Préparation de grille cryo-microscopique électronique pour des études résolues dans le temps à l’aide d’un nouveau système robotique, Spotiton

Résumé

Le protocole présenté ici décrit l’utilisation de Spotiton, un nouveau système robotique, pour livrer deux échantillons d’intérêt sur une grille de nanofils à mèche automatique qui se mélangent pendant au moins 90 ms avant la vitrification dans le cryogène liquide.

Résumé

La capture d’états moléculaires à courte durée de vie déclenchée par la rencontre précoce de deux ou plusieurs particules en interaction continue d’être un défi expérimental d’un grand intérêt pour le domaine de la cryo-microscopie électronique (cryo-EM). Quelques stratégies méthodologiques ont été développées qui soutiennent ces études « résolues dans le temps », dont l’une, Spotiton - un nouveau système robotique - combine la distribution de gouttelettes d’échantillon de la taille d’un picoliter avec un contrôle temporel et spatial précis. Le flux de travail Spotiton à résolution temporelle offre une approche particulièrement efficace pour interroger les réarrangements structurels précoces à partir d’un volume d’échantillon minimal. Tirés à partir de distributeurs piézoélectriques contrôlés indépendamment, deux échantillons atterrissent et se mélangent rapidement sur une grille EM de nanofils alors qu’il plonge vers le cryogène. Potentiellement, des centaines de grilles peuvent être préparées en succession rapide à partir de seulement quelques microlitres d’un échantillon. Ici, un protocole détaillé étape par étape du fonctionnement du système Spotiton est présenté en mettant l’accent sur le dépannage des problèmes spécifiques qui surviennent lors de la préparation du réseau.

Introduction

Le potentiel de la cryo-EM pour capturer et révéler des états conformationnels transitoires des protéines sur l’échelle de temps inférieure à la seconde (cryo-EM résolue dans le temps) a été réalisé par plusieurs groupes, à commencer par Berriman et Unwin¹ dont la technique s’est appuyée sur la méthode standard de congélation par plongeon développée par Dubochet pour préparer des grilles cryo-EM². Ils ont ajouté un atomiseur juste au-dessus de la coupbe de cryogène qui utilisait de l’azote gazeux comprimé pour pulvériser une fine brume d’un deuxième échantillon sur une grille EM plongeante contenant un premier échantillon qui avait été appliqué et épongé sur une fine couche aqueuse. Bien que ce système puisse atteindre des temps de mélange aussi bas que 1 ms, il exigeait toujours un buvard manuel du premier échantillon par l’utilisateur - une tâche techniquement difficile - et un volume relativement élevé du deuxième échantillon. De plus, dans la pratique, il était difficile de savoir où le mélange des deux échantillons s’était produit, ce qui nécessitait l’utilisation de nanoparticules de ferritine comme marqueur fiduciaire dans l’échantillon mélangé. Les efforts ultérieurs de Howard White et de ses collègues ont amélioré le contrôle et la reproductibilité de cette approche de pulvérisation-mélange en incorporant le contrôle informatique des étapes de buvardage et de pulvérisation^3,4. Pour savoir dans quelle mesure et où les échantillons se mélangent, le même groupe⁵ et les autres^6,7,8,9,10 sont passés à une approche de mélange-pulvérisation¹¹ dans laquelle deux échantillons sont mélangés soit dans des tubes capillaires étroits sous la pression de pompes à seringues, soit dans des puces microfabriquées microfluidiques entraînées par de l’azote gazeux. Ces systèmes de prémélange assurent non seulement un mélange complet, mais permettent également d’affiner les temps de mélange pour augmenter la résolution des études résolues dans le temps.

L’introduction de distributeurs piézoélectriques comme autre moyen d’appliquer l’échantillon aux grilles EM dans le système Spotiton a permis à la fois le ciblage précis des dépôts d’échantillons et l’exigence d’un volume d’échantillon beaucoup plus petit pour faire une grille¹². Plus tard, l’utilisation de grilles de nanofils et l’application d’échantillons en route (repérage « à la volée ») ont éliminé le besoin d’une étape de buvard et réduit l’application à la vitrification multipliée par^13,14. Pour la nouvelle approche de cryo-EM à résolution temporelle décrite ici, un deuxième distributeur ainsi que les mises à niveau matérielles et logicielles de contrôle nécessaires ont été ajoutés au système Spotiton pour permettre la livraison d’un deuxième échantillon sur une grille de nanofils en mouvement presque immédiatement après le dépôt des¹⁵premiers . Les deux échantillons qui se chevauchent se mélangent sur la grille car ils sont méchants par les nanofils en une fine couche aqueuse avant la vitrification. Des temps de mélange aussi bas que 90 ms peuvent être atteints. Ce protocole vise à fournir des informations pratiques sur la façon de mener des expériences résolues dans le temps en utilisant la distribution piézoélectrique et les grilles de nanofils. En outre, comme le matériel et les logiciels sont modifiés pour améliorer la facilité d’utilisation, la cohérence et le débit, ce protocole sert également de description à jour de la méthode¹⁵précédemment signalée.

Protocole

1. Configurer la machine et le logiciel Spotiton

1. Préparez le système à distribuer (Figure 1).
   1. Ouvrez la vanne principale du réservoir d’alimentation en azote. Assurez-vous que le réservoir du système est rempli d’eau dégazée et ultrapure. Allumez l’ordinateur. Allumez le système Spotiton au niveau de la bande d’alimentation multi-outlets.
   2. Cliquez sur l’icône du bureau (Figure 2A) pour ouvrir l’interface utilisateur (UI) du logiciel Spotiton (Figure 2B). Dans le menu Outils, sélectionnez Initialiser les étapes pour initialiser et abriter les robots à 3 axes (étage de grille et étage de pipette) et l’ensemble de tête de distributeur rotatif (étage thêta). Assurez-vous que les embouts du distributeur pointent vers le bas avant l’initialisation et le repérage.
   3. Dans la fenêtre principale, cliquez sur Aller à SafePosition pour envoyer les robots à la SafePosition (Figure 3).
      REMARQUE: Le passage à SafePosition peut être effectué avec des robots dans n’importe quelle position sans risque de collision.
   4. Sous l’onglet Aspirer, sélectionnez Prime pour rincer les têtes du distributeur plusieurs fois avec de l’eau du réservoir. Continuez jusqu’à ce que des courants d’eau ininterrompus puissent être vus émergeant des deux pointes.
      REMARQUE: Il peut être nécessaire de répéter cela si un volume important d’air est entré dans les conduites de fluide lorsque les extrémités ont été rincées avec du méthanol lors du dernier arrêt.
2. Inspecter les performances du distributeur
   1. Sous l’onglet Inspecter, envoyez chaque embout à la caméra d’inspection pour tester l’eau du feu et faire correspondre le modèle de production de gouttelettes des deux distributeurs (Figure S1).
      REMARQUE: Si une pointe ne se déclenche pas en raison d’une bulle (Figure S2A) ou de débris, nettoyez les pointes à la station de lavage (Figure S2B) à l’aide de la fonction de lavage par ultrasons accessible sur l’onglet Aspirer.
   2. Ajustez l’amplitude de tir (sans unité) pour chaque distributeur et échantillon afin d’obtenir un flux de gouttelettes discrètes de taille constante.
   3. Confirmer visuellement la production équivalente de gouttelettes par les deux distributeurs.
      1. Appuyez sur le bouton Enregistrer du moniteur supérieur de la caméra pour enregistrer une vidéo de tir de l’astuce 1. Lisez la vidéo du tir de l’astuce 1 dans le moniteur de droite en même temps que l’astuce 2 est déclenchée dans le moniteur supérieur de la caméra(Figure S1).
         REMARQUE: Les vidéos de chaque tir de pointe sont enregistrées et stockées.
   4. Les distributeurs sont maintenant prêts à tester le feu sur une grille.
      REMARQUE: Ce protocole suppose que l’alignement correct des étages de la grille et de la pipette à leurs positions de plongée respectives a été vérifié. Si vous ne confirmez pas l’alignement correct, vous pourriez entraîner une collision, endommageant les pointes ou les robots.
3. Tester l’eau de feu sur une grille.
   1. Assurez-vous que les robots sont au SafePosition.
   2. Retirez la pince à épilez du support du robot de grille à l’aide de la clé Allen fournie.
   3. Sur une paillasse à proximité, positionnez une grille de test, côté nanofil vers le haut, sur le bord du bloc de grille. Saisissez soigneusement le bord de la grille, positionnez-le correctement dans la pince à épiler(Figure S3)et remontez la pince à épiler.
   4. Dans l’onglet Cryo, cliquez sur Tip to Camera pour déplacer les pointes dans le champ de vision de la caméra à chemin de plongée supérieur(caméra supérieure). Assurez-vous que l’emplacement en direct est sélectionné sur le moniteur supérieur de la caméra et que le voyant supérieur de la caméra est allumé (cadran à l’avant de l’armoire de la machine (Figure 1).
   5. Montez la pince à épilez sur le robot de grille. Positionnez l’astuce 1, visible dans le moniteur supérieur de la caméra, en cliquant sur la souris dans le moniteur.
      REMARQUE: Seul l’astuce 1 sera visible et se déplacera vers l’emplacement du clic.
   6. Cliquez sur Grille à caméra pour positionner la grille devant la caméra supérieure. Ajustez la position de l’astuce 1 comme avant, si nécessaire.
   7. Choisissez Tip1, Tip2ou Tip1 et Tip2 pour sélectionner l’un ou les deux distributeurs à tester.
      REMARQUE: Lorsque vous testez les pointes individuellement, utilisez la souris pour positionner l’embout 1 dans le moniteur supérieur de la caméra à différents endroits latéraux de la grille. Cela déposera des bandes liquides des deux pointes dans un motif qui ne se chevauche pas et permettra à l’utilisateur de confirmer que chaque pointe a tiré.
   8. Dans l’onglet Cryo, assurez-vous que Vitrify Grid n’est pas sélectionné, cliquez sur Queue Target, puis sur Plunge.
      REMARQUE: L’étage de pipette augmentera légèrement, suivi de l’étage de grille. Le robot de grille plonge ensuite la grille au-delà des distributeurs de tir et des caméras supérieures et inférieures, s’immobilisé juste au-dessus du pont. Une capture d’image à partir de la caméra supérieure apparaît au-dessus d’une capture d’image à partir de la caméra inférieure sur le côté gauche de l’interface utilisateur.
   9. Évaluez les images supérieure et inférieure : chaque pointe s’est-elle enflammée lorsqu’elle a été sélectionnée ? Lorsqu’il est cuit ensemble, le liquide des deux pointes se chevauche-t-il complètement, créant une bande nettement plus épaisse que lorsqu’il est cuit individuellement?
      1. Si l’une ou l’autre pointe ne s’est pas enflammée, effectuez un ou plusieurs cycles de lavage par ultrasons jusqu’à ce qu’un tir clair soit observé.
      2. Si les bandes de l’échantillon ne se chevauchent pas complètement, ajustez l’alignement latéral de l’un des distributeurs à l’aide d’une clé Allen pour tourner la vis de réglage latérale sur l’un des distributeurs d’un quart de tour et effectuez un plongeon d’essai. Répétez l’opération jusqu’à ce que les bandes se chevauchent complètement.
         REMARQUE: Si les deux pointes se sont déclenchées avec succès et comme prévu, le système est prêt à préparer des grilles d’échantillons.

2. Préparer des grilles mixtes à deux échantillons

1. Mettez à jour les valeurs d’accélération, de décélération et de vitesse dans le fichier XML Paramètres de la machine pour atteindre le temps de mélange qui vous intéresse.
   REMARQUE: Des tableaux corrélant ces valeurs aux temps de mélange ont déjà été signalés¹⁵.
2. Préparez l’échantillon et les grilles.
   REMARQUE: À partir de ce point du protocole, 20 à 30 minutes s’écouleront avant que la première grille ne soit préparée, et les échantillons doivent être conservés à une température appropriée pendant cet intervalle de temps.
   1. Diluer deux échantillons (c.-à-d. protéine et ligand ou autre partenaire en interaction) aux concentrations souhaitées avec un tampon approprié, idéalement, le même pour les deux.
      REMARQUE: Les grilles spotiton nécessitent des concentrations de protéines 1,5 à 2 fois plus élevées que celles généralement utilisées pour les congélateurs à piston automatique. Cela peut être dû au temps minimal que la protéine passe dans une fine couche aqueuse à la surface de la grille pendant un plongeon, ce qui donne aux particules moins de possibilités de se concentrer à l’interface air-eau.
   2. Remplissez le bol de cryogène avec de l’azote liquide.
   3. Plasma nettoyer 3-4 grilles de nanofils. Utilisez 5 W, hydrogène et oxygène, 1,5 min comme point de départ.
      REMARQUE: La durée et la recette de nettoyage au plasma les plus efficaces peuvent changer d’un jour à l’autre en fonction de la température et de l’humidité ambiantes et du lot de grilles de nanofils utilisées. D’autres mélanges de gaz ou un évaseur de lueur peuvent également être efficaces, mais n’ont pas été testés à cette fin. Comme l’eau et les protéines contenues dans une solution tampon sont souvent méchantes à des vitesses différentes par des nanofils, il est préférable d’évaluer l’évacuation des grilles à utiliser ce jour-là lors d’un plongeon dans lequel l’échantillon réel est distribué.
3. Réglez le niveau d’humidité dans le système.
   REMARQUE: En plus des conditions utilisées pour nettoyer et nettoyer les grilles au plasma, l’humidité est un autre facteur principal qui influe sur la vitesse d’évacuation des grilles de nanofils. Bien que le pourcentage d’humidité cible pour une session particulière soit déterminé empiriquement pour chaque jour et lot de grilles, 90-95% est un bon point de départ.
   1. Assurez-vous que le nébuliseur est suffisamment rempli d’eau ultrapure. Branchez le nébuliseur et observez la vapeur sortir du port central du bouchon du nébuliseur.
   2. Observez le moniteur d’humidité en direct dans la fenêtre principale ou ouvrez le suivi de l’humidité ambiante sous Rapports | Ambiant (Figure S4). Vérifiez les niveaux d’humidité dans les deux zones: Chambre et Suaire.
      REMARQUE: La chambre comprend toutes les zones de l’enceinte Spotiton. Le linceul est la zone englobant immédiatement les positions « à la caméra » de la grille et des extrémités du distributeur. Le carénage en résine noire maintient le niveau d’humidité défini lorsque les portes de l’enceinte sont ouvertes pour charger une grille.
   3. Une fois les valeurs d’humidité cibles atteintes, conservez-les automatiquement ou manuellement à partir de l’onglet Humidité. Sélectionnez Contrôle automatique, puis choisissez un point de consigne et un seuil pour maintenir le point de consigne dans la limite de seuil choisie. Vous pouvez également sélectionner Contrôle manuelet régler le niveau d’humidité à l’aide des deux commandes du ventilateur : ventilateur de chambre et ventilateur de carénage.
      REMARQUE: L’activation du ventilateur de la chambre tire la vapeur à travers un filtre dans l’orifice gauche et empêche les gouttelettes d’eau plus grosses d’entrer dans la chambre, empêchant ainsi une augmentation supplémentaire de l’humidité ambiante. Tant que les portes de la chambre restent fermées, le niveau d’humidité se stabilisera au pourcentage souhaité. Allumer le ventilateur du carénage tire la vapeur à travers le port droit dans le carénage. Cela réduit à la fois la libération de vapeur dans la chambre et augmente le niveau d’humidité dans le linceul.
4. Chargez l’échantillon dans les distributeurs.
   1. Ajouter 5 μL de chaque échantillon dans les gobelets d’échantillon.
      REMARQUE: Pour éviter d’introduire des bulles, distribuez le volume très soigneusement sur la paroi latérale interne de la tasse, puis secouez-la pour forcer l’échantillon au fond de la tasse.
   2. Chargez les gobelets d’échantillon dans le plateau de maintien, l’échantillon pour l’embout 1 à gauche, pour l’embout 2 à droite. Repoussez le plateau dans la machine jusqu’à ce qu’il s’épuise.
   3. Sous l’onglet Aspirer, sélectionnez 3 μL pour le volume à aspirer par chaque embout. Assurez-vous que le plateau d’échantillonnage est bien installé, puis cliquez sur Aspirer et observez comment l’étage de la pipette déplace les têtes du distributeur dans les gobelets d’échantillonnage.
   4. Vérifier la réussite de l’aspiration des deux échantillons en retirant les gobelets d’échantillon et en observant une baisse du niveau de liquide.
   5. Sous l’onglet Inspecter, envoyez chaque embout à la caméra d’inspection pour confirmer la distribution sans obstruction. Ajustez l’amplitude au besoin pour correspondre à la formation de gouttelettes à partir de chaque pointe (voir rubrique 1.2).
      REMARQUE: L’amplitude devra probablement être augmentée pour la pointe qui distribue l’échantillon de protéines.
   6. Le système est maintenant prêt à préparer un exemple de grille.
5. Congeler les grilles d’échantillons
   1. Chargez une grille fraîchement nettoyée au plasma dans la pince à épiler, mais ne montez pas encore la pince à épiler. Assurez-vous que le niveau d’humidité est élevé, ~ 90-95%. Remplissez la tasse d’éthane.
   2. Effectuez un tir d’essai final des deux pointes devant la caméra d’inspection, en confirmant qu’il n’y a pas d’obstruction. Dans l’onglet Cryo, cliquez sur Tip to camera.
   3. Remplissez la tasse d’éthane. Si de la glace d’éthane se forme, fondez au besoin avec du gaz éthane supplémentaire.
      REMARQUE: Les étapes 2.5.4 et 2.5.5 doivent être complétées relativement rapidement (<20 s) pour minimiser (i) la saturation des nanofils dans l’humidité élevée de la chambre et (ii) la probabilité que la pointe qui tire l’échantillon de protéine se bouche.
   4. Montez la pince à épilez avec la grille sur la scène de la grille. Dans l’onglet Cryo, cliquez sur Grille pour la caméra. Assurez-vous que l’astuce 1 est correctement positionnée dans le moniteur supérieur de la caméra (voir les étapes 1.3.4 à 1.3.5).
   5. Cliquez sur Vitrify Grid, Queue Target, puis Sur Plunge. Cliquez sur OK lorsque vous êtes invité à commander au robot de grille de sauter la grille de l’éthane dans l’azote liquide et de la libérer sur l’étagère immergée.
      REMARQUE: La pince à épile remonte ensuite dans la chambre. Après le saut à l’azote liquide, une invite apparaît demandant si la grille est tombée de la pince à épiler. S’il n’est pas lâché, cliquez sur Non, et la pince à épiler s’ouvrira et se fermera plusieurs fois pour détacher la grille.
   6. Examinez les images de la grille(figure S5)pour décider si elle doit être conservée ou jetée.
   7. Si vous conservez la grille, transférez-la dans la boîte de grille pré-refroidie. Vous pouvez également repérer les grilles suivantes, puis transférer toutes les grilles à la fois dans la boîte de grille, en veillant à ce que chaque grille puisse être identifiée par sa position dans la zone de repos.
   8. Pour transférer la grille dans une boîte de grille, pré-refroidissez les pinces à pointe fine, saisissez doucement la grille par le bord et placez-la dans un emplacement de boîte de grille, en commençant par la première fente à gauche de l’encoche dans le sens des aiguilles d’une montre.
   9. Lorsque toutes les grilles sont chargées, fixez le couvercle de la boîte de grille à l’outil de couvercle et prérefroidissez-le dans de l’azote liquide. Vissez le couvercle sur la boîte de grille et serrez-le avec un outil à couvercle ou un tournevis prérefroidi.
   10. Utilisez de grandes pinces pour transférer rapidement la boîte à grille fermée vers un petit dewar pour l’imagerie ou le stockage à long terme.
6. Évaluer l’adéquation de la grille pour l’imagerie EM en aval.
   1. Observez les images des caméras de chemin de plongée supérieure et inférieure qui sont affichées sur le côté gauche de l’interface utilisateur immédiatement après le plongeon d’une grille. Utilisez ces images pour évaluer la vitesse d’évacuation, le tir réussi des deux pointes et l’étendue du chevauchement des deux bandes d’échantillons.
   2. Examinez et comparez les images de grille des caméras supérieure et inférieure ainsi que les paramètres de la machine et les mesures d’humidité au moment du plongeon à l’aide de la visionneuse d’expérience: Rapports | Expérimentez.
   3. Sélectionnez des grilles pour l’imagerie au microscope électronique qui démontrent la preuve d’une bonne mèche.

Résultats

La figure 4 montre des images de grilles préparées au cours d’une seule session Spotiton résolue dans le temps en mélangeant de l’ARN polymérase et un oligomère d’ADN de 105 bp portant une séquence promotrice pendant 150 ms avant la vitrification^15. La figure montre des images prises par les deux caméras haute vitesse de six grilles à deux moments suivant un exemple d’application. Ces caméras, uniques parmi les congélateurs à piston, permettent à l’utilisateur de décider immédiatement s’il doit conserver ou jeter une grille en fonction de l’étendue observée de l’évacuation par les nanofils et de la probabilité que les échantillons liquides aient été aspirés dans une couche aqueuse suffisamment mince pour l’imagerie EM. Bien qu’une seule grille puisse fournir suffisamment de glace pour un ensemble de données complet, une fois que les conditions optimales ont été atteintes, plusieurs grilles sont prêtes à rester à portée de main en cas de perte ou de contamination d’une ou de plusieurs grilles. Sur les six grilles préparées au cours de cette session, les captures d’images n’en montrent qu’une seule avec une mèche sous-optimale (Figure 4F).

Les grilles présentées ont été préparées successivement (étapes 2.5.1 à 2.5.8) sur une période de 40 minutes après une heure pour préparer les échantillons et la machine comme décrit dans le protocole (étapes 1.1.1 à 2.4.6). Sur les six grilles, deux ont été utilisées pour la collecte de données, et les autres ont été sauvegardées pour une analyse ultérieure si nécessaire. Le motif de la glace sur une grille vitrifiée (Figure 5C) correspond étroitement au motif du liquide déposé vu dans l’image supérieure de la caméra (Figure 5B). L’évacuation efficace des échantillons mélangés, mise en évidence par l’absence d’une bande liquide visible dans l’image inférieure de la caméra(Figure 5A),se produit le long des barres de grille recouvertes de nanofils, et l’échantillon déborde rarement dans des carrés adjacents à ceux dans lesquels il a atterri. Dans les carrés remplis de glace, la glace est généralement plus épaisse dans les trous au centre du carré et devient plus mince dans les trous plus proches des barres de la grille (Figure 5E). Souvent, les trous immédiatement adjacents aux barres de grille sont vides en raison de la proximité des nanofils(Figure 5F).

Figure 1: Système Spotiton à résolution temporelle. 1. Poste de travail de l’opérateur; 2. Chambre environnementale; 3. Approvisionnement en azote; 4. Approvisionnement en éthane 5. Contrôle du rétroéclairage pour la caméra de chemin de plongée supérieure 6. Contrôleurs de distributeurs piézoélectriques; 7. Pompes à seringues; 8. Pompe à vide; 9. Laver l’approvisionnement en eau et les bouteilles usagées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Interface utilisateur du logiciel Spotiton. (A) Icône du bureau et écran de démarrage. (B) L’interface utilisateur principale est composée de six zones: 1. zone d’affichage pour le chemin de plongée supérieur (« supérieur ») et les caméras d’inspection de pointe; 2. zone d’affichage pour la caméra à chemin de plongée inférieur (« inférieur »); 3. Zone de lecture pour les vidéos d’inspection des pourboires; 4. Zone d’onglet multifonction; 5. Moniteur d’humidité en direct; 6. Fichier journal système en direct. Abréviation : UI = interface utilisateur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Vue intérieure de la chambre Spotiton (robots en SafePosition). 1. Robot de grille (rouge); 2. Robot distributeur (jaune); 3. Caméra de chemin de plongée supérieure (rose); 4. Caméra à chemin de plongée inférieur (bleu clair); 5. Caméra d’inspection de pointe (orange); 6. Enveloppe d’humidité (vert); 7. plateau d’échantillonnage; 8. Ensemble nébuliseur (bleu foncé); 9. Réservoir du système et conduites d’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Images représentatives de la caméra système à partir d’une session de création de grille Spotiton résolue dans le temps. (Un -F) Images de caméra plongeante supérieure (gauche) et inférieure (droite) de six grilles sur lesquelles l’ARN polymérase et une séquence d’ADN promoteur ont été appliquées à l’aide de Spotiton. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 5: Motif de dépôt de glace sur une grille préparée par Spotiton. Parties des images de la camérainférieureet(B)supérieure de la caméra ( A ) et de l’atlas (C) de la grille illustrée à la figure 4F. Les emplacements approximatifs de la glace résultant du dépôt et du mélange des échantillons sont la lavande colorée. Les zones du carré marquées d’une pointe de flèche jaune sont imagées en (E-G). La région indiquée en (E) est encadrée en jaune en (D). Images d’exposition carrées représentatives (E), trou (F) et (G) recueillies à partir de la grille indiquée dans (A-D). Les zones encadrées dans les images carrées et trouées correspondent respectivement aux images de trou et d’exposition. Barres d’échelle = 100 μm (A-D), 5 μm (E), 2 μm (F), 100 nm (G). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure S1 : Inspection du tir de la pointe. Une vue en direct du tir de l’astuce 2 est visible sur le moniteur supérieur de la caméra à gauche de l’interface utilisateur, tandis qu’un enregistrement effectué précédemment du tir de l’astuce 1 est lu en boucle pour comparaison dans la zone de lecture vidéo à droite. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S2: Nettoyage par ultrasons des embouts du distributeur. Une bulle d’air dans la pointe(A)perturbera la formation de gouttelettes et empêchera le tir de la pointe. (B) Embouts immergés dans l’eau à la station de nettoyage à ultrasons pour éliminer une bulle d’air ou une protéine séchée claire bloquant l’orifice de la pointe. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S3 : Grille de chargement dans une pince à épileuse. (A) Une grille placée côté nanofil vers le haut sur le bord du bloc de grille. (B) Grille positionnée correctement dans la pince à épilante à fermeture automatique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S4 : Suivi de l’humidité. Pourcentage d’humidité relative dans la chambre (bleu foncé) et le linceul (bleu clair) enregistré lors d’une séance typique de fabrication de grilles. Les temps de plongée de la grille (carrés verts) sont tracés sur le graphique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S5 : Mèche sur des grilles de nanofils lors d’un plongeon. Images représentatives de la caméra à chemin de plongée supérieure(A, C, E)et inférieure(B, D, F)de mèche sur des grilles de nanofils trop lentes(A, B),idéales(C, D)et trop rapides(E, F). Un léger épaississement (pointes de flèches blanches) indique des barres de grille avec des nanofils qui ont été saturés par l’échantillon. Les carrés de ces régions contiennent généralement de la glace d’épaisseur appropriée pour l’imagerie microscopique électronique. Barre d’échelle = 500 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce protocole décrit l’utilisation du système robotique Spotiton pour préparer des grilles pour l’imagerie cryo-EM qui transportent deux échantillons, généralement une protéine d’intérêt et un ligand activateur, qui ont été mélangés pendant 90 à 500 ms. Bien que le flux de travail soit simple, l’utilisateur doit garder à l’esprit quelques considérations pour garantir une session de création de grille productive. Tout d’abord, il n’est pas rare que l’une des pointes du distributeur piézoélectrique se bouche ou se bloque, l’empêchant de tirer. Une telle défaillance entraînera une bande liquide, vue sur les captures d’image de la caméra supérieure ou inférieure, qui est visiblement plus étroite que celle observée après le tir des deux pointes. Un blocage peut résulter d’un logement de bulle d’air dans la pointe, perturbant la formation de gouttelettes, ou d’un échantillon de protéines qui a séché et scellé l’orifice de la pointe étroite. Bien que l’échantillon aspiré soit perdu dans le processus, les deux problèmes peuvent être résolus par un lavage par ultrasons des pointes et une nouvelle aspiration de l’échantillon. Pour éviter le colmatage ultérieur et le gaspillage des échantillons, il est essentiel d’amorcer soigneusement (rincer) les conduites de fluide avant l’aspiration de l’échantillon et de maintenir un niveau d’humidité élevé et constant dans la chambre et le carénage. De plus, un échantillon de protéines avec une concentration particulièrement élevée peut affecter la cuisson de la pointe malgré une humidité bien entretenue. Bien que l’augmentation de l’amplitude de tir sur l’onglet Inspect puisse compenser partiellement la faible cuisson due à une concentration élevée en protéines, la dilution de l’échantillon au moins 1:2 améliorera la cuisson de la pointe et évitera le colmatage.

Deuxièmement, il peut être difficile d’atteindre la vitesse d’évacuation idéale nécessaire pour générer de la glace d’épaisseur optimale pour la durée de mélange ciblée. Généralement, des temps de mélange plus rapides nécessiteront une mèche plus rapide, des temps de mélange plus lents nécessiteront une mèche plus lente. Pour la grille idéalement méchante, une bande liquide est clairement discernable dans l’image de la caméra supérieure, tandis que dans la caméra inférieure, seul un très léger épaississement des barres de grille à l’emplacement de la bande reste visible. La mèche lente, indiquée par une bande sombre sur l’image inférieure de la caméra, laisse généralement de la glace trop épaisse pour l’imagerie. L’absence de bande sur l’une ou l’autre image indique une mèche rapide qui n’a peut-être laissé aucune eau dans les trous (Figure S5). Plusieurs facteurs tels que la densité des nanofils, les paramètres et la durée du nettoyage du plasma, ainsi que le temps d’exposition et le niveau défini d’humidité de la chambre peuvent affecter la vitesse de mèche. Une mauvaise mèche (lente) peut être le résultat d’un revêtement clairsemé de nanofils sur la grille. En diluant légèrement et en augmentant le temps d’exposition à la solution de^{nanofils 16,}la densité et la couverture des nanofils sur les barres de grille augmenteront, ce qui facilitera une évacuation plus rapide. Si la densité du nanofil est suffisante, l’augmentation du réglage en watts ou de la durée du nettoyage au plasma améliorera également l’évacuation. Les paramètres recommandés ici sont relativement peu puissants et de longue durée, mais peuvent être modifiés si nécessaire.

Cependant, si le lot spécifique de grilles et les paramètres de nettoyage au plasma ont bien fonctionné lors d’une séance précédente, des performances d’évacuation lentes peuvent résulter d’une exposition excessive des nanofils à une humidité élevée dans la chambre, entraînant leur saturation en humidité et une capacité de rétention de liquide réduite. L’effet de saturation de la grille de l’humidité de la chambre peut être réduit en minimisant le temps écoulé entre le montage de la pince et le plongeon de la grille ou en diminuant le niveau d’humidité du système avant un plongeon. Il convient toutefois de noter que ce dernier comporte le risque associé que la pointe chargée d’échantillon de protéines se bouche. Pour compenser ce risque, maintenir les pointes dans le carénage où un niveau d’humidité élevé est maintenu peut augmenter le temps autorisé pour monter une pince à épiler tenant une nouvelle grille. Enfin, il convient de noter qu’un temps de plongée réduit (obtenu en augmentant l’accélération de la grille et / ou la vitesse maximale) peut entraîner des grilles avec une glace plus mince sans réellement modifier les caractéristiques de mèche de la grille. Cependant, comme le temps de mélange des deux échantillons sera également réduit, le temps de plongée n’est pas un facteur qui est généralement modifié pour traiter la mèche lente. Pour remédier à la mèche trop rapide, entraînant une glace trop mince ou absente dans les trous de la grille, le contraire des mesures décrites ci-dessus peut être pris.

Spotiton présente certains avantages et inconvénients par rapport à d’autres techniques développées pour des études résolues dans un temps inférieur à la seconde. Comme la bande d’échantillon mélangée ne contient que 2 à 4 nL de liquide provenant de chaque distributeur, une seule aliquote de 3 μL de chaque échantillon est suffisante pour préparer de nombreuses grilles - un avantage clé lorsque l’échantillon est limité. De plus, l’observation des dépôts d’échantillons à l’aide de caméras intégrées, bien qu’elle ne soit pas entièrement unique à Spotiton^17,n’est pas une caractéristique des autres dispositifs de mélange et permet aux grilles plongeantes d’être soumises à une évaluation brute de réussite / échec, ce qui réduit considérablement le temps de criblage. L’un des principaux inconvénients du système est un temps de mélange minimum de 90 ms, limité par les limitations physiques des composants mécaniques, qui met hors de portée l’interrogation des réactions biologiques plus rapides. En comparaison, des temps inférieurs à 10 ms sont régulièrement atteints sur les systèmes microfluidiques existants. Sur le système caméléon basé sur Spotiton, disponible dans le commerce, les améliorations apportées à la conception et à la construction ont réduit le temps de plongée minimum à 54 ms et soulèvent la possibilité que l’ajout d’un deuxième distributeur permette des temps de mélange plus rapides que ceux que Spotiton peut actuellement offrir.

À ce jour, une série d’expériences ont été menées pour étudier les états moléculaires précoces et de courte durée à l’aide de Spotiton, y compris l’assemblage du ribosome 70S, les changements conformationnels déclenchés par le calcium dans un canal ionique transmembranaire et la constriction de la dynamine en réponse à l’hydrolyse GTP¹⁵. Depuis la publication de ces résultats, plusieurs modifications ont été apportées au système afin d’améliorer le débit, la reproductibilité et le reporting des sessions de création de grille Spotiton. Ceux-ci incluent, entre autres, le système de surveillance et de contrôle automatique de l’humidité à deux zones, la fonction de visionneuse d’expérience, la fonction d’inspection de pointe côte à côte et plusieurs mises à niveau mineures de l’interface utilisateur. Le système amélioré permettra de mieux prendre en charge les futures expériences de mélange à deux échantillons similaires à celles précédemment rapportées, ainsi que les essais de liaison rapide, par exemple entre une thérapie à petite molécule et sa cible protéique ou même la formation d’un complexe anticorps-antigène. Bien que les expériences actuelles et futures résolues dans le temps impliquant deux partenaires en interaction se poursuivront certainement, l’ajout d’un troisième distributeur piézoélectrique et du matériel associé pourrait élargir davantage la gamme d’expériences possibles. Par exemple, le dépôt initial d’un détergent suivi de la protéine d’intérêt, suivi du ligand en interaction ou en activation, pourrait éliminer tout impact négatif potentiel d’une exposition prolongée au détergent, souvent nécessaire pour éviter les résultats d’imagerie sous-optimaux courants tels que l’orientation préférée. À la lumière des travaux déjà publiés et des applications futures potentielles, Spotiton représente un outil important pour la communauté cryo-EM afin de faciliter la conduite d’études résolues dans un temps inférieur à la seconde.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon	N/A	N/A
boîtes de stockage en grille cryogénique	EMS (Hatfield, PA ; États-Unis)	N/A
Cu/Rh 300 mailles EM grids	EMS (Hatfield, PA ; États-Unis)	EMS300-Cu-Rh	traité pour être enduit de nanofils comme décrit précédemment (Wei et al, 2018)
gaz éthane	TW Smith Corp. (Brooklyn, NY ; USA)	N/A
Pince de manutention de réseau	EMS (Hatfield, PA ; États-Unis)	78320-5B
azote liquide	Airgas, Inc. (Radnor, Pennsylvanie ; États-Unis)	N/A
Réservoir d’azote liquide avec coupelle en laiton (de FEI Vitrobot)	ThermoFisher Scientific (Waltham, MA ; États-Unis)
Picosystem	Hydro System and Supplies (Durham, Caroline du Nord ; États-Unis)	N/A	Système de purification de l’eau
Protéine/autre échantillon	N/A	N/A
Nettoyeur de plasma Solarus 950	Gatan, Inc. (Pleasanton, CA ; États-Unis)	N/A