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Summary

Ce protocole décrit comment étudier toutes les combinaisons possibles qui peuvent être obtenues entre quatre médicaments dans une seule expérience. Cette méthode est basée sur l’essai standard de micro dilution sur plaque de 96 puits et sur le calcul des concentrations inhibitrices fractionnaires (FICs) pour évaluer les résultats.

Abstract

Le concept de polythérapie devient très important, principalement avec l’augmentation drastique de la résistance aux médicaments. Le quadruple damier, également appelé q-damier, vise à maximiser le nombre de combinaisons possibles qui peuvent être obtenues entre quatre médicaments dans une expérience pour minimiser le temps et le travail nécessaires pour obtenir les mêmes résultats avec d’autres protocoles. Ce protocole est basé sur la technique simple de micro dilution où les médicaments sont dilués et combinés ensemble dans plusieurs plaques de 96 puits.

Dans la première série de plaques de 96 puits, le bouillon Muller-Hinton est ajouté suivi du premier médicament requis (par exemple, le céfotaxime ici) pour le diluer en série. Une fois la première étape terminée, un autre ensemble de plaques de 96 puits est utilisé pour diluer le deuxième médicament (par exemple, Amikaci), qui sera transféré en enlevant un volume spécifique de médicament 2 et mis dans les puits correspondants dans le premier ensemble de plaques de 96 puits qui contient le médicament un. La troisième étape consiste à ajouter les concentrations requises du troisième médicament (p. ex. lévofloxacine) aux plaques appropriées de l’ensemble initial contenant la combinaison des médicaments 1 et 2. La quatrième étape consiste à ajouter les concentrations requises du quatrième médicament (p. ex. triméthoprime-sulfaméthoxazol) dans les plaques appropriées de la première série. Ensuite, l’inoculum bactérien E. coli ESBL sera préparé et ajouté.

Cette méthode est importante pour évaluer toutes les combinaisons possibles et offre un plus large éventail de possibilités à tester en outre pour les tests in vivo. Bien qu’il s’agisse d’une technique fatigante nécessitant beaucoup de concentration, les résultats sont remarquables et permettent de gagner du temps où de nombreuses combinaisons peuvent être testées dans une seule expérience.

Introduction

Avec l’augmentation de la résistance due à la surutilisation et à la mauvaise utilisation des antibiotiques^1,2, la nécessité de développer de nouveaux médicaments et agents pour traiter les infections bactériennes est devenue cruciale. De nouvelles approches telles que le développement de nouveaux médicaments sont très importantes pour surmonter la crise de résistance. Cependant, l’industrie pharmaceutique n’est pas intéressée par le développement de nouveaux agents antimicrobiens. De plus, si de nouveaux médicaments sont développés, les bactéries continueront d’évoluer et de développer une résistance contre ces nouveaux médicaments^3,4. Ainsi, le problème de la résistance ne sera pas résolu, ce qui rend la nécessité d’une autre approche indispensable qui devrait être considérée et étudiée pour surmonter la résistance bactérienne.

La combinaison de médicaments est un concept très important pour le traitement des infections bactériennes, principalement celles causées par des agents pathogènes multirésistants^5,6. Il diminue le cours du traitement, diminue la dose donnée; ainsi, diminuer la toxicité du médicament donné, aide à diminuer le taux de développement de la résistance et, d’une certaine manière, sensibilise les bactéries aux médicaments donnés comme décrit dans le concept de sensibilité collatérale^5,7,8,9.

Le développement d’une résistance à un médicament nécessite une seule mutation; cependant, le développement d’une résistance à une combinaison de médicaments ciblant plusieurs voies nécessite plusieurs mutations indépendantes qui sont ralenties par cette combinaison. Un exemple de diminution de la résistance lors de l’utilisation de la polythérapie est la diminution du taux de résistance à la rifampicine dans Mycobacterium Tuberculosis¹⁰. Un autre exemple est une étude réalisée par Gribble et al. qui a montré que le taux d’émergence de souches résistantes chez les patients prenant de la pipéracilline seule était plus élevé que chez ceux prenant une combinaison de carboxypénicilline et d’aminoglycoside^10. Des études ont montré que le développement d’une résistance aux aminoglycosides chez les bactéries en évolution rendait ces souches sensibles à divers autres médicaments⁵. La combinaison entre le médicament de classe bêta-lactamine amoxicilline et l’inhibiteur de lactamase acide clavulanique a montré le succès dans le traitement des souches bactériennes résistantes^8.

La diminution du temps de traitement est un bon avantage résultant des combinaisons de médicaments. Par exemple, un traitement de pénicilline ou de ceftriaxone combinée avec de la gentamicine pendant 2 semaines donnera la même efficacité que la pénicilline ou la ceftriaxone seule lorsqu’elle est administrée pendant 4 semaines¹¹. La combinaison de médicaments permet l’utilisation de doses plus faibles de médicaments qui ne sont pas efficaces lorsqu’ils sont administrés seuls, comme les sous-CMI. L’exemple des sulfamides peut être donné lorsque l’utilisation de triples sulfamides minimise, à des doses plus faibles, la toxicité produite qui est la formation de cristaux ou la cristallurie lors de l’utilisation de sulfamides insolubles à pleines doses^12.

Ainsi, la diminution de la dose donnée et du temps de traitement finira par diminuer la toxicité des médicaments sur le corps. L’idée de développer des méthodes pour évaluer l’interaction entre les médicaments combinés est très importante. Dans une étude, les résultats ont montré que la thérapie combinée est plus efficace pour le traitement des espèces résistantes d’Acinetobacter et de P. aeruginosa⁸.

Donner des médicaments en combinaison
Il existe différentes méthodes par lesquelles nous pouvons étudier les combinaisons de médicaments, telles que la méthode en damier, la méthode de la courbe de temps mort et la méthode E-test¹³. La méthode du damier peut étudier toutes les combinaisons possibles entre les deux médicaments en question dans une seule expérience elle-même. En outre, il a été développé pour étudier une combinaison de trois médicaments¹⁴. Maintenant, nous étendons cela pour étudier une combinaison de quatre médicaments principalement pour le traitement des agents pathogènes multirésistants.

Le test de la courbe time-kill est généralement effectué pour tester l’effet bactéricide d’un certain médicament. Il a également été utilisé pour tester l’effet des combinaisons de médicaments où plusieurs médicaments sont combinés à des concentrations spécifiques. Ce protocole nécessite la préparation de plusieurs tubes ou tasses stériles où dans chaque tasse nous ajoutons le bouillon, la combinaison de médicaments et la souche bactérienne requise. Après incubation et enregistrement de la densité optique à plusieurs points de temps, les résultats sont comparés au taux de croissance normal de la souche utilisée pour voir si le taux de croissance a augmenté, diminué ou n’a pas changé¹³.

La méthode de test électronique est habituellement effectuée pour tester la concentration minimale inhibitrice (CMI) où une bandelette contenant une concentration en gradient du médicament en question est posée sur une plaque inoculée. Il a également été utilisé pour tester la combinaison entre deux médicaments où deux bandes sont ajoutées à la plaque de manière perpendiculaire se croisant à leurs CMI^13.

Selon la littérature, il n’y a pas d’étalon-or pour définir et étudier la synergie; ainsi, il est difficile d’évaluer laquelle des méthodes utilisées pour étudier la combinaison est la meilleure et laquelle produit des résultats meilleurs et plus fiables principalement¹³. Cependant, le test Time-kill est laborieux, long et coûteux^15,16,tandis que la méthode E-test est développée pour étudier une combinaison entre deux médicaments seulement. Damier peut étudier toutes les combinaisons possibles entre les deux médicaments testés et c’est pourquoi cette technique a été choisie pour être développée.

Protocol

1. Étapes de préparation Préparer le bouillon Muller-Hinton (MHB) en ajoutant 25 g de bouillon MH à 1 L d’eau distillée et mélanger. Autoclave à 121 °C pendant 2,5 h. Ensuite, rangez le support autoclavé à température ambiante ou au réfrigérateur. Sous-culture des bactéries en question(E. coli ESBL) sur le milieu de la gélose en utilisant la méthode de stries à quatre quadrants et incuber pendant la nuit à 37 °C. À l’aide d’une boucle stérile, prenez une colonie et étalez-la dans la première moitié de la plaque de gélose MacConkey en faisant des stries parallèles étroites. À l’aide de la boucle, étalez les bactéries dans le deuxième quadrant en la striant à partir du premier quadrant. À partir du deuxième quadrant, étendez les stries dans le troisième quadrant à l’aide de stries parallèles étroites. Étalez les bactéries au centre du quatrième quadrant en les striant du troisième quadrant. 2. Préparation du groupe spécial Placez quatre plaques de 96 puits l’une à côté de l’autre pour former un carré. À l’aide d’une bande, collez leur fond ensemble. Répétez cette étape pour obtenir quatre panneaux contenant chacun 4 plaques et nommez-les A1, A2, A3 et A4. Ajouter 50 μL de bouillon MH aux puits entre la colonne 2 et la colonne 11 dans les 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux. Ajouter 200 μL de bouillon MH au puits H12 servant de puits témoin négatif dans les 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux. Ajouter 150 μL de bouillon MH aux puits A1 et H1 servant de puits témoins positifs dans les 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux. 3. Médicament 1, Céfotaxime, dilution en série Dans un tube conique, ajouter 15 mL de dH2O stérile. Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 15 mL) /C1.REMARQUE: Dans notre cas, la solution mère de céfotaxime est de 105 μg / mL et C2 est de 256 μg / mL; ainsi,V1 = 38,4 μL. Retirez le volume calculé des 15 mL de dH2O stérile, puis ajoutez le médicament. Pipetter 50 μL de la solution médicamenteuse préparée dans chaque puits des colonnes 11 et 12 sauf H12. Commencer la dilution en série en enlevant 50 μL de la colonne 11 et en la plaçant dans les puits correspondants de la colonne 10, puis de 10 jusqu’à atteindre la colonne 2 où les 50 μL prélevés dans la colonne 2 seront éliminés. Répétez les étapes 3.4 et 3.5 pour l’ensemble des 16 plaques de 96 puits des quatre panneaux. 4. Médicament 2, Amkacine, dilution en série Dans un tube conique, ajouter 10 mL de dH2O stérile. Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 10 mL) /C1.REMARQUE : Dans notre cas, la solution mère d’amikacine est de 103 μg/mL etC2 est de 64 μg/mL; ainsi,V1 = 64 μL. Retirez le volume calculé des 10 mL de dH2O stérile, puis ajoutez le médicament. Prenez huit plaques distinctes de 96 puits. À chaque plaque, ajouter 100 μL de MHB aux puits entre les rangées G et B. Ajouter 100 μL de la solution de médicament 2 préalablement préparée dans les puits de la rangée G. Diluer en série de la rangée G à la rangée B en prenant 100 μL de chaque puits et finalement jeter les 100 μL des puits de la rangée B. Répétez les étapes 4.5, 4.6 et 4.7 pour préparer huit assiettes. 5. Transfert de la drogue 2 aux quatre panels Pipetter 50 μL de médicament 2 des puits entre les rangées G et B dans les puits correspondants dans chaque plaque des quatre panneaux. Une plaque préparée de 96 puits contient 100 μL de médicament 2, ce qui est suffisant pour deux plaques dans un panneau. 6. Médicament 3, Lévofloxacine, addition À quatre tubes coniques différents, ajouter 14 mL de dH2O stérile. Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 14 mL) /C1.REMARQUE: Dans notre cas, la lévofloxacine est préparée en quatre concentrations différentes à partir d’une solution mère de 5 x 103 μg /mL.C1 = 2 μg/mL, V1 = 5,6 μLC2 = 4 μg/mL, V1 = 11,2 μLC3 = 8 μg/mL, V1 = 22,4 μLC4 = 16 μg/mL, V1 = 44,8 μL Retirez le volume calculé des 14 mL de dH2O stériles de chaque tube, puis ajoutez le médicament. Après avoir préparé les concentrations requises du troisième médicament, prendre 50 μL et l’ajouter aux puits correspondants entre les rangées B et G et les colonnes 2 et 12 dans la plaque correspondante dans chaque panneau où C1 correspond aux quatre plaques P1 dans les quatre panneaux, C2 correspond aux quatre plaques P2 dans les quatre panneaux , C3 correspond aux quatre plaques P3 dans les quatre panneaux, et C4 correspond aux quatre plaques P4 dans les quatre panneaux. 7. Médicament 4, Triméthoprime-sulfaméthoxazole, addition A un tube conique, ajouter 14 mL de dH2O stérile. Calculer le volume à retirer de la solution mère du médicament suivant la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 14 mL) /C1.NOTA : Dans notre cas, le triméthoprime-sulfaméthoxazole est préparé à quatre concentrations différentes à partir d’une solution mère de 48 x 103 μg/mL.C1 = 512 μg/mL, V1 = 149,33 μLC2 = 1024 μg/mL, V1 = 298,66 μLC3 = 2048 μg/mL, V1 = 597,33 μLC4 = 4096 μg/mL, V1 = 1 194,66 μL Retirez le volume calculé des 14 mL de dH2O stériles de chaque tube, puis ajoutez le médicament. Après avoir préparé les concentrations requises du quatrième médicament, prendre 50 μL et l’ajouter aux puits correspondants entre les rangées B et G et les colonnes 2 et 12 dans les quatre plaques du panneau correspondant où C1 correspond au panneau 1, C2 correspond au panneau 2, C3 correspond au panneau 3, et C4 correspond au panneau 4. 8. Préparation et ajout de l’inoculum bactérien E. coli ESBL À l’aide d’une boucle stérile, transférer une colonie de l’isolat bactérien E. coli ESBL précédemment cultivé sur une plaque dans 2 mL de MHB et de vortex stériles. Vérifiez la turbidité où il devrait être de 0,5 McFarland à l’aide d’un densitomètre. Ajouter 80 mL de bouillon MH stérile à une tasse d’urine stérile. Ajouter l’inoculum bactérien de l’inoculum 0,5 McFarland à la tasse d’urine suivantC1V1 =C2V2, oùV1 = (106 x 80 mL) / 108 = 800 μL. Pipetter 50 μL de la solution d’inoculum 106 UFC/mL dans chaque puits sauf H12, qui est le puits témoin de stérilité. Incuber les panneaux à 37 °C pendant la nuit. Après incubation, ajouter 50 μL d’iodotétrazolium pour enregistrer la croissance dans les puits. 9. Protocole pour le modèle FIC (dossier supplémentaire) Écrivez la concentration la plus élevée de médicament 1 (céfotaxime) dans la cellule jaune du panneau A. Écrivez la concentration la plus élevée de médicament 2 (Amikacine) dans la cellule jaune du panneau B. Écrivez la concentration la plus élevée de médicament 3 (Lévofloxacine) dans la cellule jaune du panneau C. Inscrire la concentration la plus élevée de médicament 4 (triméthoprime-sulfaméthoxazole) dans le panneau D. Tracez la ligne rouge (interface Croissance/pas de croissance) en mettant en évidence les puits ayant une croissance en rouge. Écrivez le MIC du médicament 1 dans le tableau du médicament 1 (ATB1). Écrivez le MIC du médicament 2 dans le tableau du médicament 2 (ATB2). Écrivez le MIC du médicament 3 dans le tableau du médicament 3 (ATB3). Écrivez le MIC de la drogue 4 dans le tableau de la drogue 4 (ATB4). Pour calculer FIC pour ATB1 Déterminez les puits sur l’interface Croissance/Pas de croissance. Dans le tableau ATB1, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau A vers le premier puits sélectionné. Répétez l’étape 9.10.2 pour chaque puits sélectionné où le puits 1 correspond à FIC1, le puits 2 correspond à FIC2, et ainsi de suite. Pour calculer le FIC pour ATB2 Dans le tableau ATB2, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau B vers le premier puits présélectionn. Répétez l’étape 9.11.1 pour chaque puits présélectionn. Pour calculer le FIC pour ATB3 Dans le tableau ATB3, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau C vers le premier puits présélectionn. Répétez l’étape 9.12.1 pour chaque puits présélectioné. Pour calculer le FIC pour ATB4 Dans le tableau ATB4, double-cliquez sur la cellule à côté de FIC1 et faites glisser la cellule jaune à gauche du panneau D vers le premier puits présélectionn. Répétez l’étape 9.13.1 pour chaque puits présélectionn. Dans le tableau intitulé ATB1+2+3+4, additionnez automatiquement le FIC1 de chaque ATB. Il en ira de même pour les autres FIC (FIC2, FIC3, etc.). Dans la cellule contenant FIC et surlignée en jaune, double-cliquez dessus et sélectionnez les ΣFICs additionnés dans le tableau ATB1+2+3+4. Répétez ces étapes pour chacune des neuf feuilles représentant les neuf plaques.REMARQUE: Dans la feuille FIC all, le tableau montrera le FIC final additionné avec l’interprétation de la valeur obtenue. 10. Détermination de la CMI à l’aide du test de microdilution pour les quatre médicaments Étiquetez quatre rangées différentes avec l’abréviation de chaque médicament testé. Par exemple, CTX pour le céfotaxime, AMK pour l’amikacine, LEVO pour la lévofloxacine et SXT pour le triméthoprime-sulfaméthoxazole. Pipetter 200 μL de bouillon Muller Hinton stérile dans le puits numéro 1 et le puits numéro 12 dans chaque rangée utilisée. Le puits numéro 12 servira de puits de contrôle négatif. Pipette 100 μL de bouillon Muller Hinton stérile vers les puits 2 à 11 dans chaque rangée utilisée. Calculer le volume de chaque médicament à ajouter à l’aide de la formuleC1V1=C2V2. Ainsi,V1 =(C2 x 4 xV2)/C1. V2 est le volume final dans les puits qui est de 200 μL,C1 est la concentration de la solution mère, etC2 est la concentration initiale que nous devons avoir dans le premier puits.REMARQUE: Ici, nous utilisons ce qui suit:Céfotaxime :C1 = 105 μg/mL, où l’on dilue à 104 μg/mL,C2 = 256 μg/mL ; ainsi, V1 = 20,48 μLAmikacine : C1 = 103 μg/mL,C2 = 64 μg/mL; ainsi, V1 = 51,2 μLLévofloxacine :C1 = 5 x 103 μg/mL, où l’on dilue à 5 x 102 μg/mL,C2 = 16 μg/mL ; ainsi, V1 = 25,6 μLTriméthoprime-sulfaméthoxazole : C1 = 48 x 103 μg/mL,C2 = 4096 μg/mL; ainsi, V1 = 68,26 μL Pipetter le volume requis pour chaque médicament dans le premier puits de la rangée correspondante après avoir retiré le même volume du bouillon de 200 μL pour obtenir un volume total de 200 μL après l’ajout du médicament. Diluer en série en enlevant 100 μL du puits 1 au puits 2 et ainsi de suite jusqu’à atteindre le puits 10 où les 100 μL retirés du puits 10 seront jetés. Notez que le puits 11 sert de puits de contrôle positif. Pipette 100 μL de 106 inoculum bactérien préparé dans chaque puits de chaque rangée utilisée, à l’exception du puits numéro 12 servant de témoin négatif. Incuber à 37 °C pendant la nuit.

Representative Results

La figure 2A représente les résultats obtenus en combinant le céfotaxime et l’amikacine avec des concentrations spécifiques de lévofloxacine et de triméthoprime-sulfaméthoxazole. Nous pouvons voir dans la partie gauche de la figure les quatre plaques qui sont schématiquement présentées avec les concentrations des médicaments dans la partie droite de la figure. Les flèches représentent les puits de l’interface Croissance/pas de croissance. Les puits colorés sont les puits qu…

Discussion

La méthode quadruple damier ressemble au damier et au damier tridimensionnel dans son protocole. Cependant, certaines étapes cruciales doivent être prises en considération pour éviter les erreurs au cours de l’expérience.

Assurez-vous de tester le MIC de chaque médicament contre l’isolat testé avant de commencer le protocole pour savoir quelles sont les concentrations qui sont nécessaires pour commencer les dilutions avec pour le médicament 1 et le médicament 2 qui doivent être…

Materials

1000 µL tips	Citotest	4330000402
200 µL tips	Citotest	4330-0013-17
50 mL centrifuge tube	corning	430828	For drug 3 and 4 preparation
5 mL polysterene round-bottom Tube	Falcon	352058	For 0.5 MacFarland bacterial inoculum preparation
90mm petri dishes	JRZ Plastilab		As bed for the solutions to be added using the multichannel pipette
96-well plates	corning	3596	For serial diltuion and combining drugs
Bactrim 200, 40 mg (Trimethoprim-sulamethoxazole	By CRNEXI SAS Fontenay-sous-Bois, France	10177403	Drug 4
Ceforane, 1 g (Cefotaxime)	PHARCO Pharmaceuticals	24750/2006	Drug 1
Densitometer
E. Coli ESBL strain	Retreived as a medical strain from the Saint-George Hospital Lebanon		Bacterial strain
Mac Conkey + crystal violet agar	BIO-RAD	64169508	For making agar plates used for subculturing
Miacin 500 mg/2 mL (Amikacin)	HIKMA Pharmaceuticals	2BXMIA56N-AEF	Drug 2
Muller-Hinton Broth	BIO-RAD	69444	For making bacterial media
Multichannel Pipette	Thermo Scientific	GJ54761	For serial dilution and addition of media, bacteria and drugs
Paper Tape
Single Channel pipettes	Thermo Scientific	OH19855 HH40868	For the addition of media, bacteria and drugs
Tavanic, 500 mg (Levofloxacin)	sanofi aventis	221937/2009	Drug 3