Une méthode d’inoculation simple et flexible pour évaluer avec précision les phénotypes d’oïdium d’Arabidopsis et d’autres plantes

Résumé

Nous présentons un protocole pour la construction d’un système simple de distribution de spores composé d’une boîte d’inoculation avec un maillage de ~50 μm et une chambre en plastique transparente. Cela peut être utilisé pour inoculer uniformément les plantes avec des spores d’oïdium, permettant ainsi une évaluation précise et reproductible des phénotypes de maladies des plantes à l’étude.

Résumé

Pour réduire les pertes de récoltes dues aux maladies fongiques, il faut mieux comprendre les mécanismes régissant l’immunité des plantes et la pathogenèse fongique, ce qui nécessite une détermination précise des phénotypes de maladies des plantes lors de l’infection par un pathogène fongique particulier. Cependant, le phénotypage précis de la maladie avec des pathogènes fongiques biotrophes non cultivables tels que l’oïdium n’est pas facile à réaliser et peut être une étape limitant le taux d’un projet de recherche. Ici, nous avons développé un système de phénotypage de maladies sûr, efficace et facile à utiliser en utilisant l’interaction Arabidopsis-oïdium comme exemple. Ce système se compose principalement de trois composants: (i) une boîte d’inoculation en bois munie d’un couvercle amovible monté avec un treillis en acier inoxydable ou en nylon de ~50 μm pores pour inoculer un plat de plantes avec des spores fongiques, (ii) une chambre en plastique transparent avec une petite ouverture frontale pour minimiser la fuite de spores tout en effectuant l’inoculation à l’intérieur, et iii) une méthode de délogement et de distribution des spores pour une inoculation uniforme et efficace. Les protocoles décrits ici comprennent les étapes et les paramètres pour fabriquer la boîte d’inoculation et la chambre en plastique à faible coût, ainsi qu’une démonstration vidéo de la façon d’utiliser le système pour permettre une inoculation uniforme avec des spores d’oïdium, améliorant ainsi la précision et la reproductibilité du phénotypage de la maladie.

Introduction

L’oïdium est l’une des maladies les plus courantes et les plus importantes de nombreuses cultures vivrières et plantes ornementales¹. Les études sur les maladies de l’oïdium ont été très populaires, comme en témoignent plus de 10 500 publications comme résultat de recherche avec « oïdium » comme mot clé sur le Web of Science (en novembre 2020). En effet, l’oïdium (représenté par Blumeria graminis) est considéré comme l’un des 10 principaux pathogènes fongiques par le journal of Molecular Plant Pathology². La quantification de la sensibilité aux maladies est une étape nécessaire dans la caractérisation des gènes végétaux contribuant à la résistance ou à la sensibilité aux maladies, ou dans l’identification fonctionnelle des gènes effecteurs candidats dans l’oïdium. Cependant, le phénotypage fiable des maladies est beaucoup plus difficile avec l’oïdium que pour la plupart des autres pathogènes fongiques, en partie parce que, contrairement aux spores de ces derniers, les spores d’espèces d’oïdium (telles que Golovinomyces cichoracearum UCSC1 d’après notre expérience de laboratoire) présentent une viabilité réduite après avoir subi un processus de suspension^{aqueuse 3,4} . Une inoculation inadéquate et/ou inégale d’un agent pathogène particulier de l’oïdium dans les plantes d’essai peut entraîner des résultats phénotypiques inexacts.

Un certain nombre de méthodes d’inoculation ont été signalées pour les études sur l’oïdium. Il s’agit notamment (i) du brossage des spores directement des feuilles infectées pour tester^{les plantes 5}, (ii) de la pulvérisation d’une suspension de spores pour tester les plantes⁶, (iii) du soufflage des spores à l’aide d’une tour de décantation sous vide aux plantes situées au bas de la tour⁷, et (iv) de l’administration de spores par l’utilisation combinatoire d’une membrane à mailles de nylon et de vibrations basées sur le son⁸ . La méthode de brossage des spores (ou dépoussiérage) est facile à réaliser, mais de nature inégale, elle peut donc ne pas être précise pour l’évaluation quantitative. La pulvérisation de spores est pratique et uniforme, mais comme indiqué ci-dessus, elle peut entraîner une mauvaise germination des spores⁴. Les deux dernières (c.-à-d. iii-iv) sont des méthodes très améliorées capables d’obtenir une inoculation uniforme; Cependant, les deux ne sont pas flexibles dans l’ajustement de leur capacité d’inoculation en termes de nombre de plantes à inoculer en un seul événement, ce qui rend l’un ou l’autre appareil n’est pas trivial, et leur fonctionnement est limité aux zones de laboratoire où il y a un vide et / ou une source d’électricité.

Notre laboratoire travaille sur l’interaction plantes-oïdium depuis plus de 20 ans ^9,10. Au cours de la dernière décennie, nous avons testé un certain nombre de méthodes d’inoculation et avons récemment mis au point une méthode simple et efficace d’inoculation de l’oïdium. Cette méthode de brossage à mailles peut assurer une inoculation uniforme, et est simple et évolutive, devrait donc être facilement adoptée par tout laboratoire travaillant avec l’oïdium.

Protocole

1. Fabrication d’une boîte d’inoculation standard avec un couvercle supérieur amovible monté avec un filet

1. Achetez un rouleau de treillis de membrane en nylon de 50 μm ou de treillis en acier inoxydable de 48 μm (recommandé) dans les magasins. Assurez-vous d’en commander suffisamment pour couper en plusieurs morceaux de 14 po x 26 po pour remplacer les mailles usées.
2. Achetez un panneau de fibres ou de contreplaqué de densité moyenne de 1/4 po x 2 pi x 4 pi et coupez deux pièces de 24-1/2 po x 10 po et deux pièces de 12 po x 10 po pour fabriquer une boîte d’inoculation. Utilisez 8 pinces d’angle pour soutenir les quatre côtés.
   NOTA : Si elle fait face au côté large de l’enceinte, le côté gauche de 12 po x 10 po est fixé en permanence et le côté droit de 12 po x 10 po est une porte amovible maintenue en place par quatre prises magnétiques (figure 1A, B).
3. Placez quatre entretoises de coin de 2 pouces deux dans chaque coin intérieur du côté gauche, un pouce du haut et un pouce du bas, marquez et percez un trou. Utilisez des vis pour fixer de façon permanente le côté court gauche à deux côtés longs (avant et arrière). La distance intérieure entre les deux côtés longs doit être de 12 po et non de 11-1/2 po.
4. Avec les pinces d’angle toujours en place et le bon alignement de la porte droite, marquez et percez l’emplacement des 4 prises magnétiques pour maintenir la porte amovible droite en place. Installez un bouton de bouton à la porte. Le haut de la porte s’accroche sous le couvercle supérieur (Figure 1A,B).
5. Pour faire un couvercle supérieur amovible avec un treillis, coupez le long goujon carré en bois en 2 ensembles de 26 po et 12-3/4 po. Collez et clouez les quatre pièces de manière à ce qu’elles s’adaptent autour de la boîte - les dimensions intérieures du cadre étant un peu plus grandes que les dimensions extérieures de la boîte, car le maillage de l’écran sera attaché à ce cadre.
6. Coupez le maillage de l’écran à un peu moins de 14 po x 26 po. Ne laissez pas l’écran dépasser le cadre afin d’éviter les arêtes vives. Avoir de l’aide pour étirer l’écran sur le cadre. Tenez le treillis avec le cadre à l’aide de pinces (Figure 1C) et utilisez une agrafeuse munie des agrafes appropriées pour fixer l’écran au cadre.
7. Coupez deux ensembles de chevilles carrées en bois plus courtes (21 po et 9 po) et utilisez des vis pour prendre en sandwich le maillage le long du cadre à l’aide des 4 morceaux plus courts de cheville carrée en bois (figure 1C, D).

2. Fabrication d’une chambre d’inoculation

1. Achetez des feuilles d’acrylique transparentes et des articles de quincaillerie dans les magasins appropriés. Découpez une fenêtre ouvrante de 7 po x 20 po sur la feuille d’acrylique de la face avant de la boîte, comme illustré à la figure 2C.
2. Assemblez les côtés gauche et droit, les feuilles d’acrylique avant (avec fenêtre) et arrière dans une boîte à l’aide de 8 pinces d’angle, comme illustré à la figure 2A. Assurez-vous que les mesures intérieures de la chambre sont égales aux dimensions de la feuille supérieure.
   REMARQUE: Le côté droit est là pour le support et ne sera pas fixé aux feuilles avant ou arrière. Il est 1/2 en plus court que les autres feuilles exprès. Ce côté droit deviendra une porte à « volet » « rabattable » maintenue en place par une charnière à angle droit en bas et deux prises magnétiques en haut, comme le montre la figure 2C,D.
3. Utilisez des entretoises d’angle pour fixer les panneaux ensemble (figure 2B,C). Tenez les accolades en place, marquez avec un marqueur sharpie, centrez le poinçon, puis percez le trou.
   REMARQUE: Le forage acrylique est différent du perçage de quoi que ce soit d’autre, ne forcez pas ou le côté du trou opposé à la perceuse peut se fissurer. Utilisez des rivets ou des vis. Ne serrez pas trop les vis ou l’acrylique pourrait se fissurer avec le temps.
4. Tournez le boîtier sur sa face arrière et retirez les 4 pinces d’angle et positionnez la feuille supérieure en place. Marquez et percez.
5. Installez la charnière à angle droit, faite d’une attelle d’angle 3/4. Utilisez un écrou de verrouillage de retenue en nylon comme tige de charnière. Ne serrez pas, laissez un espace pour que la porte tourne sur cette charnière.
6. Marquez, centrez le poinçon, percez et fixez les deux aimants de porte magnétiques avec des vis à tête panoramique #6-32x3/4 ». Ensuite, fixez les barres de retenue avec des vis à tête plate #6-32x3/8 », voir Figure 2C,D.

3. Inoculer des plantes dans des appartements

1. Préparer des spores fraîches d’oïdium sous forme d’inocula (p. ex. oïdium d’Arabidopsis Golovinomyces cichoracearum UCSC1). Cultiver des plantes mutantes Arabidopsis immunodéprimées pad4-1 ¹¹ dans une chambre de croissance (22 °C, 65 % d’humidité relative pendant 6 à 8 semaines) et inoculer un plat ou demi de plantes pad4-1 pour accumuler suffisamment de spores fraîches d’oïdium (Figure 3A).
2. Cultivez les plantes pour déterminer les phénotypes d’infection dans des appartements standard de 11 po x 21 po x 2,5 po.
   NOTE: Les plantes d’Arabidopsis cultivées sous des journées courtes (8 h de lumière, 16 h d’obscurité; 22 °C) pendant six à huit semaines sont bonnes pour les tests d’infection par l’oïdium.
3. Lorsque des spores fraîches d’oïdium provenant de plantes infectées sont disponibles 8 à 10 jours après l’inoculation (dpi), déplacer un plat de plantes pour le test d’infection dans la boîte d’inoculation à l’intérieur de la chambre d’inoculation (figure 1B, 2C).
4. Coupez 15 à 20 feuilles d’Arabidopsis fortement infectées (ou 4 à 6 rosettes infectées, selon la taille de la feuille / rosette et le niveau d’inoculation), laissez sécher les feuilles s’il y a de l’eau condensée.
5. Prenez 1-2 feuilles ou une rosette avec une paire de longues pinces en utilisant une main et faites face aux feuilles à l’envers. Ensuite, passez les deux mains à travers l’ouverture de la chambre et frappez doucement le bras de la pince avec une paire de ciseaux tout en déplaçant lentement les feuilles/rosette au-dessus de la maille montée sur la boîte d’inoculation (Figure 3B). Répétez cette opération jusqu’à ce que toutes les feuilles ou rosettes soient utilisées.
   REMARQUE: Les spores matures se délogent facilement des conidiophores des feuilles infectées. Essayez de déloger les spores sur le maillage aussi uniformément que possible.
6. Utilisez une ou deux brosses fines pour brosser délicatement les spores à travers le filet (figure 3C). Assurez-vous de brosser toute la surface du maillage dans différentes directions pendant quatre fois ou plus afin de maximiser la répartition uniforme des spores sur les plantes au fond de la boîte d’inoculation (figure 3D). Tapotez doucement le filet plusieurs fois avec les brosses pour secouer les spores qui sont coincées dans le maillage.
7. Laissez les spores se déposer pendant une demi-minute. Ensuite, sortez l’appartement contenant les plantes inoculées de la boîte d’inoculation. Couvrir l’appartement avec un dôme en plastique et le placer dans une chambre de croissance (22 °C, 65% d’humidité relative). Le phénotypage de la maladie peut être effectué à 5, ou 8 à 12 dpi ¹².

4. Inoculer les plantes avec des boîtes d’inoculation plus petites

NOTE: Dans les cas où moins de plantes doivent être inoculées, la boîte d’inoculation standard peut toujours être utilisée. Assurez-vous de placer les plantes au milieu de la boîte. Délogez et brossez les spores dans la zone du maillage qui recouvre les plantes pour vous assurer que toutes les plantes sont inoculées tout en économisant l’inocula. Alternativement, et de préférence, des boîtes d’inoculation plus petites peuvent être utilisées (comme décrit ci-dessous).

1. Convertissez les boîtes en carton en boîte d’inoculation. Il suffit de retirer les côtés supérieur et inférieur de la boîte, de coller le coin pour le raffermir si nécessaire et de monter un maillage de 50 μm de taille appropriée sur le dessus en le collant ou en l’agrafant (figure 4A,B).
2. Déplacez l’appartement contenant les plantes à l’intérieur de la chambre d’inoculation, placez la plus petite boîte d’inoculation sur le dessus de l’appartement pour couvrir les plantes.
3. Déloger et brosser les spores comme décrit ci-dessus.

5. Inoculer les feuilles détachées dans les boîtes de Petri

REMARQUE : Dans les cas où (i) les spores fraîches de l’oïdium sont très limitées et/ou (ii) les plantes doivent être maintenues propres pendant que les phénotypes de la maladie et/ou la localisation sous-cellulaire des protéines dans les cellules infectées doivent être évalués, les feuilles détachées peuvent être utilisées pour l’infection dans les plaques de MS-agar.

1. Faites une mini boîte d’inoculation qui n’est que légèrement plus grande qu’une boîte de Pétri.
2. Préparer des assiettes de gélose moyenne Murashige et Skoog (MS) de 1/2 concentration (1,5%). Ajouter du thiabendazole (40 mg/L) pour réduire la contamination par les moisissures si nécessaire. Conservez les assiettes à 4 °C au réfrigérateur jusqu’à utilisation.
3. Coupez une ou deux feuilles complètement expansées à partir de la base du pétiole pour chaque plante à tester. Insérez le pétiole des feuilles détachées dans un milieu gélosé à un angle de ~30°.
   REMARQUE : Chaque plaque peut contenir de 20 à 40 feuilles selon la taille des feuilles et la plaque utilisée (figure 4C).
4. Inoculer les feuilles à l’intérieur de la chambre d’inoculation comme décrit ci-dessus. Déplacez la plaque avec le couvercle vers une chambre de croissance.
5. Coupez une petite section d’une feuille et vérifiez la localisation subcellulaire des protéines à des moments précis.
6. Pour évaluer les phénotypes d’infection, transférer les feuilles dans une plaque fraîche aseptique de MS-agar à 4 ou 5 dpi. Couper la base du pétiole avant d’insérer les feuilles dans le milieu gélosé frais. Évaluer les phénotypes de la maladie à 8 ou 9 dpi.

Résultats

Ici, nous présentons une nouvelle méthode d’inoculation des spores de l’oïdium qui est facile à préparer, à utiliser et à ajuster. La figure 1 montre l’assemblage de la boîte d’inoculation standard en mettant l’accent sur la marque du couvercle amovible monté avec un treillis à membrane de 50 μm. La figure 2 montre l’assemblage de la chambre d’inoculation. La figure 3 illustre les principales étapes du processus d’inoculation à l’ai...

Discussion

Notre méthode d’inoculation à base de boîte à mailles présente plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes d’inoculation. Tout d’abord, il peut atteindre une distribution uniforme des spores s’il est utilisé correctement, comme le montre la figure 5. Deuxièmement, l’utilisation d’un maillage de ~50 μm, ainsi que le délogement des spores par agitation douce des feuilles infectées peuvent réduire l’infection des plantes par les thrips ou d’autres insectes infectant les plantes présents...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
; 48 et micro ; M Grille grillagée en acier inoxydable ; Taille : 24 » X 48"  ;	Amazon	NA	Pour la fabrication du couvercle d’une boîte d’inoculation
#6-32 x ¾ ; " Vis à métaux, rondelles plates et écrous  ;	Home Depot	NA	Pour la fabrication d’une chambre d’inoculation
#6-32 Contre-écrou en nylon zingué (paquet de 4)	Home Depot	NA	Pour la fabrication d’une chambre d’inoculation
#6-32x3/8" Vis à métaux à tête plate Phillips, rondelles plates et écrous  ;	Home Depot	NA	Pour la fixation des plaques de verrouillage de porte magnétiques
#8-32x1/2" Vis à métaux, rondelles plates et écrous	Home Depot	NA	Pour fixer les renforts d’angle et la charnière de porte
Feuille de film acrylique extrudé transparent de 0,250 d’épaisseur ;   ; Taille : 17 ½ ; « X 20"	Professional Plastics	SACR.250CEF	Pour la fabrication d’une chambre d’inoculation
Feuille de film acrylique extrudé transparent de 0,250 d’épaisseur ; Taille : 18 » x 20"  ;   ;	Plastiques professionnels	; SACR.250CEF	Pour la fabrication d’une chambre d’inoculation
Feuille de film acrylique extrudé transparent de 0,250 épaisseur masquée ; Taille : 18 » x 30"  ;	Professional Plastics	SACR.250CEF	Pour la fabrication d’une chambre d’inoculation
feuille de film acrylique extrudé transparent de 0,250 épaisseur ; Taille : 20" x 29 ½ ; «	Professional Plastics	SACR.250CEF	Pour la fabrication d’une chambre d’inoculation
d’armoire 1-5/8 » Loquet magnétique blanc	Home Depot	Modèle #P110-W	Pour la fabrication d’une chambre d’inoculation
Équerre d’angle en acier zingué de 2 » (paquet de 8)  ;	Home Depot	; Modèle #13611  ;	Pour la fabrication d’une boîte et d’une chambre d’inoculation
Pince d’angle 3	Harbor Freight Tools	SKU 63653, 1852, 60589	Pour la fabrication d’une chambre d’inoculation
Entretoise d’angle en acier zingué 3/4"  ; (paquet de 4)	Home Depot	Modèle #13542	Pour la fabrication d’une boîte et d’une chambre d’inoculation
Poignées de porte légères zinguées 4-7/8 »	Depot	Modèle #15184	Pour la fabrication d’une boîte d’inoculation
Mélangeur à ventilateur fin brosses	Michaels Store	M10472846  ;	Pour l’inoculation
Kelleher 3/4 » x 3/4 » x 36 » cheville carrée en bois  ;	Home Depot	NA	Pour fabriquer le couvercle d’une boîte d’inoculation Panneau de
fibres de densité moyenne (1/4" x 2' x 4') ;   ;	Home Depot	Modèle # 1508104	Pour la fabrication d’une boîte d’inoculation
Lamelles en verre rondes avec un 500 & micro ; m grid	ibidi États-Unis Inc.	10816	Pour déterminer la densité des spores