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Article de méthode

Mesure de l’absorption de glutamate à l’aide de L-[3H]-glutamate radiomarqué dans des coupes transversales aiguës obtenues à partir d’hippocampe réséqué par des rongeurs

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DOI :

10.3791/62292

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2 octobre 2021

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1Graduate Program in Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2Department of Biochemistry, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 3Department of Biological Sciences, Universidade Federal de Ouro Preto, 4Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, Universidade Federal de Ouro Preto

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un moyen simple et fiable d’obtenir des tranches transversales aiguës de l’hippocampe ex vivo à partir de souris et de rats à l’aide d’un hachoir à tissus. Les tranches obtenues à partir d’hippocampes réséqués peuvent être soumises à une analyse fonctionnelle de l’absorption du glutamate afin d’étudier l’homéostasie du système glutamatergique.

Résumé

L’élimination du glutamate de l’espace extracellulaire par des transporteurs dépendants du Na+ de haute affinité est essentielle pour garantir le bon fonctionnement des mécanismes de connectivité intrinsèques du cerveau et le maintien de l’homéostasie. L’hippocampe est une structure cérébrale unique qui gère les fonctions cognitives supérieures et fait l’objet de plusieurs études concernant les maladies neurologiques. L’étude des mécanismes physiologiques et pathologiques chez des modèles de rongeurs peut bénéficier de préparations de tranches aiguës d’hippocampe (AHS). L’AHS a l’avantage de fournir des informations fiables sur le fonctionnement cellulaire puisque la cytoarchitecture et les circuits synaptiques sont préservés. Bien que les préparations AHS soient couramment utilisées dans les laboratoires de neurochimie, il est possible de trouver certaines différences méthodologiques dans la littérature. Considérant que des protocoles de préparation de coupes distinctes pourraient modifier les régions de l’hippocampe analysées, ce protocole propose une technique standard pour obtenir des AHS transverses à partir de l’hippocampe réséqué. Ce protocole simple à réaliser peut être utilisé dans des modèles expérimentaux de souris et de rats et permet plusieurs approches ex vivo investiguant la dynamique neurochimique (dans l’hippocampe dorsal, intermédiaire et ventral) dans différents contextes (par exemple, manipulations transgéniques) ou après des manipulations in vivo (par exemple, des traitements pharmacologiques ou des modèles de rongeurs appropriés pour étudier des troubles cliniques). Après avoir disséqué l’hippocampe du cerveau du rongeur, des coupes transversales le long de l’axe septo-temporal (300 μm d’épaisseur) ont été obtenues. Ces AHS contiennent des parties distinctes de l’hippocampe et ont été soumis à une investigation neurochimique individuelle (par exemple : des transporteurs de neurotransmetteurs utilisant leurs substrats respectifs). Comme l’hippocampe présente une forte densité de synapses excitatrices et que le glutamate est le neurotransmetteur le plus important dans le cerveau, le système glutamatergique est une cible intéressante pour les phénomènes observés in vivo. Ainsi, le protocole actuel fournit des étapes détaillées pour explorer l’absorption du glutamate dans l’AHS ex vivo à l’aide du L-[3H]-glutamate. L’utilisation de ce protocole pour étudier la fonction hippocampique peut aider à mieux comprendre l’influence du métabolisme du glutamate sur les mécanismes de neuroprotection ou de neurotoxicité.

Introduction

L’hippocampe, une structure cérébrale enfouie profondément dans le lobe temporal médian de chaque hémisphère, où se trouvent les fonctions cognitives élevées, est l’une des entités les plus étudiées du système nerveux central (SNC). La fonction de l’hippocampe est fortement liée à la mémoire déclarative et spatiale. Cette structure joue également un rôle dans le comportement émotionnel et dans la régulation des fonctions hypothalamiques 1,2,3,4. Depuis qu’il a été confirmé, d’importants mécanismes de formation et de stockage de la mémoire ont lieu dans cette région et le domaine a commencé à étudier en profondeur la région de l’hippocampe. En conséquence, l’utilisation de modèles animaux qui ressemblent à des troubles cérébraux humains liés aux fonctions hippocampiques, tels que la maladie d’Alzheimer, l’épilepsie, la dépression majeure et le stress, continue de croître.

Chez les rongeurs, l’hippocampe est une structure de forme incurvée partant du septum médial vers le cortex temporal ventral. Le long de son axe longitudinal, l’hippocampe peut être divisé en trois régions différentes, chacune liée à des circuits spécifiques1. La partie supérieure constitue l’hippocampe dorsal/septal, la partie inférieure constitue l’hippocampe ventral/temporal et la zone entre les deux est considérée comme l’hippocampe intermédiaire. Il existe une littérature abondante couvrant les différences dans les projections cellulaires de chaque partie, ainsi que des rapports sur des aspects cognitifs spécifiques traités par chaque 5,6. En ce qui concerne son organisation interne, les régions de l’hippocampe peuvent être séparées par ses zones fonctionnelles. L’aire du cornu ammonis (CA) est subdivisée en CA1, CA2 et CA3 et s’étend à travers la partie supérieure de l’hippocampe, au-dessus du gyrus denté (DG) et du subiculum, qui sont les parties les plus internes de l’hippocampe (Figure 1). Les synapses situées dans ces régions subissent un réarrangement continu, montrant des processus neurogènes et plastiques tout au long de la vie3. Plusieurs études ont déjà montré que des manipulations expérimentales distinctes dans l’hippocampe entraînent un handicap cognitif7. En ce qui concerne l’évaluation des altérations biochimiques et moléculaires, les techniques utilisant des coupes cérébrales aiguës sont un excellent outil pour améliorer les connaissances sur différents aspects de l’hippocampe.

En raison de sa précision et de sa reproductibilité, de nombreuses études qui ont exploré des aspects des phénomènes liés à la neurotransmission (activité enzymatique, absorption ou libération) ont utilisé l’AHS transverse de l’hippocampe réséqué obtenue par hachoir de tissus 8,9,10,11,12. Cette technique de tranchage suivie d’une évaluation de l’absorption convient aux expériences neurochimiques sophistiquées qui nécessitent la préservation de l’activité de transport du tissu hippocampique. Pour cela, l’utilisation d’un hachoir à tissus est préférable, car il est plus rapide que le vibratome et fournit l’AHS en temps opportun pour une utilisation expérimentale avec une précision appropriée.

La neurotransmission excitatrice dans le cerveau est accomplie par le glutamate, le neurotransmetteur le plus abondant, y compris dans l’hippocampe, qui dépend dans une plus large mesure de la signalisation du glutamate13,14. Cette abondance de neurotransmetteurs est étroitement contrôlée dans l’environnement extracellulaire. À l’intérieur des vésicules intracellulaires, cependant, il peut atteindre jusqu’à 100 mM15. Une fois libéré dans la fente synaptique, le glutamate n’est pas métabolisé et doit être éliminé afin d’éviter l’excitotoxicité, généralement déclenchée en réponse à une surcharge de glutamate14,16. Le seul mécanisme séparant la toxicité de la signalisation normale est le transport dépendant du sodium par l’activité de protéines situées dans les membranes plasmiques des cellules gliales 14,17,18,19. Ces transporteurs [GLAST (EAAT1) et GLT-1 (EAAT2)] régulent étroitement les niveaux de glutamate extracellulaire et peuvent être modulés par un large éventail de facteurs, tels que la transcription de l’ADN, l’épissage et la dégradation de l’ARNm, la synthèse et le ciblage des protéines, l’activité de transport des acides aminés et les activités des canaux ioniques 20,21,22,23. En conséquence, leur activité peut être mesurée par le transport d’un substrat radiomarqué, comme le glutamate.

L’utilisation de substrats radiomarqués représente une méthode préférable pour quantifier l’activité du transporteur, car ils permettent de suivre des mécanismes dynamiques tels que le transport à travers les membranes cellulaires. Outre leur sensibilité et leur spécificité élevées, les expériences de radiotraceur présentent les avantages de leur simplicité et de leur faible coût par rapport aux technologies concurrentes telles que la spectrométriede masse 24. De plus, en n’utilisant que de petites quantités de traceur, les niveaux physiologiques des substrats ne sont pas altérés, ce qui donne une image plus représentative du scénario réel d’activité métabolique.

La disponibilité d’approches expérimentales ex vivo est essentielle pour soutenir la recherche fondamentale sur l’identification de nouvelles cibles moléculaires et les activités de découverte de médicaments. Ainsi, compte tenu de la pertinence de l’absorption du glutamate pour l’homéostasie du système glutamatergique et de la forte prédominance des synapses glutamatergiques dans l’hippocampe, ce protocole démontre comment évaluer l’activité d’absorption du glutamate de manière rapide et facile à reproduire en utilisant l’AHS transversale de l’hippocampe réséqué. Ce test utilise du L-[3H]-glutamate radiomarqué, qui permet des comparaisons quantitatives et une visualisation claire des résultats, et peut être modifié pour être utilisé avec des substrats spécifiques ou personnalisés, dans une large gamme de conditions de réaction25.

Les coupes cérébrales aiguës présentent de nombreux avantages et ont été utilisées pour soutenir le changement de fonction dans le cadre de manipulations pharmacologiques et génétiques 26,27,28. Leur utilisation bénéficie des éléments suivants : (i) la conservation de la fonctionnalité neurochimique et les interactions intercellulaires ; (ii) la possibilité d’effectuer de nombreuses manipulations pharmacologiques et génétiques pour étudier les voies sous-jacentes aux fonctions neuronales et gliales ; (iii) contrôle précis de l’environnement extracellulaire ; et (iv) un bon accès expérimental à différentes zones de l’hippocampe (telles que CA1, CA3 ou DG), qui sont conservées dans la même tranche en fonction de la méthode de tranchage. Considérant que des protocoles de préparation de coupes distinctes pourraient modifier les régions de l’hippocampe exposées, ce protocole propose une technique standard pour obtenir une AHS transverse à partir de l’hippocampe réséqué. Ce protocole simple à réaliser peut être utilisé dans des modèles de rongeurs et peut permettre plusieurs approches ex vivo investiguant la dynamique neurochimique dans différents contextes ou après des manipulations in vivo29,30 (Figure 2).

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Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément au Guide des NIH pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et approuvées par le comité d’éthique local (approbation du projet # 33732/CEUA-UFRGS). Tous les efforts ont été faits pour minimiser l’inconfort et le nombre d’animaux utilisés dans les expériences.

1. Préparation de la solution saline équilibrée de Hank (HBSS)

  1. Dans un bécher de 1 L, ajoutez environ 0,5 L d’eau stérile ou doublement distillée et commencez à remuer vigoureusement sur un agitateur magnétique. Ajouter les composants HBSS suivants (en mM) : 137 NaCl, 0,63 Na2HPO4, 4,17 NaHCO3, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 0,41 MgSO4, 0,49 MgCl2, 5,55 D-glucose (voir le tableau 1).
  2. Ajustez le pH à 7,4 avec du NaOH ou du HCl avant d’ajouter 1,26 mM de CaCl2 pour éviter les précipitations. Ajoutez ce sel très lentement et sous agitation. Amenez-le à un volume de 1 L avec de l’eau stérile ou doublement distillée. Ce tampon sera utilisé pour laver les tissus et maintenir l’AHS dans un état viable pendant l’expérience. Il fournira des ions inorganiques tout en maintenant un pH physiologique et une pression osmotique.
    REMARQUE : L’ajout de cations divalents se fait après titrage du pH pour éviter les précipitations.
  3. Séparez deux fractions différentes de HBSS : l’une sera conservée dans un bain d’eau à 37 °C et utilisée pendant le paradigme d’absorption, tandis que l’autre sera maintenue glacée (4 °C) et utilisée pour les lavages avant et après l’expérience.
    REMARQUE : Il est possible de préparer des solutions mères de chaque sel et de les conserver congelées jusqu’à utilisation, de les conserver au congélateur (-20 °C) et de les utiliser dans les quelques semaines.

2. Préparation du HBSS sans sodium

  1. Avant de mélanger les composants pour HBSS sans sodium, préparez à l’avance deux autres solutions : Glucamine-HCl (137 mM) et Glucamine-HEPES (4,17 mM). Mélanger les concentrations équimolaires de base NMDG et de HCl pour obtenir la solution de glucamine-HCl. Effectuer la même procédure avec de l’acide libre 2,0 M HEPES pour obtenir la solution NMDG-HEPES (voir tableau 2).
  2. Dans un bécher de 0,5 L, ajoutez environ 0,2 L d’eau stérile ou doublement distillée et commencez à agiter vigoureusement dans un agitateur magnétique. Ajouter les composants tampons suivants (en mM) : 137 Glucamine-HCl, 4,17 Glucamine-HEPES, 5,36 KCl, 0,44 KH2PO4, 1,26 MgSO4, 0,41 MgCl2 et 5,55 D-Glucose (voir tableau 2).
  3. Ajustez le pH à 7,4 avec du KOH ou du HCl et continuez à remuer. Ajouter 1,26 mM de CaCl2 très lentement et en agitant. Amener la solution à un volume de 0,3 L avec de l’eau stérile ou doublement distillée.
    REMARQUE : Ce tampon sera utilisé pour mesurer l’absorption de glutamate non dépendante du sodium, ce qui permettra de mesurer l’absorption passive/non spécifique de glutamate. Après l’expérience, ce paramètre est soustrait de l’absorption totale de glutamate pour déterminer l’absorption dépendante du sodium.
  4. Après préparation, ce tampon peut être stocké dans le congélateur (-20 °C) et utilisé par la suite dans des expériences ultérieures. Il en va de même pour les solutions NMDG.
  5. Pendant l’expérience, gardez toujours le HBSS sans sodium glacé au frais.

3. Organisation du matériel pour la dissection de l’hippocampe chez le rat

  1. Organisez la zone de dissection à côté de l’évier avant de commencer l’expérience. Placez une guillotine spécifique pour les rats (pour les souris, il sera possible d’utiliser des ciseaux tranchants) dans l’évier pour garder le banc propre.
  2. Disposez les instruments chirurgicaux et autres matériaux pour l’ablation du cerveau et la dissection de l’hippocampe dans l’ordre d’utilisation et aussi près que possible de l’endroit où ils sont nécessaires (voir le tableau des matériaux). Placez la boîte de Pétri dans un seau à glace. Gardez également un sac en plastique à proximité pour l’élimination de la carcasse.
  3. Préparez les deux solutions HBSS à la concentration recommandée pour l’utilisation. Le HBSS sans sodium peut être congelé et décongelé avant l’expérience.
    1. Séparez les HBSS contenant du sodium en deux portions distinctes, comme recommandé précédemment : l’une chauffée à 37 °C et l’autre à 4 °C qui sera utilisée pour la dissection. Décongeler le HBSS sans sodium et le conserver à 4 °C.
  4. Pour induire l’anesthésie, utilisez de l’isoflurane31 à 3 %. Avant de commencer l’expérience, assurez-vous de vérifier l’absence de réflexe cornéen et de stimulation nociceptive de la patte arrière.
    REMARQUE : Veillez à choisir le médicament anesthésique adéquat, car il ne doit pas interférer avec les paramètres qui seront étudiés. Pour ce protocole, il est recommandé d’utiliser un anesthésique inhalé (par exemple, l’isoflurane)32.

4. Euthanasie du rat

  1. Euthanasier le rongeur en utilisant les méthodes approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), ainsi que par le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH Publications No. 8023, révisé en 1978).
  2. À l’aide d’une guillotine, décapitez le rat immédiatement avant la première vertèbre cervicale.
  3. Placez la tête sur une serviette en papier propre imbibée d’une solution saline froide. Retirez complètement le cuir chevelu avec les ciseaux chirurgicaux de taille S, ainsi que le muscle cutané visant à exposer complètement les sutures sur la surface supérieure du crâne. Amorcez cette procédure avec précaution, en commençant près de l’os occipital et en allant vers l’arrière de l’os nasal.
    REMARQUE : Dans le cas où le modèle expérimental est des souris, utilisez des ciseaux tranchants pour retirer la tête. Assurez-vous de couper juste derrière le crâne pour exclure l’excès de tissu.

5. Retrait du cerveau du rat

  1. Effectuez l’ablation du cerveau le plus rapidement possible. À l’aide d’une pince à os appropriée, faites une seule incision entre les deux trous d’œil reliant les deux orifices du crâne du rat. Ensuite, placez une pointe de ciseau chirurgical de taille S dans le foramen magnum et faites une seule incision latérale dans le crâne. Répétez l’opération pour l’autre côté.
  2. Coupez les plaques crâniennes à partir de la plaque occipitale, puis le long de la suture médiane des plaques pariétales, et enfin à la plaque frontale vers le nez. Assurez-vous que la tête du rongeur est fermement tenue et que la pression est dirigée loin du cerveau pour éviter d’endommager les tissus en dessous.
    REMARQUE : Il est extrêmement important que la pression soit dirigée loin du cerveau pour éviter d’endommager les tissus en dessous. Chez les jeunes rats et les souris, il est possible de couper le crâne avec de petits ciseaux chirurgicaux.
  3. Retirez délicatement les plaques occipitale et pariétale des deux hémisphères à l’aide d’une spatule ou d’une pince. Inspectez soigneusement toute matière dure-mère qui pourrait être attachée aux os du crâne et étirée à la surface du cerveau.
  4. Retirez immédiatement le cerveau à l’aide de la fine spatule à double extrémité et placez délicatement le cerveau entier sur une boîte de Pétri glacée recouverte de papier filtre. Avec la pipette Pasteur en plastique, humidifiez-le avec une solution saline glacée. Commencez immédiatement à disséquer l’hippocampe des deux hémisphères cérébraux comme expliqué ci-dessous.
  5. Réséquez soigneusement le cervelet de tout le cerveau avec la lame de scalpel #11. Afin de séparer complètement les hémisphères cérébraux, passez une lame de scalpel dans toute la fissure intrahémisphérique. Avec la pipette en plastique Pasteur, humidifiez-la fréquemment avec un tampon HBSS glacé pour garder le tissu humide et préservé.
  6. Prenez chaque hémisphère séparément, réséquez le tronc cérébral et le mésencéphale du cortex sus-jacent avec des ciseaux à iris. Soigneusement, avec les ciseaux chirurgicaux, coupez le tronc cérébral/le mésencéphale/le thalamus, tandis qu’avec une brosse fine, poussez et tirez ces structures cérébrales. En dessous, il sera possible d’observer l’hippocampe (surface médiale) et le ventricule latéral. Le cortex avec l’hippocampe devrait maintenant être libéré du tronc cérébral.

6. Dissection de l’hippocampe chez le rat

  1. Pour réséquer l’hippocampe, placez un hémisphère cérébral dans le plan coronal avec le cortex pariétal vers le bas. À ce moment, il est possible d’observer les fibres blanches de fimbria qui forment une hyperbole peu profonde au bas de l’hippocampe.
  2. Très soigneusement, avec la main non dominante, ancrez le tissu cérébral avec une pince à épiler fine. Avec votre main dominante, placez d’autres pinces à épiler sous l’extrémité caudale de l’hippocampe.
  3. En ancrant les faisceaux médians de la substance blanche, placez la pince à épiler complètement sous l’hippocampe pour le séparer doucement du reste du cerveau. Appliquez une pression tout en déplaçant légèrement la deuxième pointe vers l’avant et latéralement. Si cela est fait correctement, l’hippocampe devrait atterrir sur le papier filtre.
  4. Pour terminer le curage de l’hippocampe, retirez le tissu de rechange avec la même pince à épiler (généralement le cortex, les vaisseaux sanguins et la substance blanche restants). Répétez la même méthodologie pour le deuxième hémisphère.
  5. Une fois les deux hippocampes retirés, transférez-le dans une boîte de Pétri avec HBSS placée sur le seau à glace et transférez-le sur la table de découpe au-dessus de la lame dans le hachoir à tissus. Assurez-vous de bien identifier les zones dorsale et ventrale si l’investigation nécessite de les analyser séparément.
    REMARQUE : Il est important de toujours distinguer les parties ventrale et dorsale de l’hippocampe lors de la dissection. Ce faisant, l’extrémité antérieure sera tournée vers le haut33. Cette partie de l’hippocampe est légèrement plus mince que l’extrémité postérieure.

7. Préparation des tranches

REMARQUE : Lors de la disposition du matériel chirurgical sur la paillasse (séance 2), préparez le hachoir à tissus pour obtenir la tranche transversale de l’hippocampe réséqué.

  1. Réglez les paramètres dans le hachoir à tissus avant son utilisation. Le hachoir peut couper des tranches de 100 à 400 μm ; Réglez-le sur 300 μm. De plus, il est recommandé une plage de 60 à 80 coups par minute, car il maintient l’intégrité des tissus pendant la procédure de tranchage.
  2. Après toutes les procédures effectuées lors de la séance 2, une fois que l’hippocampe a été réséqué du cerveau et placé sur le papier filtre humidifié avec une solution saline froide sur un support lisse en polypropylène, alignez chaque hippocampe sur le papier filtre avant de les soumettre à la procédure de hachage.
  3. Placez l’hippocampe à la fois sur la table de découpe circulaire en acier inoxydable du hachoir à tissus, perpendiculairement aux lames de coupe pour obtenir les tranches transversales de l’hippocampe le long de l’axe septo-temporal. Avant de commencer le processus de hachage, humidifiez légèrement la lame avec de l’alcool isopropylique. Cette procédure empêche le tissu de coller sur la lame, ce qui permet un tranchage plus lisse et plus précis.
  4. Après avoir allumé l’équipement, la lame du bras de hachage sera levée et abaissée, tranchant le tissu dans l’épaisseur sélectionnée. Il s’agit d’un processus rapide, et normalement le tissu sera correctement tranché au bout d’une minute. Il est possible de hacher plus d’un hippocampe en même temps s’ils sont correctement séparés sur la table de découpe.
  5. Pour séparer les tranches, prélevez soigneusement chaque échantillon tranché du hachoir à tissus à l’aide de la spatule à double extrémité et plongez-le dans une boîte de Pétri avec une solution saline glacée. À l’aide de deux pinceaux fins, pincez doucement l’hippocampe et séparez les tranches. Veillez à maintenir l’intégrité de la tranche tout au long de ce processus.
    1. Effectuez cette expérience en trois exemplaires, puis sélectionnez 6 tranches dans chaque échantillon : 3 tranches pour l’absorption totale de glutamate et 3 pour l’absorption non spécifique.
  6. À l’aide du pinceau, transférez délicatement chaque tranche de la boîte de Pétri dans une assiette à 24 puits contenant : (i) 1 mL de HBSS ; et (ii) 1 mL de HBSS sans sodium. Identifiez le puits/la plaque avec les groupes expérimentaux correspondants et effectuez l’analyse au moins en trois exemplaires.
    REMARQUE : En raison d’un problème limité dans le temps, si l’expérience est réalisée en trois exemplaires, elle limite le nombre d’animaux/groupes à seulement 6 à la fois (un hippocampe par animal en 5 minutes d’absorption). Cela signifie que le L-[3-H]-glutamate sera administré toutes les 15 s jusqu’à ce que toutes les tranches soient incubées. Pour arrêter la réaction, le même intervalle doit être observé pour s’assurer que tous les échantillons sont exposés à une période d’incubation de 5 minutes.

8. Dosage de l’absorption du glutamate

  1. Lors de la stabilisation des tranches dans le tampon respectif (HBSS ou HBSS sans sodium), préparez la solution contenant des substances radioactives en diluant le L-[3H]-glutamate dans de l’eau stérile jusqu’à une concentration finale de 4,5 μCi/mL dans un volume final qui permet d’obtenir 20 μL par tranche plus un peu d’excès, ce qui évitera l’absence d’apport radioactif à la fin du lot, puisqu’il faudra quantifier le nombre de désintégrations par minute (DPM) qui ont été proposées à chaque tranche au départ.
    REMARQUE : Pour chaque plaque à 24 puits, il est recommandé de préparer 500 μL de L-[3H]-glutamate à 4,5 μCi/mL en raison du temps d’incubation total nécessaire pour l’absorption du L-[3H]-glutamate (5 min) et du temps nécessaire pour pipeter chaque aliquote de 20 μL (0,33 μCi dans chaque puits), comme expliqué ci-dessous. La concentration de base de L-[3H]-glutamate est généralement de 1,0 mCi/mL, il faut donc préparer une dilution de 1:200 à appliquer sur les tranches.
  2. Après 15 min de pré-incubation dans le HBSS, retirer complètement le tampon à l’aide d’une pipette Pasteur et le remplacer en ajoutant aux tranches 280 μL de l’un des éléments suivants : (i) HBSS régulier (37 °C) pour une absorption totale ; ou (ii) sans sodium HBSS (4 °C) pour une absorption non spécifique. Il est important de noter que l’absorption totale doit être effectuée sur une plaque chauffante à 37 °C, tandis que l’absorption non spécifique est effectuée sur de la glace.
  3. Préparez une minuterie et réglez le début de l’expérience lorsque vous ajoutez 20 μL d’entrée dans le premier puits contenant une tranche. Attendez 15 à 20 s (selon le nombre de tranches dans la plaque) et ajoutez l’entrée radioactive au puits suivant et ainsi de suite jusqu’à la fin des puits contenant des tranches. Répartissez 20 μL d’entrée dans tous les puits en tenant toujours compte du temps total d’incubation (5 min).
  4. Une fois que chacun des puits contenant les tranches dans la plaque est rempli, attendez que la première tranche termine son incubation de 5 minutes avec du L-[3H]-glutamate. Ensuite, retirez immédiatement le milieu d’incubation dans un flacon approprié pour les déchets radioactifs.
  5. Immédiatement après le retrait, ajoutez rapidement 300 μL de HBSS glacé et retirez-le délicatement. Répétez cette procédure deux fois de plus dans chaque puits, en effectuant trois lavages pour chaque tranche. Veillez à utiliser le HBSS sans sodium pour laver les tranches consacrées à la mesure d’absorption non spécifique. Après avoir lavé toutes les tranches dans la plaque, ajoutez 300 μL 0,5 M NaOH dans chaque puits et conservez la plaque protégée par du parafilm à 4 °C pendant la nuit.

9. Compter le L-[3H]-glutamate radioactif

  1. Le lendemain, étiquetez autant de tubes que de tranches dans l’expérience et recueillez le contenu du puits dans chaque tube. Assurez-vous que les tranches sont complètement solubilisées dans la solution de lyse. Au besoin, homogénéiser l’échantillon à l’aide d’une aiguille de calibre 26 couplée à une seringue de 1 mL.
  2. Ajouter 1,2 mL de liquide à scintillation à un volume final d’environ 1,5 mL et homogénéiser tous les échantillons dans un vortex avant de les lire dans un compteur à scintillation pendant 60 s chacun.
    REMARQUE : Assurez-vous que les paramètres de détection sont réglés sur le tritium et que le résultat sera livré en DPM.

10. Calculs

  1. Convertissez les résultats donnés par le compteur de scintillation en radioactivité émise par le réactif piégé dans la tranche et représente la quantité de glutamate absorbée. Déduire la valeur obtenue pour l’absorption non spécifique du résultat obtenu avec l’EBSB régulier. Un μCi équivaut à 2,22×106 DPM.
  2. En connaissant la quantité de μCi et la concentration initiale de [3H]L-Glutamate (informations généralement fournies dans la fiole ou la fiche technique du réactif), calculez le L-[3H]-Glutamate capturé par chaque tranche.

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Résultats

L’absorption du glutamate est l’un des mécanismes les plus importants contrôlant la neurotransmission dans le cerveau. L’hippocampe, en particulier, est un lieu essentiel dans la signalisation du glutamate, étant une plaque tournante importante reliant la mémoire, la cognition et les émotions dans le cerveau. Conformément au protocole, des rats Wistar mâles adultes ont été utilisés pour générer des résultats représentatifs. Les animaux ont été anesthésiés à l’aide d’isoflurane à 3 % jusqu’à ce qu’ils soient inconscients....

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Discussion

Le protocole présenté montre une évaluation facile à réaliser de l’absorption du glutamate à l’aide de coupes d’hippocampe. Les résultats démontrent que l’AHS absorbe régulièrement environ 60 fmol de L-[3H]-glutamate radiomarqué, que l’épaisseur de la tranche (quantité de protéines) n’a pas influencé l’absorption de L-[3H]-glutamate (données non présentées), et que les parties dorsale, intermédiaire et ventrale de l’hippocampe ont montré des performances similaires ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs reçoivent un soutien financier de l’Institut national brésilien des sciences et de la technologie en excitotoxicité et neuroprotection [465671/2014-4], CNPq [438500/2018-0] et [152189/2020-3], FAPERGS/CAPES/DOCFIX [18/2551-0000504-5], CAPES [88881.141186/ 2017-01], CNPq [460172/2014-0], PRONEX, FAPERGS/CNPq [16/ 2551-0000475-7], FAPERGS/MS/CNPq/SESRS-PPSUS [30786.434.24734.23112017]

UFOP - MODALIDADE : « EDITAL PROPP 19/2020 AUXÍLIO À PUBLICAÇÃO DE ARTIGOS CIENTÍFICOS - 2020 », PROCESSO N. : 23109.000929/2020-88

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Lame de scalpel #11Swann-Morton525
Boîte de Pétri en verre de 100 mmFournisseurs courants
Whatman de 110 mm de diamètreSigma AldrichWHA1001110
de 42,5 mm de diamètre Filtre WhatmanSigma AldrichWHA1001042
Plaque de culture cellulaire 24 puitsFalcon353047
BeckerFournisseurs
Lames pour le hachoir à tissusWilkinson3241
Rongeur osseuxErwin Guth9,00,005
CaCl2Sigma AldrichC4901
D-[2,3-3H]-Acide aspartiquePerkinElmerNET581001MC11.3 Ci/mmol
(37 MBq)
D-GlucoseSigma AldrichG8270
N-méthyl-D- GlucamineSigma AldrichM2004
HEPESSigma AldrichH3375
Hidex 300 SLHidex Oy.Super Bas Niveau #425-020
Ciseaux à irisErwin Guth8,00,040
IsofluraneCristalia (Sã ; o Paulo, Brésil)4,10,5251 mL/mL
KClSigma AldrichP3911
KH2PO4Sigma AldrichP0662
Acide L-[3,4-3H]-GlutamicPerkinElmerNET490005MC49,7 Ci/mmol
(185 MBq)
MgCl2Sigma AldrichM8266
MgSO4Sigma AldrichM7506
Na2HPO4Sigma AldrichS9763
NaClSigma AldrichS9888
NaHCO3Sigma AldrichS5761
Pipette Pasteur en plastiqueFournisseurs
courantsLiquide à scintillationPerkinElmer1200.437 pour 1 x 5 LitresOptiphase HiSafe 3
Petits ciseaux chirurgicauxErwin Guth8,00,040
Petite pince à épilerErwin Guth6,00,131
Disques de hachage de rechange pour le hachoirFournisseurs
Ciseaux standardErwin Guth8,00,010
Brosses fines ( taille 0 ou 2)Fournisseurs
Spatule fine à double extrémitéErwin Guth470.260E
Hachoir à tissusTed Pella, Inc.Référence 10180
Filtre courantscommunscourants

Références

  1. Knierim, J. J. The hippocampus. Current Biology. 25 (23), 1116-1121 (2015).
  2. Stella, F., Cerasti, E., Si, B., Jezek, K., Treves, A. Self-organization of multiple spatial and context memories in the hippocampus. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 36 (7), 1609-1625 (2012).
  3. Toyoda, H., et al. Interplay of amygdala and cingulate plasticity in emotional fear. Neural Plasticity. 2011, 813749(2011).
  4. Koehl, M., Abrous, D. N. A new chapter in the field of memory: adult hippocampal neurogenesis. European Journal of Neuroscience. 33 (6), 1101-1114 (2011).
  5. Bannerman, D. M., et al. Regional dissociations within the hippocampus--memory and anxiety. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 28 (3), 273-283 (2004).
  6. Moser, E., Moser, M. B., Andersen, P. Spatial learning impairment parallels the magnitude of dorsal hippocampal lesions, but is hardly present following ventral lesions. Journal of Neuroscience. 13 (9), 3916-3925 (1993).
  7. Spiers, H. J., Bendor, D. Enhance, delete, incept: manipulating hippocampus-dependent memories. Brain Research Bulletin. 105, 2-7 (2014).
  8. Gubert, P., et al. Low concentrations of methamidophos do not alter AChE activity but modulate neurotransmitters uptake in hippocampus and striatum in vitro. Life Sciences. 88 (1-2), 89-95 (2011).
  9. Andersen, J. V., et al. Extensive astrocyte metabolism of gamma-aminobutyric acid (GABA) sustains glutamine synthesis in the mammalian cerebral cortex. Glia. 68 (12), 2601-2612 (2020).
  10. Nonose, Y., et al. Guanosine enhances glutamate uptake and oxidation, preventing oxidative stress in mouse hippocampal slices submitted to high glutamate levels. Brain Research. 1748, 147080(2020).
  11. Rambo, L. M., et al. Creatine increases hippocampal Na(+),K(+)-ATPase activity via NMDA-calcineurin pathway. Brain Research Bulletin. 88 (6), 553-559 (2012).
  12. Papp, L., Vizi, E. S., Sperlagh, B. Lack of ATP-evoked GABA and glutamate release in the hippocampus of P2X7 receptor-/- mice. Neuroreport. 15 (15), 2387-2391 (2004).
  13. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  14. Danbolt, N. C. Glutamate uptake. Progress in Neurobiology. 65 (1), 1(2001).
  15. Featherstone, D. E. Intercellular glutamate signaling in the nervous system and beyond. ACS Chem Neurosci. 1 (1), 4-12 (2010).
  16. Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases. Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).
  17. Grewer, C., Rauen, T. Electrogenic glutamate transporters in the CNS: molecular mechanism, pre-steady-state kinetics, and their impact on synaptic signaling. Journal of Membrane Biology. 203 (1), 1-20 (2005).
  18. Tzingounis, A. V., Wadiche, J. I. Glutamate transporters: confining runaway excitation by shaping synaptic transmission. Nature Reviews Neuroscience. 8 (12), 935-947 (2007).
  19. Vandenberg, R. J., Ryan, R. M. Mechanisms of glutamate transport. Physiological Reviews. 93 (4), 1621-1657 (2013).
  20. Peterson, A. R., Binder, D. K. Post-translational Regulation of GLT-1 in Neurological Diseases and Its Potential as an Effective Therapeutic Target. Frontiers in Molecular Neuroscience. 12, 164(2019).
  21. Martinez-Lozada, Z., Guillem, A. M., Robinson, M. B. Transcriptional Regulation of Glutamate Transporters: From Extracellular Signals to Transcription Factors. Advances in Pharmacology. 76, 103-145 (2016).
  22. Carbone, M., Duty, S., Rattray, M. Riluzole elevates GLT-1 activity and levels in striatal astrocytes. Neurochemistry International. 60 (1), 31-38 (2012).
  23. Jimenez, E., et al. Differential regulation of the glutamate transporters GLT-1 and GLAST by GSK3beta. Neurochemistry International. 79, 33-43 (2014).
  24. Wang, C. H., et al. Radiotracer Methodology in the Biological, Environmental and Physical Sciences. , Prentice-hall. (1975).
  25. Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. Journal of Visualized Experiments. (123), e55504(2017).
  26. Buskila, Y., et al. Extending the viability of acute brain slices. Scientific Reports. 4, 5309(2014).
  27. Cho, S., et al. Spatiotemporal evidence of apoptosis-mediated ischemic injury in organotypic hippocampal slice cultures. Neurochemistry International. 45 (1), 117-127 (2004).
  28. Pringle, A. K., Sundstrom, L. E., Wilde, G. J., Williams, L. R., Iannotti, F. Brain-derived neurotrophic factor, but not neurotrophin-3, prevents ischaemia-induced neuronal cell death in organotypic rat hippocampal slice cultures. Neuroscience Letters. 211 (3), 203-206 (1996).
  29. Paniz, L. G., et al. Neuroprotective effects of guanosine administration on behavioral, brain activity, neurochemical and redox parameters in a rat model of chronic hepatic encephalopathy. Metabolic Brain Disease. 29 (3), 645-654 (2014).
  30. Hansel, G., et al. The potential therapeutic effect of guanosine after cortical focal ischemia in rats. PLoS One. 9 (2), 90693(2014).
  31. Cittolin-Santos, G. F., et al. Neurochemical and Brain Oscillation Abnormalities in an Experimental Model of Acute Liver Failure. Neuroscience. 401, 117-129 (2019).
  32. Westphalen, R. I., Hemmings, H. C. Effects of isoflurane and propofol on glutamate and GABA transporters in isolated cortical nerve terminals. Anesthesiology. 98 (2), 364-372 (2003).
  33. Lee, A. R., Kim, J. H., Cho, E., Kim, M., Park, M. Dorsal and Ventral Hippocampus Differentiate in Functional Pathways and Differentially Associate with Neurological Disease-Related Genes during Postnatal Development. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 331(2017).
  34. Thomazi, A. P., et al. Ontogenetic profile of glutamate uptake in brain structures slices from rats: sensitivity to guanosine. Mechanisms of Ageing and Development. 125 (7), 475-481 (2004).
  35. Nonose, Y., et al. Cortical Bilateral Adaptations in Rats Submitted to Focal Cerebral Ischemia: Emphasis on Glial Metabolism. Molecular Neurobiology. 55 (3), 2025-2041 (2018).
  36. Arriza, J. L., et al. Functional comparisons of three glutamate transporter subtypes cloned from human motor cortex. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5559-5569 (1994).
  37. Aggarwal, S., Mortensen, O. V. In Vitro Assays for the Functional Characterization of the Dopamine Transporter (DAT). Current Protocols in Pharmacology. 79, 12(2017).
  38. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neuroscience Letters. 303 (3), 141-144 (2001).
  39. Moreira, J. D., et al. Dietary omega-3 fatty acids prevent neonatal seizure-induced early alterations in the hippocampal glutamatergic system and memory deficits in adulthood. Nutritional Neuroscience. , 1-12 (2020).
  40. Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics. Current Neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).
  41. Zuo, Z. Isoflurane enhances glutamate uptake via glutamate transporters in rat glial cells. Neuroreport. 12 (5), 1077-1080 (2001).

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