Induction d’hypothermie de courte durée chez le rat à l’aide de modèles pour des études examinant la pertinence clinique et les mécanismes

Résumé

Cet article décrit deux méthodes d’induction de l’hypothermie de courte durée du corps entier chez le rat. La première méthode d’induction rapide utilise un refroidissement actif à l’aide de ventilateurs et de pulvérisation d’éthanol pour une diminution rapide de la température. La deuxième méthode est une méthode de refroidissement progressif. Ceci est réalisé en utilisant la combinaison de l’anesthésie à l’isoflurane et de la réduction des réglages de température sur le tapis chauffant homéotherme. Il en résulte une diminution progressive de la température corporelle centrale sans l’utilisation de dispositifs de refroidissement externes. 

Résumé

L’hypothermie thérapeutique (TH) est une stratégie neuroprotectrice puissante qui a fourni des preuves solides de la neuroprotection dans les études précliniques des troubles neurologiques. Malgré de solides preuves précliniques, la TH n’a pas montré d’efficacité dans les essais cliniques de la plupart des troubles neurologiques. Les seuls essais réussis utilisant l’hypothermie thérapeutique étaient liés à un arrêt cardiaque chez les adultes et à des lésions ischémiques hypoxiques chez les nouveau-nés. D’autres recherches sur les paramètres de son utilisation et des comparaisons de la conception de l’étude entre les études précliniques et cliniques sont justifiées. Cet article présente deux méthodes d’induction de l’hypothermie de courte durée. La première méthode permet une induction rapide de l’hypothermie chez le rat à l’aide d’un spray à l’éthanol et de ventilateurs. Cette méthode agit en refroidissant la peau, ce qui a été moins couramment utilisé dans les essais cliniques et peut avoir des effets physiologiques différents. Le refroidissement est beaucoup plus rapide avec cette technique que ce qui est réalisable chez les patients humains en raison des différences de rapport surface/ volume. Parallèlement à cela, une deuxième méthode est également présentée, qui permet un taux de refroidissement cliniquement réalisable pour l’hypothermie de courte durée. Cette méthode est facile à mettre en œuvre, reproductible et ne nécessite pas de refroidissement actif de la peau.

Introduction

TH est la pratique de refroidissement de la température corporelle ou cérébrale afin de préserver la viabilité et la fonction de l’organe / système^1,2. Le rôle de l’hypothermie dans la neuroprotection a été étudié et a montré des avantages dans une gamme de modèles précliniques de maladies neurologiques telles que l’accident vasculaire cérébral^3,l’hémorragie sous-arachnoïdienne⁴et les lésions cérébrales traumatiques⁵. En termes d’applications cliniques, TH a montré son efficacité chez les patients post-arrêt cardiaque et dans les lésions hypoxiques-ischémiques néonatales⁶.

L’induction TH est réalisée en utilisant des méthodes de refroidissement de surface ou endovasculaires. La majorité des études précliniques d’hypothermie effectuent un refroidissement de surface en appliquant de l’eau ou de l’éthanol sur la fourrure de l’animal, ou en utilisant une couverture de refroidissement pour atteindre la température cible¹. Chez l’homme, le refroidissement systémique de la surface est obtenu en utilisant des sacs de glace et des couvertures de refroidissement^7,8. Un refroidissement plus rapide a été démontré chez les patients utilisant des méthodes endovasculaires, qui couplent une perfusion inductionnelle de solution saline froide à travers un cathéter intraveineux ou intra-artériel, avec la mise en place d’un dispositif de refroidissement endovasculaire dans la veine cave inférieure^9,10. Par exemple, une température cible modérée de 33 °C peut être atteinte en 1,5 h avec un refroidissement endovasculaire contre 3-4 h avec un refroidissement de surface chez les patients¹¹. L’approche endovasculaire est également devenue plus populaire ces dernières années car il a été rapporté qu’elle réduisait certains des effets secondaires observés dans le refroidissement systémique de la surface, tels que les frissons^12,13. L’essai clinique européen multicentrique randomisé de phase III sur l’hypothermie pour les accidents vasculaires cérébraux ischémiques (EUROHYP-1) a principalement utilisé le refroidissement de surface^14. Les résultats récemment publiés de cet essai ont montré que les frissons étaient une complication majeure et auraient pu limiter la capacité d’atteindre la température cible¹⁰. La réponse frissonnante est connue pour être principalement entraînée par la température de la peau. Certains efforts ont été faits pour développer une méthode de refroidissement endovasculaire des rongeurs¹⁵, mais la nature hautement invasive de la technique par rapport à celle utilisée chez l’homme, risque de confondre les résultats obtenus à partir de ce modèle.

La température est le principal modulateur des processus biologiques dans le corps et est étroitement régulée par l’homéostasie. Par conséquent, toute manipulation de la température corporelle peut avoir des risques associés. La durée du refroidissement est un facteur qui peut avoir limité le succès des essais cliniques sur l’hypothermie. Ces essais utilisent une méthode de refroidissement de longue durée, beaucoup maintenant l’hypothermie de 24-72 h¹¹. Cette durée prolongée présente un risque d’infection pendant le protocole de refroidissement. La pneumonie est la complication la plus fréquente de l’hypothermie, affectant entre 40 et 50% des patients qui subissent la procédure¹³. Ceci est en contraste avec ce qui est normalement vu dans les études animales de l’hypothermie où un paradigme de courte durée est utilisé (1-6 h)³. Le succès de ces études précliniques sur les animaux entraînera probablement l’adaptation de l’hypothermie de courte durée pour l’utilisation dans les essais cliniques. En conséquence, il est nécessaire d’avoir un modèle animal d’hypothermie de courte durée qui ressemble aux taux de refroidissement des futurs essais cliniques. De plus amples détails concernant d’autres paramètres de température et la validité de l’hypothermie de courte durée ont été discutés dans plusieurs articles de revue^1,16,17,18.

Il est démontré ici un modèle progressif de refroidissement qui est plus cliniquement réalisable que les modèles expérimentaux actuels d’hypothermie. Cette nouvelle méthode a un taux de refroidissement beaucoup plus lent et, par conséquent, le temps nécessaire pour cibler la température est plus proche de ceux observés dans les essais cliniques d’hypothermie^11. Il évite également le refroidissement direct de surface, qui a des effets physiologiques spécifiques, et peut donc être plus comparable au refroidissement endovasculaire, qui a été la méthode de refroidissement la plus couramment utilisée dans les essais cliniques^9,12. Ce modèle permet de refroidir progressivement les animaux sur 2 h suivis d’une courte période d’entretien à la température cible. En outre, la méthode d’hypothermie de courte durée à refroidissement rapide¹⁹ est également démontrée. La méthode de refroidissement rapide permet d’atteindre rapidement la température cible après l’apparition de l’hypothermie. Bien que cette approche ne soit pas aussi pertinente sur le plan clinique que la méthode de refroidissement progressif, elle est utile pour les études qui visent à explorer les mécanismes de la neuroprotection de l’hypothermie afin d’imiter potentiellement ses puissants effets neuroprotecteurs pharmacologiquement. Cette méthode a également des applications potentielles en dehors des neurosciences et pourrait être adaptée à un certain nombre d’études précliniques. Un autre avantage des deux méthodes par rapport à d’autres approches est qu’elles sont peu coûteuses et ne nécessitent pas d’équipement spécialisé. Enfin, ce protocole démontre également l’implantation d’enregistreurs de données de température, car le réchauffement postopératoire et sa surveillance sont importants pour prévenir l’hypothermie postopératoire accidentelle, avec son potentiel de confondre les résultats de l’étude²⁰.

Protocole

Toutes les procédures expérimentales étaient conformes au Code de pratique australien pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques et ont été approuvées par le Comité des soins et de l’éthique des animaux de l’Université de Newcastle (A-2013-343 et A-2020-003). En plus des méthodes d’induction de l’hypothermie décrites ci-dessous, les protocoles suivants sont systématiquement effectués en conjonction avec l’hypothermie: canulation de la ligne fémorale pour surveiller la pression artérielle et la fréquence cardiaque²¹, et accident vasculaire cérébral expérimental²².

1. Implantation d’enregistreur de données

REMARQUE: Le dispositif d’enregistrement de données utilisé dans ce protocole n’était pas capable de fournir une lecture en temps réel de la température corporelle. La lecture est possible une fois que l’enregistreur de données a été retiré de l’animal et re-connecté à l’ordinateur. En conséquence, la sonde de température rectale est utilisée pour fournir des informations en temps réel pendant le processus de refroidissement et de réécurration. En outre, la sonde rectale est également vitale pour cette méthode car le tapis chauffant chirurgical sur lequel l’animal est placé pendant la procédure est régulé par le système de sonde rectale. L’enregistreur de données sert également un objectif précieux de fournir des données de température chez les rats éveillés en mouvement libre et est important pour s’assurer que la température corporelle normale est maintenue après le rééchammage. Par conséquent, les deux dispositifs de surveillance de la température sont importants pour ce protocole.

1. Anesthésier un rat Wistar mâle de 10 à 12 semaines avec de l’isoflurane (5 % pour l’induction et 2 à 2,5 % pour l’entretien) dans un mélange à 50 % de_N2 et à 50 % d’O2.
2. Après l’induction, placez le rat en position couchée sur un tapis chauffant chirurgical.
3. Positionnez le rat de sorte que le nez soit assis dans le cône du nez. Fixez le nez avec du ruban chirurgical pour vous assurer qu’aucun gaz ne s’échappe.
4. Raser la fourrure du bas de l’abdomen droit et injecter le site par voie sous-cutanée avec un anesthésique local, Bupivacaïne 0,2 mL, 0,05%.
5. Appliquer une solution antiseptique sur la région fraîchement rasée.
6. À l’aide d’outils chirurgicaux stérilisés, faites une incision longitudinale de 2 cm le long de la région abdominale droite, proximale à la cuisse droite. Faites l’incision assez profondément pour exposer l’espace au niveau du pli ventral de la cuisse.
7. Utilisez des hémostats et des pinces pour créer une « poche » sous la peau qui est assez grande pour contenir l’appareil.
8. Insérez l’enregistreur de données de surveillance de la température dans la poche et fermez le muscle et la peau à l’aide de sutures en soie 5-0. La méthode sous-cutanée décrite ici est préférée à la méthode intra-péritonéale car elle est moins invasive et permet une meilleure récupération après la procédure.
9. Assurez-vous que l’enregistreur de données et la sonde rectale sont étalonnés pour la surveillance de la température (voir Discussion).
10. Assurez-vous que l’enregistreur de données ne repose pas contre le tapis chauffant de l’animal après l’insertion, car cela influencera les lectures de température.

Figure 1: Implantation d’un enregistreur de données. (A) Des panneaux de gauche à droite montrent une incision d’environ 2 cm pratiquée sur le côté droit du bas-ventre du rat. (B) L’enregistreur de données de surveillance de la température a été inséré par voie sous-cutanée dans l’incision de la poche. (C) L’incision a été fermée avec des sutures en nylon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Induction de l’hypothermie active (rapide) pour les études mécanistes

1. Configurer pour l’hypothermie (voir Figure 2). Placez deux supports d’attorse avec des pinces de chaque côté du corps du rat.
2. Fixez un ventilateur de 60 mm 12 v/130 mA à chaque support d’atteau de secours en veillant à ce que les ventilateurs soient dirigés vers le bas du dos du rat. La distance entre la pince et le rat est d’environ 20 cm. Le ventilateur utilisé doit avoir une vitesse de 4 000 tr/min.
3. Ayez une lampe chauffante pour animaux prête sur le côté ou sur un troisième support d’atteau.
4. Commencez l’hypothermie en ajustant le tapis chauffant de l’animal à la température cible souhaitée. Dans cet exemple, 32,5 °C est la température cible (3,75 sur l’unité de contrôle de la température).
5. Allumez les deux ventilateurs et appliquez trois à quatre pulvérisations d’éthanol à 70% (flacon pulvérisateur en plastique standard) sur le bas du dos du rat. Ébouriffez la fourrure animale lors de la pulvérisation pour une induction de refroidissement plus rapide.
   REMARQUE: L’éthanol est utilisé comme solution préférée à l’eau car il a un taux d’évaporation plus rapide et entraîne donc une induction d’hypothermie plus rapide.
6. Veillez à ne pas sursaturer la fourrure, car cela peut contribuer à dépasser la température cible.
   REMARQUE: Les ventilateurs accéléreront l’évaporation de l’éthanol et le processus de refroidissement.
7. Prévoyez de courts intervalles entre les applications d’éthanol tout en surant de près la température rectale du rat.
8. Cesser toute autre application d’éthanol une fois que la température rectale atteint 1 °C de la température cible.
9. Éteignez les deux ventilateurs une fois que la température a atteint 0,5 °C de la température cible (33 °C dans ce cas).
   REMARQUE: Éteindre les ventilateurs avant que la température cible ne soit atteinte aide à empêcher le rat de trop refroidir au-delà de la température requise.
10. Laissez la température descendre à 32,5 °C.
    1. Si un refroidissement excessif se produit, utilisez une lampe chauffante pour animaux pour réchauffer légèrement l’animal jusqu’à la cible. L’aide d’un ventilateur peut être utilisée pour éviter un dépassement de réécharissement.
11. Une fois que la température cible est atteinte et stabilisée, continuez à surveiller la température. La température restera généralement très stable pour le reste de la période d’hypothermie sans avoir besoin de pulvérisation, d’utilisation de ventilateurs ou de lampe chauffante.
12. Pour réchauffer l’animal à la fin de l’hypothermie, réglez la température du tapis chauffant à 37 °C (6 sur l’unité de contrôle de la température utilisée dans cet exemple) et laissez l’animal thermoréguler sur une période de 30 minutes.
    REMARQUE: Les réglages de température sur les unités de contrôle de la température peuvent varier et il peut donc être nécessaire de déterminer les paramètres d’hypothermie cible et de normothermie sur des appareils individuels.

3. Induction d’une hypothermie d’apparition progressive cliniquement réalisable sans refroidissement actif de la peau

1. Réalisez l’hypothermie en réduisant la température du tapis chauffant homéotherme régulé par la température centrale par petits incréments à la température cible requise. Dans l’exemple illustré(Figure 3B),un incrément de 1 °C toutes les 30 minutes a été utilisé.
2. Refroidir l’animal à la température cible sur la période souhaitée (2 h dans l’exemple décrit). Une fois refroidi, maintenez la cible pendant l’intervalle souhaité. Habituellement, aucune autre intervention n’est nécessaire s’ils sont maintenus sur le tapis chauffant homéotherme réglé pour la température cible souhaitée.
3. Aucun refroidissement externe n’est nécessaire avec ce protocole car l’anesthésie empêche la régulation normale de la température corporelle centrale.
   REMARQUE: Les besoins en isoflurane diminuent avec l’hypothermie. Chez la plupart des animaux, une concentration initiale d’isoflurane de 2% peut être réduite par incréments de 0,1% toutes les 20-30 minutes à 1,5% pour maintenir une fréquence respiratoire stable (>50 respirations / min), la fréquence cardiaque et la pression artérielle, et préserver la suppression des réponses réflexes.
4. Pour réchauffer l’animal après une hypothermie, ajustez le tapis chauffant pour permettre à l’animal de réchauffer pendant l’intervalle souhaité. Dans l’exemple, le réécharissement avec un seul réglage à 37 °C (6 sur l’unité de contrôle de la température FHC utilisée dans l’exemple) a été réalisé sur une période de 30 minutes.
   1. Pour les études à plus long terme qui nécessitent la récupération des animaux, gardez les animaux dans une cage placée à moitié sur un tapis chauffant pour permettre à l’animal de se thermoréguler et d’éviter une hypothermie postopératoire accidentelle.
   2. Le paracétamol rectal (250 mg / kg) peut être administré pour la récupération et le soulagement de la douleur ovrenight. Des injections sous-cutanées de solution saline (2 x 1,5 mL) peuvent également être administrées pour prévenir la déshydratation due à l’anesthésie et aux interventions chirurgicales.

Résultats

La figure 3A est une représentation de la façon dont un rat Wistar réagit à l’hypothermie en utilisant l’approche de refroidissement rapide. L’induction de l’hypothermie est obtenue par l’utilisation de ventilateurs et d’un spray à 70% d’éthanol. L’hypothermie à un objectif de 32,5 °C est atteinte en 15 min. Il faut veiller à assurer une interaction délicate entre l’utilisation des ventilateurs / lampe chauffante et le spray à l’éthanol pour maintenir la température cible. Comme le voit la figure 3A,on observe un léger dépassement de température, qui peut se produire si le refroidissement n’est pas interrompu à partir d’environ 0,5 °C au-dessus de la température cible. La cible est maintenue et stabilisée à la marque des 30 minutes et le réécharissement est lancé à 1,5 h.

La figure 3B montre le protocole progressif dans lequel la température cible à 33 °C est atteinte à 2 h et maintenue pendant 30 min avant de se réécharir à 2,5 h. Ici, la température est ajustée par incréments, ce qui prolonge la durée nécessaire pour atteindre la température cible. Les lignes pointillées verticales dans les deux graphiques représentent la durée du refroidissement.

La figure 3A et la figure 3B sont obtenues à partir du dispositif d’enregistrement de données. Au début de l’expérience, l’enregistreur de données est programmé pour lancer l’enregistrement avant l’implantation. À la fin de l’expérience, l’enregistreur de données est retiré de l’animal et connecté au lecteur de température fourni via un port USB. Le logiciel (par exemple, eTemperature) lit et génère les données, qui peuvent ensuite être exportées vers un tableur.

Figure 2: Mise en place d’un protocole de refroidissement rapide. (A) Deux ventilateurs (flèche noire) étaient situés au-dessus de la région inférieure du dos du rat. Au début de l’hypothermie, les deux ventilateurs ont été allumés et un spray d’éthanol a été appliqué sur le bas du dos. La combinaison de l’éthanol et du ventilateur facilite et accélère l’hypothermie pour atteindre rapidement la température cible. (B) Une lampe chauffante (flèche blanche) a été utilisée pour prévenir le dépassement de l’hypothermie. Une fois la température cible atteinte, la lampe chauffante a été utilisée pour empêcher la température centrale du rat de baisser. Une fois la cible stabilisée, la lampe chauffante et/ou le ventilateur restant ont été éteints. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 3: Induction de l’hypothermie par des méthodes actives (A) et progressives (B). (A) La température cible a été atteinte en 15 minutes en utilisant le processus de refroidissement actif et a été maintenue pendant 60 minutes dans l’exemple ci-dessus avant que l’animal ne soit refait. (B) La température cible a été atteinte en 2 h à l’aide de la méthode de refroidissement progressif et a été maintenue pendant 30 minutes avant que l’animal ne soit refait. Les régions ombrées dans les deux graphiques représentent les points temporels dans lesquels la température cible a été maintenue. Les lignes perpendiculaires pointillées dans les deux graphiques font référence à la durée globale de refroidissement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les procédures décrites ici sont faciles à mettre en œuvre, non invasives et fournissent des diminutions fiables et reproductibles de la température corporelle centrale à une température cible souhaitée.

Il y a plusieurs étapes critiques dans la méthode de refroidissement rapide qui comprennent les suivantes. Ne pas sursaturer le spray à l’éthanol - il faut veiller à ne pas tremper l’animal dans de l’éthanol, car cela interférerait avec les résultats. Surveiller l’animal pendant l’induction de l’hypothermie - il faut prendre soin de surveiller de près les réponses de l’animal à l’induction rapide de l’hypothermie. Une surveillance étroite de la température rectale est importante pour s’assurer que la température ne descend pas en dessous de la cible souhaitée - si cela se produit, éteignez les ventilateurs et laissez la lampe chauffante réchauffer doucement l’animal jusqu’à la cible requise.

Dans les deux méthodes, la surveillance physiologique est importante pour assurer un ajustement approprié de la dose anesthésique. Pour un refroidissement prolongé, une dose anesthésique inadéquate peut prolonger la durée du refroidissement. Dans ce cas, la concentration d’isoflurane peut être augmentée jusqu’à ce qu’un taux de refroidissement adéquat soit atteint. Une autre étape critique est l’étalonnage croisé des appareils de température. Lors de l’utilisation d’un tapis chauffant régulé par sonde de température et d’un enregistreur de données dans la même expérience, il est recommandé de croiser l’enregistreur de données avec la sonde rectale, in vivo, car il peut y avoir des variations mineures de la température enregistrée des deux appareils.

Ces méthodes conviennent aux études qui souhaitent explorer l’utilisation de l’hypothermie comme traitement potentiel des troubles neurologiques. L’objectif spécifique de l’étude devrait dicter quelle méthode est utilisée. Les deux méthodes peuvent être classées comme refroidissement de surface systémique, mais la deuxième méthode ne nécessite aucun refroidissement actif. Le modèle de refroidissement progressif décrit ci-dessus a d’importantes applications potentielles pour l’utilisation de l’hypothermie dans le traitement ischémique de l’AVC. L’hypothermie de longue durée et les complications qui en résultent posent un défi aux patients âgés victimes d’un AVC. De plus, la réponse frissonnante rend difficile l’obtention de la température cible chez certains patients¹⁰. Alors que les médicaments anti-frissons peuvent aider à réduire la réponse aux frissons, un refroidissement progressif de courte durée pourrait améliorer plus efficacement le problème. Avoir une période de refroidissement plus courte est également susceptible de réduire l’incidence de la pneumonie souvent rapportée dans les essais. Un autre avantage potentiel de cette méthode de courte durée est que la vitesse de rééwarming peut ne pas être aussi importante par rapport au refroidissement de longue durée. Les études cliniques très précoces sur le refroidissement de longue durée chez les patients victimes d’un AVC présentant de gros infarctus ont révélé qu’un rééchauffage rapide entraînait une forte élévation de la pression intracrânienne (PCI), ce qui aggravait l’issue et était souvent fatal. Cela a conduit au développement de paradigmes de rééwarming progressif, qui ont encore prolongé la durée globale du refroidissement. Le refroidissement de courte durée ne maintient la température cible que pendant une courte période et peut moins probablement entraîner un rebond de l’ICP. Des travaux antérieurs qui ont étudié le traitement de l’hypothermie pour l’élévation de l’ICP, en utilisant un protocole de refroidissement et de rééchuration rapide similaire à ceux décrits ici, n’ont montré aucun rebond de l’élévation de l’ICP après le rééquipillon^23,24.

Les essais cliniques de l’hypothermie pour le traitement de l’AVC ischémique n’ont pas été en mesure de traduire les avantages de l’hypothermie qui sont rapportés dans les études expérimentales. L’inadéquation des vitesses de refroidissement et de la durée entre les modèles expérimentaux et les patients sont des variables importantes qui peuvent expliquer cet écart. Avoir un modèle expérimental d’hypothermie qui ressemble mieux au taux clinique de refroidissement permettra une enquête plus éclairée sur les avantages de l’hypothermie comme mesure de traitement pour les patients victimes d’un AVC.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Éthanol absolu	ThermoFisher Scientific/ Ajax Finechem	AJA214-20LPL	Dilué avec de l’eau désionisée pour donner 70 % d’éthanol
Solution antiseptique (chlorhexidine)	David Craig	A2957
Anesthésique (Marcain)	Aspen	PS13977
Moteur de ventilateur sans balais	Sirocco	YX2505	2 x 12 V/130 mA
Lampe chauffante Reptile	Un	AC220	240 V 50/60 Hz
	FHC, Inc	40-90-2
Sonde rectale	FHC, Inc	40-90-5D-02
Régulateur de température	FHC, Inc	40-90-8D
Enregistreur de données de température	Maxim	DS1922L-F5