Article de méthode

Une approche microfluidique pour l’étude fonctionnelle des oscillations de signalisation régissant la somitogenèse

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DOI :

10.3791/62318

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19 mars 2021

 ,  , 
1Hubrecht Institute-KNAW (Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences) and University Medical Center Utrecht

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Un protocole pour la culture et la manipulation de tissu embryonnaire de souris sur une puce microfluidique est fourni. En appliquant des impulsions de modulateurs de voie, ce système peut être utilisé pour contrôler de l’extérieur les oscillations de signalisation pour l’étude fonctionnelle de la somitogenèse de la souris.

Résumé

La segmentation périodique du mésoderme présomitique d’un embryon de souris en développement est contrôlée par un réseau de voies de signalisation. On pense que les oscillations et les gradients de signalisation contrôlent respectivement le moment et l’espacement de la formation des segments. Bien que les voies de signalisation impliquées aient été largement étudiées au cours des dernières décennies, les preuves directes de la fonction des oscillations de signalisation dans le contrôle de la somitogenèse ont fait défaut. Pour permettre l’étude fonctionnelle de la dynamique de signalisation, la microfluidique est un outil préalablement établi pour la modulation subtile de ces dynamiques. Avec cette approche d’entraînement basée sur la microfluidique, les oscillations de signalisation endogène sont synchronisées par des impulsions de modulateurs de voie. Cela permet de moduler, par exemple, la période d’oscillation ou la relation de phase entre deux voies oscillantes. En outre, des gradients spatiaux de modulateurs de voies peuvent être établis le long du tissu pour étudier comment des changements spécifiques dans les gradients de signalisation affectent la somitogenèse.

Le présent protocole vise à aider à établir des approches microfluidiques pour les nouveaux utilisateurs de la microfluidique. Les principes de base et l’équipement nécessaires à la mise en place d’un système microfluidique sont décrits, et une conception de puce est fournie, avec laquelle un moule pour la génération de puces peut être facilement préparé à l’aide d’une imprimante 3D. Enfin, comment cultiver du tissu primaire de souris sur une puce microfluidique et comment entraîner des oscillations de signalisation à des impulsions externes de modulateurs de voie sont discutés.

Ce système microfluidique peut également être adapté pour abriter d’autres systèmes modèles in vivo et in vitro tels que les gastruloïdes et les organoïdes pour l’étude fonctionnelle de la dynamique de signalisation et des gradients morphogènes dans d’autres contextes.

Introduction

Le développement est contrôlé par la communication intercellulaire via des voies de signalisation. Il n’y a qu’un nombre limité de voies de signalisation qui orchestrent la formation complexe des tissus et la différenciation cellulaire appropriée dans l’espace et le temps. Pour réguler cette multitude de processus, l’information peut être codée dans la dynamique d’une voie de signalisation, le changement d’une voie au fil du temps, comme la fréquence ou la durée d’un signal1,2.

Au cours de la somitogenèse, le tissu somitique est périodiquement segmenté du mésoderme présomitique (MSP)3. Le MSP est organisé spatialement par gradients de Wnt, de facteur de croissance des fibroblastes (FGF) et de signalisation de l’acide rétinoïque. Dans le PSM antérieur au front de détermination, où les signaux Wnt et FGF sont faibles, les cellules sont préparées pour la différenciation en somites. La différenciation se produit lorsqu’une onde d’activation transcriptionnelle atteint ce front de détermination. Dans le PSM, la signalisation Wnt, FGF et Notch oscille. Les cellules voisines oscillent légèrement déphasées, ce qui entraîne des vagues d’activation transcriptionnelle oscillatoire en aval des voies Wnt, FGF et Notch voyageant du PSM postérieur au PSM antérieur. Chez les embryons de souris, une onde transcriptionnelle atteint le front de détermination environ toutes les 2 heures et initie la formation de somite. L’étude de la somitogenèse en perturbant ou en activant les voies de signalisation peut illustrer l’importance de ces voies4,5,6,7,8,9. Cependant, pour pouvoir étudier la fonction de la dynamique de signalisation dans le contrôle du comportement cellulaire, il est essentiel de moduler subtilement les voies de signalisation au lieu de les activer ou de les inhiber de manière permanente.

Pour moduler temporellement l’activité de la voie de signalisation dans l’embryon de souris segmentant, Sonnen et al. ont développé un système microfluidique10. Ce système permet un contrôle strict des écoulements de fluides dans les microcanaux d’une puce contenant l’échantillon biologique11. Pour étudier l’importance de la dynamique de signalisation pour une segmentation correcte des MSP, cette configuration microfluidique est utilisée pour moduler la dynamique de signalisation de l’horloge de segmentation de la souris ex vivo. En pulsant séquentiellement des activateurs ou des inhibiteurs de voie dans la chambre de culture, le contrôle externe de la dynamique de la signalisation Wnt, FGF et Notch est obtenu10. Par exemple, il est possible de modifier la période des voies individuelles et la relation de phase entre plusieurs voies de signalisation oscillatoire. En utilisant l’imagerie concomitante en temps réel des rapporteurs de signalisation dynamique, l’effet de l’entraînement sur les voies elles-mêmes, sur la différenciation et la formation de somite peut être analysé. En utilisant ce niveau de contrôle sur la dynamique de signalisation, l’importance de la relation de phase entre les voies de signalisation Wnt et Notch au cours de la somitogenèse a été soulignée10.

Les conceptions de puces personnalisées permettent une pléthore d’options pour les perturbations spatio-temporelles dans l’environnement local, par exemple, la formation de gradient stable12,13,14,15, l’activation/inhibition pulsatile10,16,17,18 ou des perturbations localisées19,20 . La microfluidique peut également permettre une lecture plus reproductible et un débit plus élevé grâce à l’automatisation de la manipulation expérimentale21,22,23. Le présent protocole est destiné à apporter la microfluidique et l’entraînement des oscillations de signalisation endogène dans les tissus à chaque laboratoire standard des sciences de la vie. Même en l’absence d’équipements sophistiqués pour la génération de puces, tels que des salles blanches et des équipements pour la lithographie douce, les puces microfluidiques peuvent être fabriquées et utilisées pour répondre à des questions biologiques. Les moules peuvent être conçus à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO) disponible gratuitement. Un moule pour la génération de puces microfluidiques, généralement constitué de polydiméthylsiloxane (PDMS), peut être imprimé avec une imprimante 3D ou commandé auprès d’imprimeries. De cette façon, les puces microfluidiques peuvent être produites en une journée sans avoir besoin d’un équipement coûteux24. Ici, une conception de puce est fournie, avec laquelle un moule pour l’entraînement de l’horloge de segmentation de la souris dans des cultures ex vivo bidimensionnelles (2D)25 peut être imprimé avec une imprimante 3D.

Les cultures sur puce et les perturbations précises, rendues possibles par la microfluidique, recèlent un potentiel exceptionnel pour démêler les mécanismes moléculaires de la façon dont les voies de signalisation contrôlent le comportement multicellulaire. La dynamique de signalisation et les gradients morphogènes sont nécessaires pour de nombreux processus en développement. Auparavant, les laboratoires avaient cultivé des cellules, des tissus et des organismes entiers dans des puces microfluidiques et des protocoles pour la perturbation spatio-temporelle de la culture cellulaire principalement 2D sont fournis ailleurs12,26,27,28,29. L’application de la microfluidique pour moduler les environnements locaux dans les systèmes multicellulaires ouvre de nouvelles perspectives pour les perturbations spatio-temporelles précises et à haut débit. Le domaine de la microfluidique a maintenant atteint un point tel qu’il est devenu un outil non spécialisé, peu coûteux et facilement applicable pour les biologistes du développement.

Ici, un protocole pour l’entraînement de l’horloge de segmentation de la souris aux impulsions d’un inhibiteur de signalisation Notch est fourni. Une telle expérience comprend les étapes suivantes: (1) génération de puce microfluidique, (2) préparation du tube et du revêtement de la puce, et (3) l’expérience microfluidique elle-même (Figure 1A). La recherche impliquant des systèmes modèles de vertébrés nécessite l’approbation éthique préalable du comité compétent.

Protocole

La recherche présentée ici a été approuvée par le comité d’éthique de l’EMBL10 et le comité néerlandais pour la recherche animale (dierenexperimentencommissie, DEC), et suit les directives de Hubrecht pour les soins aux animaux.

Portez des gants lorsque vous travaillez avec du PDMS liquide. Couvrir les surfaces et l’équipement. Éliminez immédiatement tout déversement, car le nettoyage devient difficile une fois qu’il est durci.

1. Génération de la puce

REMARQUE: Les puces microfluidiques sont générées par coulée de PDMS (polydiméthylsiloxane) dans un moule. Les moules peuvent être conçus à l’aide d’un logiciel de CAO (par exemple, uFlow ou 3DμF30). Un référentiel de conceptions gratuites est fourni par le MIT (Metafluidics.org). Les moules sont soit imprimés avec une imprimante 3D, soit peuvent être générés par lithographie douce à l’aide d’un photomasque contenant le design souhaité (pour plus d’informations, voir, par exemple, Qin et al., 201031). Ici, un dessin pour un moule est fourni qui peut être imprimé avec une imprimante 3D pour la culture sur puce de tissu embryonnaire de souris (Figure 1B, C, Fichiers supplémentaires 1 et 2). Pour permettre l’impression avec des imprimantes 3D de résolution inférieure, la conception a été modifiée par rapport à celle publiée précédemment10. Un moule sans pièges à bulles d’air et un autre avec des pièges à bulles d’air sont fournis (fichiers supplémentaires 1 et 2, respectivement). Comme la procédure d’impression dépend de l’imprimante disponible, les détails de l’impression ne seront pas décrits. Cependant, il faut s’assurer que toute la résine non polymérisée est entièrement éliminée. Il est souvent nécessaire d’effectuer un lavage supplémentaire avec des solvants pour éliminer la résine non polymérisée des petits trous de <200 μm dans la chambre microfluidique. Ces trous formeront des piliers PDMS pour piéger le tissu embryonnaire dans la puce pendant l’expérience. Le PDMS est généralement utilisé pour la microfluidique, car il est bon marché, biocompatible et transparent, et a une faible autofluorescence. Après durcissement, la puce PDMS est découpée dans le moule et collée sur une lame de verre. Le traitement au plasma du verre et de la puce PDMS active les surfaces et permet la formation de liaisons covalentes, lorsqu’elles sont mises en contact.

  1. Préparer la quantité requise de PDMS en mélangeant le monomère avec le catalyseur dans un rapport de 9:1 (w:w) pour induire la polymérisation. Utilisez des outils jetables pour mélanger, tels que des gobelets et des fourchettes en plastique. Assurez-vous que le mélange est correctement réalisé.
  2. Placez le mélange PDMS dans un dessiccateur et appliquez le vide pendant environ 30 minutes pour éliminer l’air du mélange PDMS. En raison du vide dans le dessiccateur, l’air sera retiré du mélange PDMS.
    REMARQUE: Couvrez l’intérieur du dessiccateur avec des tissus au cas où le PDMS coulerait.
  3. Versez le mélange PDMS dans le moule à copeaux (une couche PDMS d’environ 3 à 5 mm suffit).
  4. Replacez le moule rempli de PDMS dans le dessiccateur et appliquez le vide pour éliminer les bulles restantes. Assurez-vous que l’air est retiré de toutes les petites structures du moule.
  5. Durcissez le moule en le plaçant dans un four à 65 °C (ou moins selon le matériau du moule) pendant la nuit. Coupez la puce hors du moule à l’aide d’un scalpel. Coupez le PDMS durci hors du moule avec suffisamment d’espace (1-2 cm) autour de la conception pour permettre un collage ultérieur. Assurez-vous de couper complètement le PDMS pour éviter de casser la puce lorsque vous la retirez. Soulevez soigneusement la puce PDMS, d’abord avec l’extrémité émoussée du scalpel et, si possible, avec les mains.
  6. Percez les trous d’entrée et de sortie, en commençant par l’intérieur de la chambre microfluidique à l’aide d’un poinçon de biopsie de 1 mm.
  7. Nettoyez brièvement la puce PDMS avec de l’air comprimé et collez du ruban adhésif des deux côtés pour enlever les morceaux de PDMS et la poussière coincés et le garder propre jusqu’à une utilisation ultérieure.
    REMARQUE: La puce peut être conservée comme ceci jusqu’à une utilisation ultérieure.
  8. Nettoyez la glissière de verre avec de l’air comprimé. Faites attention à ce qu’il ne se casse pas. Retirez le ruban adhésif de la puce PDMS.
  9. Collez la puce à la lame de verre à l’aide d’un four à plasma. Les instructions suivantes sont optimisées pour le plasma d’air.
    REMARQUE: Consultez le manuel du four à plasma du laboratoire et optimisez la procédure pour l’expérience spécifique.
    1. Placez la puce et le verre glissés dans le four à plasma avec les côtés à coller vers le haut.
    2. Placez le couvercle sur le four à plasma et maintenez-le en place pendant l’application du vide et attendez que le vide se soit établi.
    3. Allumez le gaz en appuyant sur le bouton Gaz et attendez environ 1 min (la pression doit être d’environ 0,37 mbar).
    4. Générez du plasma en appuyant sur Générateur (Puissance: 9.0, Temps: 1 min).
    5. Lorsque vous avez terminé, éteignez la pompe et l’essence; aérez et ouvrez la porte.
    6. Collez la puce au verre en plaçant les surfaces activées les unes sur les autres et en appliquant une pression uniformément. Attention à ce que le verre ne se casse pas.
      REMARQUE: Un test d’eau peut être effectué pour confirmer que le traitement au plasma a fonctionné. Placez une goutte d’eau sur la surface du verre. Si le traitement au plasma a fonctionné, l’eau doit s’étaler immédiatement au lieu de former une gouttelette.
  10. Placer la puce collée dans un four à 65 °C pendant 5 min.
  11. Scellez le côté exposé de la puce avec du ruban adhésif pour empêcher la poussière de pénétrer dans les entrées.
    REMARQUE: La puce peut être conservée jusqu’à utilisation. Les ouvertures doivent être fermées avec du ruban adhésif jusque-là.

2. Préparation de l’expérience de microfluidique

REMARQUE: Les étapes préparatoires suivantes sont nécessaires pour effectuer l’expérience de microfluidique: Tout d’abord, lors de l’exécution de l’expérience de microfluidique, un écoulement de fluide est créé des entrées vers les sorties. Tous les trous dans la puce fonctionneront comme des sorties en raison de l’accumulation de pression des entrées. Par conséquent, tous les trous qui ne sont pas utilisés doivent être fermés; par exemple, les trous qui sont utilisés pour charger le tissu sur la puce. Si ceux-ci ne sont pas fermés, le tissu peut s’écouler avec le liquide. Pour fermer ces trous, des tubes remplis de PDMS sont utilisés. Les tubes remplis de PDMS peuvent être conservés indéfiniment et, par conséquent, n’auront pas besoin d’être préparés séparément pour chaque expérience de microfluidique, mais peuvent être fabriqués en lots plus importants. Deuxièmement, avant le début de l’expérience microfluidique, les tubes, les tubes remplis de PDMS et la puce nécessaire à l’expérience sont préparés et stérilisés aux UV. Enfin, la puce doit être recouverte de fibronectine, afin que le tissu embryonnaire puisse se fixer au verre25.

  1. Fabrication de tubes remplis de PDMS.
    1. Prendre ±1 m de tube. Plus de tubes peuvent être remplis avec PDMS en prenant plusieurs morceaux de tubes.
    2. Préparer la quantité requise de PDMS en mélangeant le monomère avec le catalyseur dans un rapport de 9:1 (w:w) pour induire la polymérisation.
      REMARQUE: Utilisez des outils jetables pour mélanger, tels que des gobelets et des fourchettes en plastique. Mélanger correctement.
    3. Placez le mélange PDMS dans un dessiccateur et appliquez le vide pendant environ 30 minutes pour éliminer l’air du mélange PDMS.
      REMARQUE: Couvrez l’intérieur du dessiccateur avec des tissus au cas où le PDMS coulerait.
    4. Remplissez une seringue de 3 mL avec PDMS. Remplissez soigneusement pour éviter la formation de bulles d’air dans le mélange.
    5. Utilisez une pince pour insérer la pointe d’une aiguille de 22 G dans le tube.
      REMARQUE: Veillez à ne pas percer le tube ou vos doigts avec l’aiguille.
    6. Fixez le tube à la seringue remplie de PDMS via l’aiguille. Utilisez la pompe à seringue pour remplir le tube, avec un débit d’environ 500 μL/h. Veillez à ne pas appliquer une pression trop élevée pour éviter la rupture de la pompe.
    7. Une fois que le tube est entièrement rempli de PDMS, placez-le dans un plat de 15 cm et durcissez à température ambiante (au moins pendant la nuit).
  2. Préparez le tube et la puce pour l’expérience.
    REMARQUE: Les tubes suivants sont nécessaires pour l’expérience: premièrement, environ 50 cm de tubes par sortie et deuxièmement, environ 2-3 m par entrée (la taille exacte dépend de l’organisation spatiale des pompes, de l’incubateur ou du microscope utilisés ultérieurement). Le tube d’entrée doit être long pour permettre au milieu de culture de s’équilibrer avec le CO2 pour la culture d’embryons pendant l’expérience.
    1. Couper le tube à un angle de 45° de sorte que des extrémités pointues soient créées; cela facilitera l’insertion du tube dans les trous de la puce. Fixez une aiguille à chacun des tubes d’entrée. Voir l’étape 2.1.5.
    2. Coupez les tubes remplis de PDMS dans des bouchons de ±1 cm. Couper à un angle de 45° de sorte que des extrémités pointues soient créées; cela facilitera l’insertion du tube dans les trous de la puce. Suffisamment de bouchons sont nécessaires pour remplir chaque trou qui n’est attaché à aucun tuyau.
    3. Retirez le ruban adhésif de la puce.
    4. Placez tous les tubes avec des aiguilles attachées, la puce et les bouchons dans un plat et stérilisez en exposant à la lumière UV pendant ±15 min. Toute hotte de culture cellulaire avec la possibilité de stérilisation UV peut être utilisée.
  3. Revêtement de puce avec de la fibronectine.
    REMARQUE: Pour la culture de cultures 2D ex vivo de MSP postérieurs, enduisez la puce de fibronectine.
    1. Placer la puce dans un bécher contenant du PBS + 1% de pénicilline/streptomycine à température ambiante. Assurez-vous que la puce est complètement recouverte de PBS. Rincez la puce avec du PBS pour éliminer l’air avec une pipette P200.
      REMARQUE: Toute manipulation ultérieure de la puce sera effectuée dans ce bécher jusqu’au début de l’expérience pour empêcher l’entrée d’air dans la puce. Veillez à ne pas casser la lame de verre de la puce.
    2. Préparer 2 mL de fibronectine 1:20 dans le PBS et remplir dans un bécher.
    3. Chargez une seringue de 3 mL pour chaque chambre de la puce. Avec une pince, insérez une aiguille de 22 G dans le tube de sortie. Fixez l’aiguille à la seringue contenant de la fibronectine.
    4. Connectez la seringue à la pompe à seringue. Rincez le tube jusqu’à ce qu’il n’y ait plus d’air dans le tube.
    5. Fixez le tuyau de sortie à la sortie de la puce. Assurez-vous de pousser le tube jusqu’au fond. Réglez un faible débit pour recouvrir la puce. Toutes les autres ouvertures peuvent rester ouvertes. Laissez la pompe à seringue fonctionner pendant au moins 2 h, peut également fonctionner pendant la nuit.
    6. Arrêtez la pompe. Coupez le tube juste après l’aiguille. Le tube restant servira de sortie pendant l’expérience plus tard.

3. Expérience de microfluidique

REMARQUE: Ici, un protocole pour l’entraînement de l’horloge de segmentation de la souris dans des cultures 2D ex vivo en appliquant des impulsions de l’inhibiteur de signalisation Notch DAPT est présenté. L’application d’impulsions d’une durée de 130 min, proche de la période naturelle de l’horloge de segmentation de la souris (137 min25), permet un entraînement efficace. Des impulsions de 100 min de milieu et de 30 min de 2 μM de DAPT sont appliquées (Figure 2A). La présence de médicament dans la puce est surveillée à l’aide d’un colorant fluorescent. Les spectres d’excitation et d’émission de ce colorant et du rapporteur de signalisation fluorescente doivent être suffisamment différents pour éviter les saignements lors de l’imagerie en temps réel par fluorescence. Lorsque des protéines fluorescentes jaunes sont utilisées comme rapporteur de signalisation, telles que le rapporteur de signalisation Notch LuVeLu5 (Lunatic fringe-Venus-Lunatic fringe), le colorant, Cascade Blue, peut être appliqué. Pour identifier d’autres combinaisons possibles de colorant fluorescent et de rapporteur, une visionneuse de spectres disponible gratuitement peut être utilisée. L’effet de l’entraînement peut être détecté par l’imagerie en temps réel des rapporteurs de signalisation dynamique5,10,32. Chaque puce a deux chambres d’incubation. Cela permet la comparaison directe des légumineuses médicamenteuses (DAPT) pour contrôler les impulsions (DMSO).

  1. Faire moyen et dégazer.
    1. Le jour de l’expérience, préparer 50 mL de milieu de culture (DMEM-F12 complété par 0,5 mM de glucose, 2 mM de glutamine et 1% de BSA, pour plus d’informations sur la culture du bourgeon de queue de souris voir25).
    2. Préparez des seringues remplies du milieu pour l’expérience. Préparer le milieu de culture dans les béchers : Pour entraîner les oscillations de signalisation Notch, préparer 6 mL de milieu avec 1,2 μL de DMSO + 10 μM Cascade Blue ; 6 mL de milieu de culture avec 2 μM DAPT + 10 μM Cascade Blue; deux tubes de 6 mL de milieu chacun. Utilisez au moins 6 mL de milieu par seringue. Chargez les seringues avec le support. Assurez-vous d’étiqueter les seringues contenant du médicament et du DMSO.
    3. Dégazez la puce dans le PBS et les seringues contenant le milieu dans un dessiccateur. Placez les seringues dans un bécher avec la pointe tournée vers le haut, de sorte que l’air puisse s’échapper par le haut. Il peut arriver que la puce flotte et soit encore remplie de bulles. Ceux-ci seront supprimés par la suite.
    4. Essayez de rincer / aspirer la plupart des bulles d’air de la puce à l’aide d’une pipette P200. S’il reste de l’air, il sera éliminé lors de l’expérience suivante.
    5. Installez des seringues dans les pompes et fixez des tubes d’entrée aux seringues. Pour entraîner la signalisation Notch, utilisez deux pompes à seringues, l’une transportant les seringues moyennes, l’autre transportant les seringues de médicament / DMSO. Laissez-le fonctionner à un débit plus élevé (0,5 mL / h) jusqu’au début de l’expérience pour éliminer les bulles d’air du tube. Veillez à régler correctement les détails de la seringue (diamètre) dans la pompe.
  2. Chargement de tissu sur la puce.
    1. Disséquer le tissu embryonnaire de souris. Disséquez le bout le plus postérieur de la queue (queue). Placer le tissu disséqué dans un milieu de culture + 25 μM HEPES.
    2. Rincez la puce avec un milieu de culture + 25 μM HEPES à l’aide d’un P200 pour éliminer le PBS.
    3. Chargez le tissu dans la puce à l’aide d’une pipette P200 (Figure 1C). Assurez-vous de ne pas introduire de bulles d’air dans la puce.
      REMARQUE: Un chargement efficace nécessite un peu de pratique. Si le tissu n’est pas orienté correctement, il peut être possible de le retourner en aspirant soigneusement et en rinçant à nouveau. Cependant, cela entraîne souvent une mort cellulaire rapide.
    4. Après chaque étape de chargement des tissus, fermez l’entrée de chargement des tissus correspondante à l’aide d’un morceau de tube rempli de PDMS. Assurez-vous que les bouchons sont suffisamment poussés vers le bas de la puce à l’aide d’une pince à épiler émoussée.
    5. Une fois que tous les échantillons ont été chargés, fermez toutes les entrées/sorties inutilisées avec des morceaux de tubes remplis de PDMS à l’aide de pinces contondantes.
  3. Assemblage de la configuration microfluidique.
    1. Abaissez le débit des pompes microfluidiques. 60-100 μL / h fonctionne bien pour les bourgeons de queue d’embryon de souris. À des débits plus élevés, la mort cellulaire a été observée – probablement en raison d’un cisaillement cellulaire trop élevé. Le débit cumulé de plusieurs pompes ne doit pas dépasser ces 60-100 μL/h par chambre microfluidique à un moment donné.
    2. Fixez le tube à la puce microfluidique. Faites-le sans obtenir de bulles d’air à l’intérieur de la puce (cela peut être réalisé en s’assurant qu’il y a une goutte de milieu présente à l’extrémité du tube). Des sorties sont toujours présentes à partir du revêtement de fibronectine (voir 2.3).
    3. Une fois que tous les tubes sont attachés à la puce, sortez-les du bécher, séchez-les correctement, placez-les dans un plat et assemblez-les avec environ 1,5 m de tubes d’entrée dans un incubateur (37 °C, 20 % o2, 5 % de CO2) pour une culture de nuit. Le tube est perméable au gaz; cela permettra l’équilibrage de l’O2 et du CO2 dans le milieu. Alternativement, pour l’imagerie simultanée en temps réel par fluorescence, la puce et le tube d’entrée d’environ 1,5 m sont placés directement dans le microscope. Un support pour la puce, qui s’insère dans des supports de plaque standard à 96 puits, est fourni dans le dossier supplémentaire 3.
      REMARQUE: Assurez-vous que l’humidité est suffisamment élevée pendant l’incubation. Si nécessaire, ajoutez un tissu humide à la chambre d’imagerie ou à l’incubateur pour éviter l’évaporation dans la configuration microfluidique. Si l’humidité dans l’incubateur du microscope est trop faible, il en résulte la formation de bulles d’air dans le tube et la puce microfluidique. Une boîte d’imagerie fermée, dans laquelle sont placés la puce et le tube, peut ensuite être utilisée. Le moyen le plus simple de fabriquer une telle boîte d’imagerie est de placer un grand couvercle sur la puce et d’ajouter un tissu humide, il n’est pas nécessaire de la fermer complètement. Assurez-vous que la différence de hauteur entre la pompe et la puce n’est pas trop grande et, si nécessaire, changez de hauteur lentement pour éviter la formation de bulles d’air dues à la gravité.
    4. Laisser toutes les pompes s’écouler à un débit de 20 μL/h pendant 20 min, après que l’installation a été placée à son emplacement final. Étant donné que la chambre et la pompe ont très probablement bougé en hauteur, cela est nécessaire pour rétablir la pression correcte dans le tube.
    5. Éteignez la pompe à médicaments, laissez seulement la pompe moyenne fonctionner à 60 μL / h jusqu’au début de l’expérience / imagerie en temps réel.
  4. Début de l’expérience.
    1. Démarrez le programme de pompage prévu pour l’expérience. Pour entraîner la signalisation Notch, utilisez un programme de pompage de 100 min de milieu et 30 min d’impulsions de médicament, qui est répété jusqu’à la fin de l’expérience, généralement pendant 24 h.
      REMARQUE: Toute pompe microfluidique programmable peut être utilisée. Dans le format le plus simple, les pompes peuvent être programmées et démarrées manuellement. Alternativement, les pompes peuvent être contrôlées par un logiciel informatique.
    2. Dans le cas où une imagerie en temps réel est effectuée, commencez l’imagerie après une période d’au moins 30 minutes. Cela permettra à la température de la puce de s’ajuster à la température à l’intérieur de l’incubateur et d’éviter une dérive trop forte pendant l’imagerie. L’autofocus est toujours bénéfique.
    3. Effectuez une imagerie confocale standard via la lame de verre de la puce à l’aide d’un microscope inversé. Utilisez un intervalle d’imagerie de 10 min pour détecter suffisamment les oscillations de signalisation avec une période de 130 min.
    4. Pour des périodes plus courtes, raccourcissez l’intervalle pour un échantillonnage suffisant. Inclure une piste d’imagerie à basse résolution pour la détection de Cascade Blue afin de visualiser la présence de médicament sur la puce.
    5. Pour l’excitation d’un rapporteur de Vénus, utilisez un laser de 515 nm ou un laser à 2 photons à une longueur d’onde de 960 nm.
    6. Acquérir une pile z de 6-8 plans avec une distance de 8 μm à travers un objectif de plan 20x (résolution 512 x 512 pixels, 1,38 μm/pixel). Utilisez une scène motorisée pour imager plusieurs échantillons au sein d’une même expérience.
    7. Excitez Cascade Blue avec un laser de 405 nm et acquérez un seul plan z toutes les 10 minutes (résolution 32 x 32 pixels, 22,14 μm/pixel).
      REMARQUE : De plus amples renseignements sur l’imagerie et l’analyse d’images sont fournis dans les résultats représentatifs et se trouvent dans la référence10.

Résultats

Avec ce protocole, une méthode d’entraînement externe des oscillations de signalisation de l’horloge de segmentation de la souris à l’aide de la microfluidique est présentée. En appliquant des impulsions d’inhibiteur de signalisation Notch, les oscillations de signalisation dans des cultures embryonnaires indépendantes sont synchronisées les unes avec les autres10. Une condition préalable à l’application de ce système pour étudier la fonctionnalité de l’horloge de segmentation est que la dynamique de signalisation et la segmentation sont toujours présentes sur la puce. Il a été montré précédemment que la dynamique de signalisation Wnt et Notch est maintenue malgré un écoulement moyen constant et que la formation de limites physiques persiste dans les cultures 2D périphériques, représentant le PSM10 antérieur.

Pour confirmer l’entraînement des oscillations de signalisation aux impulsions de médicament externes, une imagerie en temps réel, par exemple, du rapporteur de signalisation Notch LuVeLu5, exprimant la protéine fluorescente jaune Vénus, au cours de l’expérience microfluidique est effectuée. Étant donné que l’orientation des cultures 2D sur puce est difficile à contrôler, les oscillations de signalisation dans le tissu antérieur sont analysées. La périphérie de la culture 2D peut être détectée de manière reproductible. L’orientation des sections tissulaires sur la puce ne peut pas être contrôlée à volonté et toute la surface interne de la puce est recouverte de fibronectine. Par conséquent, il arrive parfois que les cultures s’attachent aux côtés ou au plafond de la puce. Dans le cas où les échantillons sortent du champ de vision (dans les directions x, y et z) ou s’ils s’attachent avec l’extrémité postérieure de la queue tournée vers le bas, ces échantillons sont généralement exclus.

Pour une analyse plus approfondie, plusieurs de ces expériences d’entraînement sont combinées. Des expériences indépendantes peuvent être alignées les unes sur les autres en utilisant la synchronisation des impulsions de médicament visualisées par le colorant, Cascade Blue, à environ 400 nm. Pour analyser et visualiser la synchronisation, les oscillations quantifiées peuvent être déstrendées (Figure 2B, D), puis affichées sous forme de moyenne et d’écart-type ou des phases des oscillations peuvent être calculées. Cela permet d’analyser la relation de phase entre les oscillations des cultures embryonnaires postérieures indépendantes les unes par rapport aux autres et aux impulsions médicamenteuses externes (Figure 2C,E). Le programme basé sur python pyBOAT33 est un outil simple et convivial pour déterminer la période, la phase et l’amplitude de ces oscillations de signalisation. Pour confirmer l’entraînement, on peut, par exemple, déterminer la période des oscillations de signalisation endogène. Lors de l’application d’impulsions d’une durée de 130 min, les oscillations de signalisation Notch indiquent également une période de 130 min (Figure 2F)10. De plus, en utilisant les impulsions Cascade Blue, des expériences indépendantes avec différents rapporteurs de signalisation peuvent être alignées les unes sur les autres. De cette façon, la relation de phase entre les oscillations de plusieurs rapporteurs de signalisation peut être déterminée indirectement10.

Ainsi, le système microfluidique présenté permet le contrôle des oscillations de signalisation dans les cultures ex vivo de l’embryon de souris en développement. En combinaison avec l’imagerie de marqueurs pour la formation et la différenciation de segments, ce système peut maintenant être appliqué pour disséquer comment les voies de signalisation de l’horloge de segmentation interagissent et comment elles contrôlent la formation de somite.

figure-results-1
Figure 1 : Vue d’ensemble schématique du protocole microfluidique. (A) Les moules à puce peuvent être conçus à l’aide d’un logiciel de conception assistée par ordinateur (CAO). Une conception de puce pour entraîner les oscillations de signalisation dans des modèles ex vivo de somitogenèse de souris est fournie. Les moules peuvent, par exemple, être générés par impression 3D ou commandés. Les puces microfluidiques sont produites par moulage de PDMS. Une puce PDMS durcie est découpée et collée de manière covalente à une lame de verre à l’aide d’un four à plasma. La surface vitrée de la puce est recouverte de fibronectine pour permettre aux tissus disséqués de s’attacher. Le tissu embryonnaire est chargé sur la puce via des entrées de chargement, qui sont ensuite fermées. Des pompes avec différentes conditions de média sont fixées aux entrées de la puce et un programme d’écoulement est initialisé. Les tissus peuvent être imagés à l’aide d’un microscope confocal pendant l’expérience. (Kymographes adaptés de Sonnen et al., 201810. Réimprimé et modifié à partir de Cell selon Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.) (B) Dessin schématique d’un modèle de moule pour la culture sur puce de tissu embryonnaire postérieur de souris. La hauteur des canaux microfluidiques est de 500 μm, suffisante pour la culture de queues de souris embryonnaires postérieures. Le fichier pour imprimer ce moule est fourni dans le fichier supplémentaire 1, et une alternative est donnée dans le fichier supplémentaire 2. (C) Image en champ clair d’une queue de souris sectionnée E10.5 entourée de piliers PDMS sur puce. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2: Résultats représentatifs d’une expérience de microfluidique. (A) Représentation schématique de l’expérience d’entraînement avec un milieu et une pompe à médicaments. Les impulsions du modulateur de la voie de signalisation sont appliquées à des cultures ex vivo d’embryons de souris et les oscillations de signalisation peuvent être visualisées par imagerie en temps réel des rapporteurs de signalisation dynamique (par exemple, le rapporteur de signalisation Notch LuVeLu5 et le rapporteur de signalisation Wnt Axin2T2A10). Les lignes pointillées indiquent la région utilisée pour les analyses au fil du temps. (B-F) Les oscillations rapporteures LuVeLu sont entraînées par des impulsions périodiques de l’inhibiteur de signalisation Notch DAPT. (B,D) Quantifications des oscillations de signalisation Notch dans le PSM antérieur lors de l’entraînement à l’aide de DAPT ou d’un contrôle DMSO. (C,E) Diagrammes de relation phase-phase entre la phase des oscillations de signalisation Notch et la synchronisation des impulsions DAPT/DMSO externes. En cas d’entraînement, une relation de phase stable est établie. (F) Quantification de la période moyenne et du MEB des oscillations rapporteures en comparant des échantillons entraînés avec des impulsions DMSO et DAPT. (Figure adaptée de Sonnenet al., 201810. Réimprimé et modifié à partir de Cell selon Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

ProblèmeSolution(s) suggérée(s)
Le PDMS ne se lie pas au verre.- Assurez-vous que le PDMS et le verre sont propres.
- Assurez-vous qu’il y a suffisamment de PDMS autour de la chambre pour le collage.
- Optimiser les réglages du four plasma.
Il y a des bulles d’air sur ma puce.- Vérifiez si la pompe a été allumée.
- Dégazez la puce avant de charger le tissu sur la puce.
- Dégazer le milieu avant le début de l’expérience.
- Assurez-vous que l’humidité dans la chambre d’incubation est suffisamment élevée.
Le tissu meurt au début de l’expérience.- Ajouter HEPES au support lors du chargement et de l’assemblage de la puce.
- Ne pas rincer le tissu trop souvent pendant le chargement.
- Vérifiez que le débit n’est pas trop élevé.
Le tissu meurt pendant l’imagerie.- Assurez-vous qu’il n’y a pas de phototoxicité de l’imagerie
- Assurez-vous qu’il n’y a pas de contamination.
- Le débit ne doit pas être trop élevé.
La mise au point change pendant l’imagerie.- Utilisez l’autofocus pendant l’imagerie pour ajuster la dérive de la diapositive d’imagerie.
- Laissez la puce s’équilibrer à la température dans le microscope pendant au moins 30 minutes.
Les sorties/entrées se détachent.- Poussez tous les tubes complètement vers le bas.
Le verre de la puce se brise.- Attention, le verre est très fragile.
- Le verre mince n’est nécessaire que pour l’imagerie. Si l’imagerie n’est pas effectuée, une lame de verre normale plus épaisse peut être utilisée.
- Si la rupture est à l’extérieur de la puce, ce n’est peut-être pas un problème. Si le joint de verre à la puce est cassé, le liquide s’échappera et l’air entrera.
Il y a une contamination sur ma puce.- Ajouter des antibiotiques au milieu de culture.
- Stériliser tout l’équipement et les tubes.
- Travaillez rapidement et proprement.

Tableau 1 : Dépannage

Dossier supplémentaire 1 : FICHIER STL pour l’impression d’un moule avec une imprimante 3D. Ce moule est utilisé pour générer une puce microfluidique pour la culture sur puce de tissu embryonnaire postérieur (conception illustrée à la figure 1). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 2 : Fichier STL pour l’impression d’un moule avec une imprimante 3D afin de générer une puce microfluidique pour la culture sur puce de tissu embryonnaire postérieur. Contrairement au fichier supplémentaire 1 et à la conception illustrée à la figure 1, cette conception contient des pièges à bulles à toutes les entrées pour empêcher de petites quantités d’air de pénétrer dans la chambre microfluidique principale. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Fichier de conception pour la génération d’un support pour placer la puce dans le microscope. Ce support a les dimensions d’une plaque de 96 puits et devrait tenir dans les supports standard de la plupart des microscopes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Comment la dynamique de la signalisation contrôle les systèmes multicellulaires est une question de longue date dans le domaine. L’investigation fonctionnelle pose un défi majeur, car ces dynamiques doivent être subtilement modulées pour permettre cela11. Un tel contrôle temporel des perturbations de voie peut en principe être réalisé avec l’optogénétique, ce qui permet également un contrôle spatial élevé34. Cependant, l’optogénétique nécessite la mise en place d’outils génétiques sophistiqués pour l’analyse de chaque voie de signalisation en question. Le protocole actuel décrit ici fournit un outil très polyvalent pour la perturbation de toute voie de signalisation. L’expérience de microfluidique permet l’application d’impulsions médicamenteuses contrôlées temporellement pour étudier fonctionnellement la dynamique des voies de signalisation dans les cultures tissulaires. Ici, l’accent est mis sur l’étude de la somitogenèse dans des cultures ex vivo , mais le protocole peut être adapté pour s’adapter à tout autre système modèle.

Certaines étapes du protocole sont essentielles pour mener à bien une expérience de microfluidique (résumée dans le tableau 1). Les points clés sont discutés comme suit. En raison de l’écoulement moyen au cours de l’expérience, la culture tissulaire subit un stress de cisaillement. L’exposition du système modèle à un flux continu peut provoquer un stress cellulaire et, dans des cas extrêmes, la mort cellulaire due à un effet de cisaillement. Pour les cultures tissulaires ex vivo d’embouts de souris et la conception actuelle de la puce, un débit de 60 μL/ h (maximum de 100 μL / h) s’est avéré bien fonctionner avec un effet de cisaillement minimal. Lorsque plusieurs pompes sont allumées simultanément pour la même puce, le débit des pompes individuelles doit être ajusté en conséquence pour ne pas provoquer d’augmentation du débit total. Lorsque le protocole actuel est adapté à d’autres systèmes modèles et conceptions de puces, le débit doit être optimisé. Alternativement, il est possible de ne pas rincer le milieu en continu, mais de changer périodiquement le milieu sur la puce35. Une telle configuration peut également être appliquée pour contrôler les oscillations de signalisation dans la somitogenèse de la souris (non publiées, données non montrées). De plus, une configuration peut également être envisagée, dans laquelle les cultures de tissus ne sont pas exposées à un écoulement direct de fluide, mais les médicaments atteignent le tissu par diffusion à partir d’un canal voisin. De tels systèmes ont été utilisés avec succès pour appliquer des gradients de facteurs de croissance à des modèles in vitro de différenciation ESC14,36.

Un problème majeur des expériences microfluidiques est l’apparition de bulles d’air sur puce pendant l’expérience. Les bulles d’air à l’intérieur de la puce ou du tube peuvent interférer avec l’écoulement uniforme du liquide sur la puce et peuvent entraîner le retrait de la culture embryonnaire de son emplacement. Pour éviter la présence de bulles d’air, différentes étapes du protocole sont indispensables. Tout d’abord, le milieu de culture à l’intérieur des seringues et de la puce microfluidique elle-même doit être dégazé à l’aide d’un dessiccateur (étape 3.1.3). Deuxièmement, lors du chargement d’échantillons dans les entrées de chargement, il faut veiller à ne pas injecter d’air dans la puce avec l’échantillon (étape 3.2.3). Troisièmement, lors du remplissage du tube avec du milieu, toutes les bulles d’air doivent être pompées avant de fixer la puce (étape 3.3.2). Sinon, ces bulles seront poussées dans la puce principale pendant l’expérience. Enfin, au cours de l’expérience, le milieu est équilibré dans la chambre d’imagerie ou l’incubateur en raison du tube semi-perméable. La perméabilité du tube permet également l’évaporation du milieu, alors assurez-vous que l’humidité est régulée pendant l’expérience pour éviter la formation de nouvelles bulles dans le tube.

En général, la microfluidique est un outil très polyvalent qui peut être adapté à la question spécifique du chercheur. L’approche de conception actuelle permet d’imager jusqu’à 12 cultures ex vivo en parallèle par puce. Ce nombre est principalement limité par le nombre d’embryons par expérience et le temps qu’il faut pour imager chaque culture d’embryons avec une résolution suffisante. Si plusieurs conditions doivent être comparées dans une seule expérience, plusieurs puces peuvent être montées sur une seule lame de verre. Une conception de puce est fournie, ce qui est idéal pour l’imagerie de plusieurs explants de tissus en parallèle, mais des conceptions personnalisées peuvent surmonter les limites du nombre d’échantillons pour permettre une analyse à haut débit et augmenter la combinaison de plusieurs conditions au sein d’une seule expérience16,17. La microfluidique est limitée aux modèles qui peuvent être cultivés sur une puce et la culture sur puce devra être optimisée pour chaque système modèle individuellement27,37,38.

Au cours des 5 à 10 dernières années, la microfluidique a été appliquée pour répondre à diverses questions biologiques en raison de son potentiel pour les approches à haut débit et les modulations subtiles de la dynamique et des gradients de signalisation. De nos jours, la microfluidique est devenue un outil facilement applicable, bon marché et polyvalent que les laboratoires peuvent facilement établir. Ici, le protocole actuel est optimisé pour une application spécifique, à savoir l’étude de la dynamique de signalisation régissant la somitogenèse. Il est simple d’adapter ce protocole et cette conception aux questions de recherche individuelles en biologie tissulaire.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous sommes reconnaissants à Yang Li et Jos Malda de l’UMC Utrecht pour leur aide à l’impression 3D de moules, Karen van den Anker du groupe Sonnen pour leurs commentaires très utiles sur le protocole, et Tjeerd Faase de l’atelier mécanique de l’Institut Hubrecht pour le support de puces microfluidiques dans le microscope. Nous tenons à remercier l’ensemble du groupe Sonnen pour la lecture critique du manuscrit et les réviseurs pour leurs commentaires constructifs. Ce travail a reçu un financement du Conseil européen de la recherche dans le cadre d’une convention de subvention de démarrage ERC n° 850554 à K.F.S.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Seringue de 10 mlBecton, Dickinson et compagnie300912
184 Agent de durcissement en élastomère de siliciumSYLGARD1673921
184 Seringues en élastomère de silicium PDMSSYLGARD1673921
seringues de 3 mlBecton, Dickinson et compagnie309657
RubanScotch Magic tape ou similaire
Pince à pointe arrondie Bochem 18/10 Acier inoxydableFisher Scientific10663341
Bovin Albumine sérique pH lyophilisé~7BiowestP6154
Système
Boîte de cristallisationVWR10754-7
D-(+)-Glucose stérilisé 45 %SigmaG8769
DessiccateurVWR467-0104
Gobelets jetablesDuni173 941
Fourchettesjetables Agrafes511514
Matériel
DMEM/F12Technologies de culture cellulairesur mesureDMEM/F-12, sans rouge de phénol, sans L-glutamine, sans glucose
FibronectinSigmaF1141-5MG
Hotte d’écoulement BioVanguard GreenlineCleanAir de Baker511514Pour source de lumière UV
Lame en verre No 1.5H haute précision, 70x70 mmMarienfeld107999098
HEPES BufferGibco15630-056
L-glutamineGibco25030024
MicroscopeLeicaLeica SP8 MP
Aiguilles 22GBecton, dickinson et entreprisez412139-100EA
FourVWR390-09
PBS0
Pénicilline-StreptomycineGibco15070063
Four à plasma FemtoDiener électronique
Punch & Oslash ; 1mmUni-CoreWB100073
ScaleSartoriusEntris
Pousse-seringueWPIAL-4000
Tubing & Oslash ; 1mmAPTAWG24T
Pompeà vide VWR181-0308
adhésif d’air compriméde dissection

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Mots-clés

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