silicium photorésistant en l’immergeant dans un bain d’acétate d’éther monométhylique (PGMEA) à 100% de propylène glycol pendant 15 min. Rincez la plaquette avec de l’AMDA frais 100% suivi de 100% d’isopropanol. Sécher la plaquette à l’air libre.
      5. Retirer tout isopropanol résiduel en séchant la plaquette sur une plaque chauffante réglée à 95 °C pendant 1 min. Placez la gaufrette dans un 3 propre dans une boîte de Pétri.
    2. Fabrication du dispositif microfluidique sur mesure
      1. Mélanger la base de silicium polydiméthylsiloxane (PDMS) et le réactif de durcissement dans un rapport de 10:1 en masse. Dégazez le PDMS mélangé à l’aide d’un dessiccateur sous vide domestique jusqu’à ce qu’aucune bulle d’air ne soit observable.
      2. Versez le PDMS dégazé sur le maître dans la boîte de Pétri, en veillant à ce que la plaquette de silicium soit complètement immergée. Dégazez la plaquette de silicium et le PDMS pour éliminer les bulles d’air qui ont pu se former pendant le versement.
      3. Durcissez le PDMS en plaçant la plaquette de silicium et le PDMS dans un four réglé à 65 °C pendant au moins 60 min. Excisez un bloc de PDMS contenant les caractéristiques microfluidiques de la boîte de Pétri à l’aide d’un scalpel. Prenez des précautions supplémentaires pour éviter d’endommager les caractéristiques présentes sur le maître de silicium.
      4. Poinçonner les entrées et les sorties dans le bloc PDMS correspondant aux entrées et sorties du dispositif microfluidique à l’aide d’un poinçon de biopsie de 0,75 mm. Enlevez la poussière et les particules avec l’application répétitive et le retrait du ruban d’emballage à la surface du bloc PDMS.
      5. Nettoyez une lame de verre de 50 mm x 75 mm en la rinçant avec 100% d’isopropanol et en séchant ensuite la surface à l’air. Le plasma traite à la fois la lame de verre et le PDMS (caractéristiques tournées vers le haut) en utilisant 1 mbar de plasma O2 pendant 1 min à l’aide d’un liant plasma.
      6. Fixez le PDMS sur la lame de verre en plaçant le PDMS traité au plasma avec des caractéristiques tournées vers le bas sur la lame de verre, côté traité au plasma vers le haut. Placez la glissière dans un four réglé à 65 °C pendant au moins 30 minutes pour terminer le collage.
      7. Traiter tous les canaux microfluidiques avec un traitement de surface fluoré pour assurer l’hydrophobicité de surface et prévenir le mouillage. Cuire l’appareil à 65 °C pendant au moins 10 min.
    3. Fabrication de particules de modélisation
      1. Préparer une solution de polyacrylamide (PAA) composée de 6,2 % d’acrylamide, de 0,18 % de N,N′-méthylènebis (acrylamide) et de persulfate d’ammonium à 0,3 %. Chargez cette solution dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 28G.
      2. Préparer une phase continue insoluble composée de 5 % (p/p) de fluorosurfactant et de 1 % de N,N,NN-tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans de l’huile d’hydrofluoroéther (HFE) pour la génération et la stabilisation des gouttelettes. Chargez la solution dans une nouvelle seringue de 1 mL.
      3. Chargez les seringues contenant des seringues PAA et HFE dans des pompes à seringues (p. ex. NE-501). Connectez les deux seringues au dispositif microfluidique à l’aide d’un tube en polyéthylène inséré sur la seringue et dans l’appareil. Avant le raccordement, amorcez les pompes pour éliminer l’air du tube.
        REMARQUE: Selon le modèle, les pompes à seringue peuvent être contrôlées avec une entrée intégrée, un logiciel de fabrication ou un script personnalisé (disponible à https://github.com/AbateLab/Pump-Control-Program).
      4. Exécutez le dispositif de génération de gouttes avec des entrées d’huile PAA et HFE à 300 μL / h et 500 μL / h, respectivement. Recueillir 1 mL des gouttelettes dans un tube collecteur de 15 mL et incuber pendant 3 h à température ambiante pour la polymérisation. Après l’incubation, retirez la couche inférieure d’huile par pipetage.
      5. Ajouter 1 mL de perfluoro-1-octanol (PFO) à 20 % (v/v) dans l’huile HFE au tube de collecte de 15 mL comme désémulsifiant chimique. Après le mélange, faire tourner le tube collecteur de 15 mL à 2000 x g pendant 2 min. Retirer le surnageant PFO/HFE par pipetage. Répétez 1x.
      6. Ajouter 2 mL de monooléate de sorbitan à 2 % dans l’hexane au tube de collecte de 15 mL et au vortex pour mélanger. Faire tourner le tube à 3000 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant par pipetage pour éliminer la solution de tensioactif/hexane. Répétez 2x.
      7. Ajouter 5 mL de tampon TEBST (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 274 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 20 mM EDTA, 0,2 % Triton X-100) et bien mélanger. Tourner vers le bas à 3 000 x g pendant 3 min. Retirez le surnageant par pipetage. Répétez 3x.
      8. Remise en suspension en 5 mL TEBST. Cette solution peut être conservée à 4 °C indéfiniment.

2. Émulsification à gabarit de particules.

Après la préparation des particules de modélisation, le PTE est utilisé pour encapsuler l’échantillon et les réactifs dans des gouttelettes.

  1. Préparer les particules de polyacrylamide pour l’émulsification par gabarit de particules en centrifugant à 6000 x g pendant 1 min pour granuler les particules, puis retirer le surnage par pipetage et remise en suspension à l’aide d’eau stérile. Répétez 3x pour vous assurer de l’élimination de tout TEBST résiduel.
  2. Déterminer la concentration et le diamètre des particules de modélisation à l’aide d’un hémocytomètre (ou équivalent). Calculez le diamètre des particules individuelles en mesurant les diamètres en pixels et en les convertissant en microns. La conversion des pixels en microns peut être calculée à l’aide de l’hémocytomètre (ou équivalent) comme diapositive d’étalonnage et en mesurant la distance connue de la grille en pixels.
  3. Préparer la phase dispersée dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL à l’aide d’un mélange maître PCR, des amorces appropriées et d’une sonde d’hydrolyse de la fluorescéine conformément au tableau 1. Incuber à température ambiante pendant 5 min sous agitation douce (10 tr/min) à l’aide d’un rotateur à tube pour assurer une distribution homogène des composants.
    REMARQUE: Le volume et la concentration cible des particules sont basés sur la charge de Poisson. En règle générale, le nombre de particules doit être supérieur d’un ordre de grandeur au nombre d’échantillons à encapsuler. Pour les échantillons de concentrations inconnues, une série de dilution est nécessaire pour assurer le chargement de Poisson.
VolumeRéactif
100 μLParticules (450 particules / μL)
200 μL2x mélange maître PCR
18 μLAmorce avant de 10 μM
18 μLAmorce inverse de 10 μM
18 μLSonde de 10 μM
0,8 μLTriton X100
45,2 μLEau sans nucléase

Tableau 1. Préparation du mélange maître PCR utilisé avec PTE pour la PCR numérique par gouttelettes.

  1. Centrifuger la phase dispersée à 6000 x g pendant 1 min et retirer le surnageant. Enregistrer le volume du surnageant extrait et, à l’aide du volume total de la phase de dispersion calculé au point 2.3 , déterminer le volume de granulés.
    REMARQUE: La quantité de surnageant extraite variera en fonction de l’emballage des particules, du diamètre et de la concentration avec un volume minimum prévu de 300 μL.
  2. Ajouter 1 μL d’ADN génomique de 1,62 pg/μL de Saccharomyces cerevisiae à la pastille à partir de 2,4 et bien mélanger par pipetage ou tapotement vigoureux.
    REMARQUE: La présence d’un excès de contenu aqueux peut diminuer l’efficacité de l’encapsulation. Si le volume de l’échantillon dépasse 1 % du volume de granulés, concentrez l’échantillon. Si l’échantillon ne peut pas être concentré, mettez à l’échelle le mélange maître PCR et le volume de granulés résultant en fonction du volume de l’échantillon. Le PTE permet l’émulsification de petits (10 μL) à grands (2 mL) volumes de particules de modélisation. Le mélange maître PCR (2.3) et l’huile (2.6) peuvent être mis à l’échelle en fonction du volume cible (2.3) et mesuré (2.4) de la pastille de particules respectivement.
  3. Ajouter 200 μL 2% de fluorosurfactant dans l’huile HFE au tube comme phase continue insoluble pour l’émulsification. Assurez-vous que la pastille est délogée en pipetant ou en tapotant/agitant le tube. Puis vortex à 3000 tr/min pendant 30 sec.
    REMARQUE: Le réglage correspondant à 3000 tr / min peut varier en fonction de la marque et du modèle.
  4. Laissez les émulsions se déposer pendant 1 min. Retirer 100 μL de la phase huileuse inférieure et remplacer ce volume par du fluorosurfactant frais à 2 % dans l’huile HFE. Inverser doucement le tube plusieurs fois pour mélanger. Répétez 3-5x ou jusqu’à ce que les petites gouttelettes satellites aient été enlevées.

3. PCR et analyse numériques des gouttelettes.

  1. Après 2-5 min de décantation, retirez la phase d’huile de fond. Remplacez ce volume par un fluorosurfactant à 5 % dans l’huile de fluorocarbone (p. ex. FC-40).
  2. À l’aide d’une pointe de pipette à large alésage, pipettez soigneusement les 100 μL d’échantillon dans des tubes PCR de 200 μL. Placez les tubes PCR dans un thermocycleur et faites fonctionner conformément au tableau 2.
PasTempératureDuréeNotes
195 °C2 min
295 °C30 s
350 °C90 s
472 °C60 s
5Répétez les étapes x34 2 à 4
672 °C2 min
74 °Ctenir

Tableau 2. Conditions de thermocyclage pour la PCR numérique par gouttelettes à l’aide d’émulsions PTE.

  1. Pipettez l’échantillon sur une lame de comptage à l’aide d’une pointe de pipette à large alésage pour l’imagerie fluorescente. Imagez l’échantillon à l’aide d’un microscope fluorescent avec une excitation de 490 nm et des longueurs d’onde de détection d’émission de 525 nm.
  2. Quantifier les gouttelettes fluorescentes positives (Np) et les gouttes totales (NT) pour vérifier la présence et calculer le nombre de molécules modèles (λ) en utilisant la fraction de gouttelettes positives (Np/NT) et les statistiques de Poisson :
    figure-protocol-1
  3. Calculez l’intervalle de confiance à 95 % (zc = 1,96) en :
    figure-protocol-2
  4. Calculer la concentration de l’échantillon (molécules/μL) en utilisant le volume (ν en μL) de l’échantillon ajouté à l’étape 2.5, en utilisant l’équation ci-dessous. Déterminer la moyenne et l’écart-type de la concentration de l’échantillon à l’aide de répétitions techniques.
    figure-protocol-3

Résultats

figure-results-1
Graphique 2. Encapsulation de l’échantillon en gouttelettes à l’aide d’une émulsification à gabarit de particules. (A) les particules de modélisation utilisées pour l’émulsification de modélisation de particules. B) Séparation de la pastille de particules de modélisation du surnageant après centrifugation. (C) Gouttelettes résultant d’une émulsification par gabarit de particules avec (D) coquille aqueuse identifiable. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

En PTE, la monodispersion des émulsions est dictée par celle des particules templatantes, car les gouttelettes ont un diamètre légèrement plus grand que les particules. Ainsi, les particules uniformes sont au cœur de l’encapsulation PTE contrôlée11. Il existe diverses méthodes pour générer des particules de modélisation uniformes, notamment chimiques (sol-gel, polymérisation en émulsion), hydrodynamiques (émulsification membranaire, homogénéisation) et de filtration. Les approches microfluidiques, en particulier, offrent une superbe monodispersité (Figure 2A) et permettent une ingénierie des particules supplémentaire pour améliorer leur fonctionnalité dans PTE12. Alternativement, des particules de modélisation peuvent être achetées, bien que leur uniformité, bien qu’adéquate, soit généralement inférieure à celle de la génération microfluidique11.

Pour effectuer la PTE, les particules sont mélangées à l’échantillon à encapsuler (Figure 1A), et l’excès de surnageant est éliminé par centrifugation et pipetage (Figure 1B), comme l’illustre une photographie d’une pastille de particules au fond d’un tube PCR (Figure 2B). L’huile d’encapsulation contenant un tensioactif stabilisant est ensuite ajoutée (Figure 1C), et l’échantillon doucement pipeté avant le vortex pendant 30 secondes (Figure 1D), pour générer l’émulsion (Figure 2C). Les gouttelettes résultantes contiennent un noyau de particules et une coquille aqueuse comprenant l’échantillon initial, dans lequel résident les réactifs, les molécules cibles et les cellules nécessaires à la réaction (Figure 2D). Tout comme dans l’encapsulation microfluidique des gouttelettes, des entités discrètes comme de petites billes ou des cellules sont encapsulées de manière aléatoire et conformément à une distribution de Poisson, bien que presque toutes les gouttelettes contiennent une particule de modélisation en raison de la nature de la physique PTE.

figure-results-2
Graphique 3. Identification et nettoyage des gouttelettes d’émulsification modélisées par des particules. (A) Exemple de génération de gouttelettes non uniformes avec plusieurs particules par gouttelette provenant d’un vortex insuffisant. (B) Présence attendue de satellites et de gouttelettes à la suite d’une émulsification par gabarit de particules et (C) du fractionnement de l’eau dans l’huile. (D) Émulsion résultante après lavage à l’huile. (E) Génération excessive de satellites résultant d’un surnageant résiduel au cours de l’émulsification par gabarit de particules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Même dans les PTE réussis, il existe des gouttelettes à double ou triple cœur, bien qu’elles contribuent généralement de manière négligeable à la réaction, à condition qu’elles soient rares. Atteindre une faible fréquence de gouttelettes multicœurs tout en conservant des coques adéquates nécessite une optimisation des paramètres du processus, y compris la tension superficielle, les forces d’adhérence interparticulaires, la viscosité de l’échantillon, la taille du récipient et la puissance et le temps de vortex. Par exemple, une émulsification mal optimisée peut contenir des gouttelettes polydispersées avec de nombreuses particules de modélisation (Figure 3A), ce qui indique que le vortex était insuffisant pour émulsionner complètement l’échantillon. Dans de tels cas, des détergents peuvent être ajoutés pour réduire l’adhérence entre les particules et abaisser la tension superficielle, ou la puissance ou le temps de vortex peut être augmenté. Un autre problème courant est la génération de satellites excessifs, qui sont de petites gouttelettes vides (Figure 3B). Les satellites peuvent être inévitables dans les émulsions PTE en fonction de la tension interfaciale et des propriétés rhéologiques de l’échantillon et de l’huile porteuse. Cependant, ils résultent souvent d’un retrait inadéquat de l’échantillon excédentaire avant l’émulsification (figure 2B) ou d’un vortex avec trop de puissance, dépouillant les coquilles des gouttelettes. Dans une émulsification PTE réussie, les satellites ne doivent pas représenter plus d’environ 10 % du volume total de l’échantillon encapsulé (Figure 3C)11. À ce niveau, ils contribuent généralement de manière négligeable à la réaction et peuvent être ignorés. À des fins esthétiques, ils peuvent être éliminés de l’émulsion en les lavant à l’huile fraîche (Figure 3D).

figure-results-3
Graphique 4. Évaluation de la PCR numérique des gouttelettes d’émulsification modélisée par modèle de particules. (A) L’imagerie fluorescente des gouttelettes identifie les gouttelettes fluorescentes positives et les gouttelettes non fluorescentes négatives. (B) Identification de gabarits rares ou de faibles concentrations de gabarits à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes. (C) Encapsulation de gabarit surabondante entraînant un nombre variable de molécules de gabarit par gouttelette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour démontrer l’utilité du PTE, nous l’avons utilisé pour effectuer une PCR11 numérique sans microfluidique. En utilisant le procédé, nous avons encapsulé un échantillon comprenant de l’ADN génomique de S. cerevisiae et l’avons thermocyclé. En PCR numérique, les gouttelettes contenant des cibles amplifiées deviennent fluorescentes, tandis que celles qui n’en contiennent pas restent faibles. Ainsi, une gouttelette fluorescente indique une cible, permettant une quantification directe des cibles en comptant les gouttelettes positives (Figure 4A). Le nombre de gouttelettes fluorescentes s’échelonne donc avec les molécules cibles, donnant peu de positifs lorsque la cible est rare (Figure 4B) et beaucoup lorsqu’elle est abondante (Figure 4C). Comme pour l’encapsulation d’autres composants discrets, l’encapsulation cible suit une distribution de Poisson, ce qui permet de transformer la fraction de gouttelettes positives en concentration cible (figure 4D), démontrant ainsi la capacité d’effectuer une PCR numérique avec PTE11.

figure-results-4
Graphique 5. Démonstration de la PCR numérique par gouttelettes à l’aide de PAA disponible dans le commerce. (A) L’imagerie fluorescente des gouttelettes identifie les gouttelettes non fluorescentes négatives. (B) Identification de faibles concentrations de gabarit avec pcR numérique par gouttelettes. (C) Identification de fortes concentrations de gabarit à l’aide de la PCR numérique par gouttelettes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ces résultats sont reproductibles à l’aide de particules de polyacrylamide disponibles dans le commerce (Figure 5) et démontrent la capacité de PTE à effectuer une PCR numérique standard avec des particules de polyacrylamide disponibles dans le commerce, obtenant des mesures précises sur la même plage.

Fichier supplémentaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

PTE utilise des particules pour encapsuler des échantillons dans des gouttelettes monodispersées par vortex. En plus de sa simplicité et de son accessibilité, PTE offre plusieurs avantages supplémentaires, notamment en permettant de générer instantanément de grands volumes de gouttelettes. De plus, le processus peut être effectué dans un tube isolé, ce qui évite d’avoir à transférer des échantillons vers des dispositifs microfluidiques, rationalise le flux de travail global et limite les possibilités de contamination ou de perte d’échantillons. Les particules de modélisation fournissent également un moyen de concevoir le contenu des réactions de gouttelettes résultantes. Par exemple, la taille, la chimie et la mouillabilité des particules peuvent être conçues pour la capture ciblée de biomolécules ou de cellules, tandis que des fractions fonctionnelles telles que des enzymes, des actifs ou des acides nucléiques peuvent être affichées sur des particules pour faciliter les réactions, telles que le séquençage d’une seule cellule ou la caractérisation fonctionnelle. Bien que l’approche soit flexible, son utilisation comporte néanmoins d’importantes contraintes. Par exemple, il n’est actuellement pas possible d’effectuer des ajouts de gouttelettes comme c’est souvent le cas avec la microfluidique, ce qui nécessite que tous les composants de la réaction soient introduits avant l’encapsulation; cela nécessite que les réactifs soient compatibles et stables jusqu’à ce que les gouttelettes puissent être générées et, dans le cas de combinaisons gênantes, peuvent souvent être traités en mélangeant et en émulsifiant rapidement l’échantillon sur de la glace. Alternativement, des composants réactifs qui peuvent être déclenchés à l’extérieur avec de la lumière ou de la chaleur peuvent être utilisés13. PTE fournit ainsi une méthode flexible et évolutive pour effectuer des tests de gouttelettes accessibles aux non-experts. Ceci, associé à sa simplicité et à sa flexibilité innées, rend PTE idéal pour l’exécution et le développement de nombreuses applications de gouttelettes.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail d’élaboration de ce protocole a été soutenu par les National Institutes of Health (R01-EB019453-02), le Bureau du directeur du renseignement national, l’activité des projets de recherche avancée sur le renseignement par l’intermédiaire de Raytheon BBN Technologies Corp (N66001-18-C-4507), le chan-Zuckerberg Biohub Investigator Program, la Defense Advanced Research Projects Agency par l’intermédiaire de la Texas A & M University (W911NF1920013) et les Centers for Disease Control and Prevention de l’Université Johns Hopkins Applied Laboratoire de physique (75D30-11-9C-06818 (CDC3)). Les points de vue et les conclusions contenus dans le présent document sont ceux des auteurs et ne doivent pas être interprétés comme représentant nécessairement les politiques officielles, expresses ou implicites, des organisations susmentionnées ou du gouvernement des États-Unis. Le gouvernement des États-Unis est autorisé à reproduire et à distribuer des réimpressions à des fins gouvernementales nonobstant toute annotation de droit d’auteur.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtre à seringue de 0,22 umMilipore SigmaSLGP033RS
0,5M EDTA, pH 8,0Thermo-Fisher15575020
Poinçon de biopsie de 0,75 mmWorld Precision Instruments504529
Seringues de 1 mLBD309628
1H,1H,2H-Perfluoro-1-Octanol (PFO)Sigma-Aldrich370533
1M Tris-HCI, pH 8.0Aiguilles Thermo-Fisher15568025
27 AiguillesBD305109
3" plaquettes de silicium, type P, vierge de qualité testUniversity Wafers447
Porte-seringue centrifuge imprimé en 3D(personnalisé)(personnalisé)
Solution d’acrylamide, 40 %, pour électrophorèse, filtre stérileSigma-AldrichA4058-100ML
Persulfate d’ammoniumSigma-AldrichA3678-25G
Aquapel (traitement de surface fluoré)Pittsburgh Glass Works47100
HexaneSigma-Aldrich139386
FC-40 huile fluoréeSigma-AldrichF9755
IsopropanolSigma-Aldrich109827
N,N&prime ;-Methylenebis(acrylamide)Sigma-Aldrich146072-100G
NaClSigma-AldrichS9888
Novec-7500 Fluide d’ingénierie (huile HFE)3M98-0212-2928-5
tube en polyéthylèneProduits scientifiquesB31695-PE/2
fluorosurfactantRan Biotechnologies008-FluoroSurfactant
Développeur PGMEASigma-Aldrich484431
PhotomasksCadArt Servcies(custom)
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)Applied Biosystems4464263
Spin CoaterSpecialty Coating SystemsG3P-8
Span 80 (monooléate de sorbitane)Sigma-Aldrichs6760
SU-8 3025 photoresistKayaku17030192
Triton X-100 (éthoxylate d’octylphénol)Sigma-Aldricht8787
Tween 20 (polysorbate 20)Sigma-Aldrichp2287
Platinum Multiplex PCR Master Mix (Taq Master Mix)Applied Biosystems4464263
Yeast FWDIDT5&prime ;-GCAGACCAGACCAGAACAAA-3′
Levure REVIDT5&prime ;-ACACGTATGTATCTAGCCGAATA
AC-3
Sonde de levureIDT5&prime ;-/56-FAM/ATATGTTGT/ZEN/TCACTCGCGCCTGGG/3IABk
FQ/-3&prime ;
EVOS FL AUTOLife Technologies
EVOS LED Cube, GFPLife Technologies  ;
SYLGARD 184 KIT 1.1 LB (base PDMS et réactifs de durcissement)  ; Dow CorningDC4019862
TEMEDThermo Fisher17919
Saccharomyces cerevisiae ADN génomiqueMilipore69240-3
Nettoyeur de plasma expansé (plasma bonder)Harrick PlasmaPDC-002 (230V)
AMEP4651

Références

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Mots-clés

PCR digitale en gouttelettesgouttelettes monodispersesparticules de polyacrylamidesph res d hydrogelmulsification par vortexencapsulation d chantillonsimagerie fluorescentelimination du tensioactif

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