Article de méthode

Knock-in de gènes par CRISPR/Cas9 et tri cellulaire dans les lignées de macrophages et de lymphocytes T

DOI :

10.3791/62328

⸱

13 novembre 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Laboratory of Genetic Regulators in the Immune System, School of Laboratory Medicine, Xinxiang Medical University, 2Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Aix Marseille Université

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole utilise des rapporteurs fluorescents et le tri cellulaire pour simplifier les expériences d’entraînement dans les macrophages et les lignées cellulaires T. Deux plasmides sont utilisés pour ces expériences d’entraînement simplifiées, à savoir un plasmide exprimant CRISPR/Cas9 et DsRed2 et un plasmide donneur de recombinaison homologue exprimant EBFP2, qui est intégré en permanence au locus Rosa26 dans les cellules immunitaires.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les études de génomique fonctionnelle du système immunitaire nécessitent des manipulations génétiques qui impliquent à la fois la délétion des gènes cibles et l’ajout d’éléments aux protéines d’intérêt. L’identification des fonctions des gènes dans les modèles de lignées cellulaires est importante pour la découverte de gènes et l’exploration des mécanismes intrinsèques des cellules. Cependant, les manipulations génétiques des cellules immunitaires telles que les cellules T et les lignées cellulaires de macrophages utilisant l’entraînement médié par CRISPR / Cas9 sont difficiles en raison de la faible efficacité de transfection de ces cellules, en particulier dans un état de repos. Pour modifier les gènes dans les cellules immunitaires, la sélection de la résistance aux médicaments et les vecteurs viraux sont généralement utilisés pour enrichir les cellules exprimant le système CRIPSR / Cas9, ce qui entraîne inévitablement une intervention indésirable des cellules. Dans une étude précédente, nous avons conçu des rapporteurs fluorescents doubles couplés à CRISPR / Cas9 qui ont été exprimés transitoirement après électroporation. Cette solution technique conduit à une délétion rapide des gènes dans les cellules immunitaires; cependant, l’inserment de gènes dans les cellules immunitaires telles que les lymphocytes T et les macrophages sans l’utilisation de la sélection de la résistance aux médicaments ou de vecteurs viraux est encore plus difficile. Dans cet article, nous montrons qu’en utilisant le tri cellulaire pour faciliter la sélection de cellules exprimant transitoirement les constructions CRISPR / Cas9 ciblant le locus Rosa26 en combinaison avec un plasmide de donneur, le knock-in de gène peut être réalisé à la fois dans les cellules T et les macrophages sans enrichissement en résistance aux médicaments. À titre d’exemple, nous montrons comment exprimer l’ACE2 humain, un récepteur du SARS-Cov-2, responsable de la pandémie actuelle de Covid-19, dans les macrophages RAW264.7 en effectuant des expériences knock-in. De telles cellules knock-in génétiques peuvent être largement utilisées pour les études mécanistes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les cellules immunitaires sont essentielles à la défense contre les agents pathogènes. L’immunité innée et adaptative est nécessaire pour l’élimination des infectieux et le maintien de l’homéostasie tissulaire1,2. Les modèles de lignées cellulaires sont des outils essentiels pour comprendre les fondements moléculaires du système immunitaire des mammifères; ils sont utilisés dans des tests fonctionnels in vitro, tels que ceux modélisant l’activation des lymphocytes T humains, et pour déterminer la fonction des facteurs génétiques dans l’activation ou l’amortissement des réponses immunitaires3,4. Il est important de noter que le système immunitaire des mammifères est extrêmement hétérogène et, tout aussi important, un grand nombre de molécules contrôlent la différenciation, la migration et la fonction d’une cellule donnée de type5,6.

Les outils d’édition du génome CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)/Cas9 permettent la manipulation génétique de types cellulaires spécifiques, ce qui facilite l’annotation fonctionnelle des gènes de manière précise7,8. Plusieurs protocoles publiés ont décrit l’administration de CRISPR/Cas9 sous la forme de complexes d’ARN guides Cas9 connus sous le nom de ribonucléoprotéines (RRP) dans les cellules HEK293, les lignées cellulaires Jurkat, les cellules T primaires9,10,les macrophages11,12,13,les cellules souches14et d’autres15,16. Dans ces protocoles, le marquage génique est généralement réalisé en fusionnant une étiquette fluorescente à des protéines endogènes17,18. Cependant, peu de tentatives ont été faites pour utiliser des rapporteurs fluorescents doubles, qui sont compatibles avec le tri des cellules uniques, pour faciliter les expériencesknock-in 19,20, en particulier dans les cellules immunitaires.

Les analyses mécanistes approfondies visant à comprendre les fonctions d’un nouveau facteur génétique dans les cellules immunitaires nécessitent généralement la délétion spécifique d’un gène par type cellulaire, des expériences de sauvetage génétique et, idéalement, l’identification de ses interacteurs. Même si des méthodes d’optimisation de la délétion génétique des gènes dans les cellules immunitaires ont été publiées9,15,21, beaucoup moins de méthodes ont été rapportées pour introduire des allèles knock-in avec des fonctions polyvalentes pour comprendre la réponse immunitaire. Par conséquent, dans ce protocole, nous visons à décrire en détail un protocole efficace et hautement reproductible pour exprimer une protéine d’intérêt (POI) au locus refuge Rosa26 dans les lignées cellulaires immunitaires humaines et murines. Nous avons conçu un système rapporteur bicolore pour enrichir les cellules transfectées avec des plasmides exprimant CRISPR/Cas9 (DsRed2) et un modèle d’ADN recombinant (EBFP2), qui peut être isolé par tri cellulaire. Suite à ce protocole, nous avons obtenu plusieurs lignées knock-in de la lignée de cellules T humaines Jurkat et du macrophage murin RAW264.7 pour des analyses fonctionnelles de protéines mal étudiées.

À titre d’exemple, nous montrons dans ce protocole comment obtenir des macrophages RAW264.7 knock-in exprimant de manière stable l’ACE2 humain (un récepteur du SARS-Cov-2)22. Parce que les cellules immunitaires innées sont impliquées dans la pathogenèse du Covid-1923,24 et que l’ACE2 humain est considéré comme un récepteur majeur nécessaire à l’entrée virale dans les cellules avant la réplication, les macrophages avec knock-in de l’ACE2 humain peuvent servir d’outil utile pour les études mécanistes de la multiplication virale à l’intérieur des macrophages. En parallèle, nous présentons également un exemple de knock-in d’un gène au locus humain ROSA26 pour exprimer la protéine RASGRP1, qui a été fusionnée à son extrémité aminée avec une affinité Twin-Strep-tag (OST). Les lymphocytes T sont des cellules cibles clés dans les thérapies immunitaires, et un nombre croissant d’études se sont concentrées sur la manipulation de leur réactivité au cancer25,26. Comme Rasgrp1 est connu pour être une molécule de signalisation clé en aval du récepteur des lymphocytes T et que ses interacteurs ne sont pas bien élucidés27,le modèle d’inserrage OST-RASGRP1 fournit la base pour identifier les interacteurs régulant la réponse des lymphocytes T aux tumeurs et aux infections. Pris ensemble, ces outils peuvent être utilisés pour les études Covid-19 et la découverte de nouvelles molécules interagissant avec Rasgrp1.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Conception et construction plasmidique de sgRNA ciblant rosa26 Locus

  1. Guide de conception des ARN autour du site d’insertion souhaité
    1. S’assurer que le site d’insertion des expériences de frappe de souris Rosa26 (ci-après dénommée mRosa26)est situé dans le premier intron de mRosa26; ce site a été utilisé dans des études antérieures28,29. Pour les expériences d’insertion dans des cellules humaines, assurez-vous que le site d’insertion réside dans le locus humain ROSA26 (ci-après dénommé hROSA26), qui a été identifié comme l’homologue humain de mRosa2630.
    2. Utilisez les séquences génomiques de souris et d’espèces humaines obtenues à partir de Mouse Genome Informatics (http://www.informatics.jax.org/) et du navigateur de génome Ensembl (http://www.ensembl.org/index.html), respectivement. Copiez 50 paires de bases (pb) de la séquence génomique du locus mRosa26 ou hROSA26 de chaque côté flanquant le site d’insertion souhaité.
    3. Guide de conception ARN à l’aide de l’outil Web en ligne CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31. Collez les 100 bp de séquence d’entrée de la version 1.1.2. Sélectionnez deux ARN guides avec un score de spécificité élevé, un score d’efficacité élevé et une faible activité hors cible. De plus, choisissez des guides d’ARN avec des scores Doench plus élevés et évitez ceux étiquetés comme « inefficaces »32.
      REMARQUE: Les outils de conception CRISPR alternatifs sont également précieux et accessibles au public, par exemple l’outil de conception Benchling CRISPR (https://benchling.com/crispr). Pour augmenter la fréquence des cellules mutées médiées par CRISPR/Cas9, sélectionnez deux ARN guides proches du site d’insertion souhaité lorsque cela est possible33.
    4. Pour le locus mRosa26, utilisez deux ARN guides adjacents désignés comme mR26-sg1 (5'- CTCCAGTCTTTCTAGAAGAT -3') et mR26-sg2 (5'- CGCCCATCTTCTAGAAAGAC -3') (Figure 1A). Pour le locus hROSA26, utilisez deux ARN guides adjacents, à savoir hR26-sg1 (5'- GGCGATGACGAGATCACGCG -3') et hR26-sg2 (5'- AATCGAGAAGCGACTCGACA -3') (Figure 1B).
      REMARQUE : Les activités d’édition du génome de mR26-sg1 et mR26-sg2 et celles de hR26-sg1 et hR26-sg2 ont été évaluées dans les cellules RAW264.7 et les cellules Jurkat, respectivement (voir fichier supplémentaire, figure S1).
  2. Clonage de vecteurs d’expression CRISPR contenant de l’ARNg ciblant le locus Rosa26
    1. Synthétiser des oligos avant et arrière pour un ARN guide (voir fichier supplémentaire).
      REMARQUE: Il est préférable d’ajouter un nucléotide « G » au début de la séquence guide, ce qui facilite l’expression pilotée par le promoteur U6. Par exemple, pour cloner le mR26-sg1 susmentionné, l’oligo avant est CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT et l’oligo inverse est AAACATCTTCTAGAAAGACTGGAGC. Le G supplémentaire dans l’oligo avant et son complément dans l’oligo inverse sont indiqués en gras.
    2. Cloner des oligos synthétiques correspondant aux ARN guides dans le vecteur d’expression CRISPR tout-en-un pX458-DsRed2 généré dans notre travail précédent21 (Figure 1C) en utilisant le protocole général de clonage d’ARNg développé par le laboratoire de Zhang (https://www.addgene.org/crispr/zhang/); cependant, sautez l’étape de purification du gel et purifiez le vecteur digéré à l’aide d’un kit de purification par PCR (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE: Dans les protocoles précédents, la purification en gel du vecteur digéré BbsI a été effectuée; cependant, cette étape prend beaucoup de temps. Dans le présent protocole, le produit digéré est purifié à l’aide d’un kit de purification par PCR et utilisé directement pour la réaction de ligature en aval, qui produit généralement des colonies positives avec une efficacité comparable.
    3. Transformer 10 μL du produit de ligature (étape 1.2.2) en 50 μL de cellulescompétentes Escherichia coli DH5α selon les instructions du fabricant. Choisissez au hasard trois colonies dans une plaque de gélose LB avec de l’ampicilline (100 μg / mL) et inoculez chacune dans 3 mL de milieu LB avec de l’ampicilline pour la culture pendant la nuit.
    4. Utilisez 1 mL de la culture bactérienne pendant la nuit pour le séquençage de Sanger et maintenez le reste à 4 °C jusqu’à ce que la construction soit confirmée comme ainsi : pDsR-mR26-sg1 et pDsR-mR26-sg2 pour le locus mRosa26 knock-in, et pDsR-hR26-sg1 et pDsR-hR26-sg2 pour le locus hROSA26.
    5. Préparer une concentration élevée d’ADN plasmidique (environ 2 μg/μL) avec un kit maxiprep pour la purification du plasmide de qualité transfection (voir Tableau des matériaux).

2. Conception et construction de vecteurs de ciblage en tant que modèles de recombinaison homologues

  1. Concevoir un modèle de réparation dirigé par homologie
    1. Concevoir un vecteur de ciblage pour exprimer de manière constitutive le POI à l’aide d’une cassette d’expression optimisée à partir d’une étude précédente29, qui comprend un promoteur hybride CAG, un site de restriction AscI permettant le clonage de l’ADNc du POI, un rapporteur IRES-EBFP2 et un signal de polyadénylation de l’hormone de croissance bovine (bGH-polyA)(Figure 1B et fichier supplémentaire).
    2. Concevoir des bras d’homologie (HAs) qui partagent l’homologie avec les séquences génomiques du locus mRosa26 ou hROSA26. Inclure ~1 kb du 5' HA correspondant à la séquence génomique en amont à partir du site d’insertion souhaité à gauche de la cassette d’expression. De même, inclure ~1 kb du 3' HA correspondant à la séquence génomique en aval du site d’insertion à droite de la cassette d’expression.
      REMARQUE : La cassette d’expression est insérée le plus près possible des sites de clivage CRISPR/Cas934. Pour éviter la recoupe de l’allèle ciblé par CRISPR/Cas9, incorporer des changements nucléotidiques dans la séquence de motifs adjacents au protospacer (PAM) (5'-NGG-3') dans le vecteur de ciblage34,35.
    3. Pour permettre la linéarisation du vecteur de ciblage, insérez un site EcoRI unique juste en amont du 5' HA et un site BamHI unique juste en aval du 3' HA.
    4. Demandez à un fournisseur commercial de synthétiser les vecteurs de ciblage et de les désigner comme pKR26-iBFP et pKhR26-iBFP pour mRosa26 et hROSA26 knock-in, respectivement.
  2. Construire un vecteur de ciblage en tant que modèle de réparation dirigé par homologie
    1. Pour exprimer le POI, obtenez la séquence d’ADNc (séquence codante) à partir du navigateur du génome d’Ensembl et choisissez la transcription possédant la séquence protéique la plus longue. Par exemple, l’ADNc du gène ACE2 humain est ACE2-202 ENST00000427411.2 et l’ADNc du gène RASGRP1 humain est RASGRP1 ENSG00000172575.
    2. Synthétiser l’ADNc du POI avec l’aide d’un fournisseur commercial. Il est également possible de cloner l’ADNc via l’amplification PCR (non décrite ici). Placez la séquence GGCGCGCCACC (5' - 3'), qui comprend un site de restriction AscI (italique et gras) et un site d’initiation de traduction consensuelle Kozak (souligné), immédiatement avant le codon d’initiation ATG de l’ADNc et un autre site de restriction AscI (5'- GGCGCGCC -3') après le codon d’arrêt de l’ADNc.
    3. Digérer la séquence synthétisée avec AscI et purifier à l’aide d’un kit de purification par PCR conçu pour purifier les fragments d’ADN après digestion de restriction, en suivant les instructions du fabricant (voir Tableau des matériaux).
    4. Ligaturez l’insert d’ADNc purifié dans le vecteur dorsal linéarisé AscI pKR26-iBFP ou pKhR26-iBFP à l’aide de la ligase d’ADN T4 en suivant les instructions du fabricant.
    5. Vérifiez le vecteur de ciblage final, pKR26-POI-iBFP ou pKhR26-POI-iBFP, par séquençage. Utilisez maxiprep pour purifier les constructions vérifiées selon le protocole du fabricant.
    6. Digérez le vecteur de ciblage à l’aide d’EcoRI ou de BamHI et purifiez le produit de digestion à l’aide d’un kit de purification par PCR conformément aux instructions du fabricant. Stocker le vecteur de ciblage linéarisé (~0,8 μg/μL) à -20 °C jusqu’à l’électroporation.

3. Électroporation des macrophages et des lignées cellulaires T

  1. Préparer des cultures cellulaires pour l’électroporation
    1. Préparez roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 complété avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) comme milieu de croissance complet pour les cellules T de Jurkat. Préparez le DMEM (Modified Eagle Medium) de Dulbecco avec 10% de FBS pour la culture des macrophages RAW264.7. Compléter tous les milieux de croissance complets avec 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (pen/streptocoque) à l’exception des milieux utilisés pour l’incubation post-transfection avant le tri cellulaire.
    2. Effectuer la sous-culturation des cellules T RAW264.7 et Jurkat conformément aux instructions du fournisseur (voir tableau des matériaux). Lors de la sous-culation de cellules RAW264.7, utilisez une solution de trypsine-EDTA (0,25%) pour détacher les cellules. Utilisez FBS complété par 10% (v / v) de DMSO comme milieu de cryoconservation pour les cellules RAW264.7 et Jurkat.
    3. Prélever des cellules à 250 × g pendant 5 min pour les macrophages RAW264.7 et 90 × g pendant 8 min pour les lymphocytes T de Jurkat. Ensuite, laver avec 5-10 mL de 1× DPBS (sans ions Ca2+ ou Mg2+). Retirez le DPBS.
    4. Resuspendez la pastille de cellule en utilisant 2 mL de 1× DPBS. Utilisez 10 μL de cellules et mélangez avec un volume égal de 0,2 % de bleu de trypan pour estimer le nombre de cellules et la viabilité.
      REMARQUE: Assurez-vous que la culture cellulaire a une viabilité de >90% le jour de la transfection.
    5. Pour une seule expérience d’entraînement, effectuez une électroporation avec des pointes de nucléofection de 10 μL avec cinq répétitions. Calculer le volume nécessaire pour 2,0 × 106 cellules et arouiller les cellules par centrifugation. Lavez à nouveau la pastille de cellule avec 1× DPBS comme décrit à l’étape 3.1.3.
      REMARQUE: Lors de l’utilisation de pointes de nucléofection de 10 μL, 4,0 ×10 5 cellules sont nécessaires par électroporation. En conséquence, préparez au moins 2,0 × 106 cellules pour une expérience knock-in.
    6. Préparer une plaque de 24 puits avec 0,5 mL de milieu de croissance complet (préparé à l’étape 3.1.1) par puits sans stylo/streptocoque et prépuce dans un incubateur à 37 °C.
  2. Électroporation des composants CRISPR/Cas9 et du vecteur de ciblage
    1. Allumez le système d’électroporation. Utiliser des paramètres d’électroporation optimisés dans une étude précédente21: 1 400 V/20 ms/2 impulsions pour les macrophages RAW264,7 et 1350 V/20 ms/2 impulsions pour les lymphocytes T Jurkat.
    2. En tenant compte de la perte d’échantillon due au pipetage, préparez un mélange d’électroporation de 55 μL dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL contenant 2,5 μg de chaque vecteur CRISPR/Cas9, 2,4 μg du vecteur de ciblage linéarisé et le tampon de remise en pension R.
      REMARQUE: Pour gagner du temps, le mélange d’électroporation peut être préparé pendant la centrifugation (étape 3.1.5).
    3. Remise en × 2.0 de 106 cellules (préparées à l’étape 3.1.5) dans le mélange d’électroporation de 55 μL de l’étape 3.2.2.
    4. Aspirer le mélange cellule/électroporation de l’étape 3.2.3 à l’aide d’une pointe de nucléofection de 10 μL avec une pipette.
      REMARQUE: Pendant le pipetage, évitez d’introduire des bulles d’air, ce qui peut provoquer une défaillance de l’électroporation.
    5. Ajouter l’échantillon dans un tube rempli de 3 mL de buffer E du kit d’électroporation.
    6. Appliquez les paramètres d’électroporation pour les deux types de cellules comme décrit à l’étape 3.2.1.
    7. Transférer l’échantillon dans un puits de la plaque de 24 puits avec un milieu préchavenu à partir de l’étape 3.1.6.
    8. Répétez les étapes 3.2.4 à 3.2.7 pour les quatre autres répétitions ainsi que pour les contrôles du vecteur de ciblage uniquement et du vecteur d’expression CRISPR uniquement.
      REMARQUE: Changez la pointe de nucléofection et le tube lors du passage à un autre type de cellule / ADN plasmidique.
    9. Culture des cellules transfectées pendant 48 à 72 h pour permettre la récupération après électroporation et expression des composants CRISPR/Cas9 avant l’analyse de cytométrie en flux ou le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Examiner l’expression de DsRed2 à l’aide d’un microscope fluorescent équipé d’un canal rouge 24 h après la transfection.
      REMARQUE: Un avantage de la surveillance des cellules fluorescentes DsRed2 est que l’efficacité de l’électroporation peut être estimée et que l’aptitude à un tri ultérieur des cellules peut être prédite.

4. Tri des cellules pour isoler les cellules knock-in putatives

  1. Avant le tri FACS, lavez les cellules transfectées une fois avec un milieu de croissance complet. Cellules à granulés par centrifugation comme décrit à l’étape 3.1.3 et remise enssusser les granulés dans 500 μL de milieu frais.
  2. Réglez le trieur de cellules (situé dans une armoire de biosécurité) avec une buse de 85 μm et un faible débit. Sélectionnez le mode « cellule unique » pour le tri et testez l’efficacité et la précision du tri à cellule unique en triant 20 à 30 cellules sur le couvercle d’une microplaque de 96 puits. Une gouttelette localisée au centre de chaque puits indique la bonne configuration de l’instrument.
  3. Transférer la suspension cellulaire de l’étape 4.1 dans des tubes FACS stériles et ajouter SYTOX Red Dead Cell Stain à une concentration finale de 1 nM.
  4. Analysez les échantillons sur le trieur de cellules. SYTOX Red et EBFP2 sont excités par un laser de 405 nm et détectés par les canaux V450/BV421 et APC, respectivement. DsRed2 est excité par un laser de 488 nm et détecté par le canal PE. Utilisez des cellules non transfectées et des cellules positives uniques EBFP2 et DsRed2 comme témoins de la compensation spectrale.
  5. Trier 10 cellules individuelles dans chaque puits d’une microplaque de 96 puits contenant 150 μL par puits de milieu de croissance complet préchauffé. Utilisez des microplaques à fond rond pour cultiver des lignées cellulaires de suspension telles que les cellules T Jurkat et des microplaques à fond plat pour les macrophages RAW264.7 adhérents.
    REMARQUE: Le tri de 10 cellules par puits est une stratégie optimisée pour améliorer la survie cellulaire et minimiser le nombre de microplaques de 96 puits qui doivent être ensemencées et le nombre d’échantillons qui doivent être examinés par cytométrie en flux et génotypage; si vous ne triez qu’une seule cellule par puits, l’ensemencement de plus de microplaques est nécessaire pour augmenter les chances d’obtenir des cellules correctement modifiées.

5. Dépistage et validation des cellules knock-in positives

  1. Dépistage des cellules knock-in candidates par cytométrie en flux
    1. Incuber les cellules à partir de l’étape 4.5 pendant 10-15 jours et ajouter un milieu de croissance complet tous les 3 jours pour remplacer le liquide perdu par évaporation. Pour les lymphocytes T de Jurkat, transférez les cellules cultivées dans la plaque de 96 puits à fond rond vers une plaque à fond plat pour optimiser la prolifération cellulaire.
    2. Transférez les cellules triées expansées dans des plaques de 48 puits pour une expansion ultérieure.
    3. Lorsque les cellules sont proches de la confluence, utilisez la moitié de la culture pour dépister l’expression d’EBFP2 par cytométrie en flux (Figure 3). Normalement, la moitié de la culture dans une plaque de 48 puits après une croissance confluente équivaut à 0,5-1,0 × 105 cellules, ce qui est suffisant pour l’analyse d’un échantillon par cytométrie en flux.
    4. Transférer les cellules restantes dans des plaques de 24 puits pour une prolifération ultérieure.
    5. Conserver les populations de cellules candidates possédant un pourcentage élevé de cellules EBFP2 positives pour d’autres expériences de génotypage.
      REMARQUE: Étant donné que 10 cellules sont triées dans chaque puits de la microplaque de 96 puits, il est possible que les cellules knock-in se développent avec des cellules qui n’expriment pas le gène knock-in. Par conséquent, il est normal d’effectuer un cycle supplémentaire de tri cellulaire pour séparer les cellules POSITIVES EBFP2 des cellules négatives.
  2. Dépistage des cellules knock-in candidates par PCR et séquençage
    1. Prélever 2 × 105 cellules candidates. Extraire l’ADN génomique à l’aide d’un kit de préparation de l’ADN (voir tableau des matériaux).
    2. Pour vérifier que la réparation précise dirigée par homologie (HDR) s’est produite au locus mRosa26 plutôt qu’à des sites aléatoires dans le génome des cellules knock-in candidates, effectuez une PCR avec des amorces couvrant chaque côté des HAs (Figure 4). Choisissez une amorce située dans la région génomique à l’extérieur du vecteur de ciblage (oligo externe) et une autre amorce située à l’intérieur du vecteur de ciblage (oligo interne).
      REMARQUE: Une conception similaire est utilisée pour vérifier HDR au locus hROSA26. Les amorces PCR peuvent également être facilement conçues pour détecter l’insertion de la séquence POI. De plus, les génotypes des allèles de type sauvage et des génotypes knock-in peuvent être détectés simultanément à l’aide de la PCR à trois amorces (voir fichier supplémentaire, figure S2).
    3. Clonez les produits PCR positifs à l’aide d’un kit de clonage rapide (voir Tableau des matériaux). Transformer le mélange réactionnel en cellules compétentes DH5α.
    4. Choisissez au hasard 8 à 10 colonies bactériennes individuelles par transformation et séquencez les produits de PCR à partir de l’étape 5.2.3 par séquençage de Sanger.
  3. Validation des cellules knock-in positives par analyse immunoblot et purification d’affinité
    NOTE: Les cellules candidates sont soumises à une analyse immunoblot pour la validation de l’insertion du POI, ou purification d’affinité (AP) pour les études d’interaction protéine-protéine.
    1. Effectuer une analyse immunoblot conformément aux instructions du fabricant de l’anticorps. Voir le tableau des matériaux pour plus d’informations sur l’utilisation des anticorps primaires et des anticorps secondaires.
    2. Soumettre les lysates des cellules knock-in exprimant le POI marqué OST à l’AP à l’aide de billes de streptocoque-tactine sépharose en suivant les instructions du fabricant (voir tableau des matériaux).
    3. Détectez la chimiluminescence à l’aide d’un imageur.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Suivant le protocole décrit ci-dessus pour effectuer des expériences knock-in au locus mRosa26 en utilisant des macrophages murins RAW264.7, nous avons conçu un vecteur de ciblage pour exprimer l’ACE2 humain, un récepteur du virus SARS-Cov-2(Figure 2A). En utilisant une conception similaire, nous avons généré des cellules T Jurkat humaines avec l’apport de la protéine de fusion RASGRP1 marquée OST (Figure 2C). Après la transfection de trois plasmides, d...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans nos expériences, nous avons démontré comment effectuer l’édition knock-in dans les cellules immunitaires, de la conception de la construction au criblage et à la validation des cellules knock-in, en utilisant les cellules T Jurkat humaines et les macrophages murins RAW264.7 à titre d’exemples. Les lignées cellulaires de lymphocytes T et de macrophages sont résistantes à la transfection36,37; cependant, le problème de la faible efficacité de la livraison CRIS...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions l’installation centrale de cytométrie en flux de l’Université médicale de Xinxiang. Le développement de cette technologie a été soutenu par des subventions de la NSFC 81601360 à LZ, 81471595 et 32070898 à YL. Le travail est également soutenu par la Fondation du Comité éducatif du Henan n ° 21IRTSTHN030.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Amersham Imager 600Ge Imagerie médicalede chimiluminescence
Ampicilline, sel de sodiumMP Biomedicals194526
IgG anti-lapin, HRP-linked Anticorps CellSignaling Technology7074à dilution 1/5000
Anticorps anti-RasGRP1, clone 10.1MerckMABS1461.0 &mu ; g/mL de concentration de travail
AscINew England BioLabsR0558S
&beta ;-Actin (D6A8) Rabbit mAbCell Signaling Technology8457à dilution 1/1000
BamHI-HFNew England BioLabsR3136S
BbsI-HFNew England BioLabsR3539S
Cellometer Mini Compteur de Cellules AutomatiséNexcelom Bioscience
E.coli DH5&alpha ; Cellules compétentesTakara9057
DMSO (Dimethyl Sulfoxyde)MP Biomedicals196055
DNeasy Blood & Kits de tissusQiagen69506réactif de culture cellulaire
DPBS (10X), sans calcium, sans magnésiumThermoFisher Scientific14200075
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec haute teneur en glucoseHyCloneSH30022.01
EcoRI-HFNew England BioLabsR3101S
FACSAria&commerce ; FusionBD Bioscienceséquipé d’une armoire de biosécurité
FACS Cytomètre en flux CantoBD Biosciences
Falcon 5 ml polystyrène tube à essai à fond rondBD Biosciences352003
Sérum fœtal bovin (FBS)ThermoFisher Scientific10099141
FlowJo version 10.7BD Biosciences
GAPDH (D16H11) XP  ; Technologiede signalisation cellulaire5174à dilution 1/1000
Anticorps secondaire anti-IgG (H+L) de chèvre, HRPThermoFisher Scientific31430à dilution 1/5000
Immobilon ECL Ultra Western HRP SubstratMilliporeWBKLS0500
Immobilon-PSQ Membrane PVDFMilliporeISEQ00010
JurkatATCCTIB-152https://www.atcc.org/
Sulfate de kanamycineMP Biomedicals194531
géloseThermoFisher Scientific22700041
Pipette multicanaux (30-300 &mu ; L)Eppendorf, ou similaire Système de
transfection au néonThermoFisher ScientificMPK5000
Système de transfection au néon, 10 &mu ; Kit LThermoFisher ScientificMPK1096
Nunc 15 mL Tubes à centrifuger stériles coniquesThermoFisher Scientific339651
OneTaq® ; Démarrage à chaud Chargement rapide® ; 2X Master MixNew England BioLabs(M0489)pour modèle à haut pourcentage
de GC PageRuler Échelle de protéines précolorées, 10 à 180 kDaThermoFisher Scientific26616
Pointe de pipette 0,1-20µ ; lEppendorf, ou similaire0030 075.005
Pointe de pipette 2-200µ ; lEppendorf, ou similaire0030 075.021
Pointe de pipette 50-1000µ ; lEppendorf, ou similaire0030 075.064
Plasmide Maxi KitQiagen12163
pX458-DsRed2Addgene112219
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104purifier le plasmide de la digestion par restriction
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNew England BioLabsM0494S
RAW264.7ATCCTIB-71https://www.atcc.org/
Anticorps recombinant anti-ACE2 [EPR4435(2)]Abcamab108252à dilution 1/1000
RPMI 1640 MediumHyCloneSH30027.01
Strep-Tactin Perles de sépharoseIBA Lifesciences2-1201-010
Pénicilline-StreptomycineThermoFisher Scientific15140122
SYTOX&commerce ; Coloration rouge des cellules mortes, pour une excitation de 633 ou 635 nmThermoFisher ScientificS34859
T4 DNA ligaseNew England BioLabsM0202S
T4 Polynucléotide KinaseNew England BioLabsM0201S
Trypan Blue Solution, 0,4 %ThermoFisher Scientific15250061
Trypsine-EDTA solution (0,25 %), avec rouge de phénolThermoFisher Scientific25200056
ZOE Fluorescent Cell ImagerBio-Rad
1,5 mL microtubes, PCR-cleanEppendorf ou similaire0030 125.215
24 puits transparents traités TC PlaquesCorning3524
Microplaques transparentes à fond plat 96 puits traitées TCCorning3599
Microplaque à fond rond transparent à 96 puits traitée TCCorning3799
mAb de lapin LB poudre de multiples

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cronkite, D. A., Strutt, T. M. The Regulation of Inflammation by Innate and Adaptive Lymphocytes. Journal of Immunology Research. 2018, 1467538(2018).
  2. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Control of adaptive immunity by the innate immune system. Nature Immunology. 16 (4), 343-353 (2015).
  3. Chicaybam, L., et al. An Efficient Electroporation Protocol for the Genetic Modification of Mammalian Cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99(2016).
  4. Manguso, R. T., et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 547 (7664), 413-418 (2017).
  5. Siggs, O. M. Dissecting mammalian immunity through mutation. Immunology and Cell Biology. 92 (5), 392-399 (2014).
  6. Satija, R., Shalek, A. K. Heterogeneity in immune responses: from populations to single cells. Trends in Immunology. 35 (5), 219-229 (2014).
  7. Shui, B., Hernandez Matias, L., Guo, Y., Peng, Y. The Rise of CRISPR/Cas for Genome Editing in Stem Cells. Stem Cells International. 2016, 8140168(2016).
  8. Komor, A. C., Badran, A. H., Liu, D. R. CRISPR-Based Technologies for the Manipulation of Eukaryotic Genomes. Cell. 168 (1-2), 20-36 (2017).
  9. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (3), 985-997 (2018).
  10. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein Transfection for CRISPR/Cas9-Mediated Gene Knockout in Primary T Cells. Current Protocols in Immunology. 124 (1), 69(2019).
  11. Lee, Y. W., et al. In Vivo Editing of Macrophages through Systemic Delivery of CRISPR-Cas9-Ribonucleoprotein-Nanoparticle Nanoassemblies. Advances in Therapy (Weinh). 2 (10), (2019).
  12. Freund, E. C., et al. Efficient gene knockout in primary human and murine myeloid cells by non-viral delivery of CRISPR-Cas9. Journal of Experimental Medicine. 217 (7), (2020).
  13. Huang, R., et al. The three members of the Vav family proteins form complexes that concur to foam cell formation and atherosclerosis. Journal of Lipid Research. 60 (12), 2006-2019 (2019).
  14. Scharenberg, S. G., et al. Engineering monocyte/macrophage-specific glucocerebrosidase expression in human hematopoietic stem cells using genome editing. Nature Communications. 11 (1), 3327(2020).
  15. Jacobi, A. M., et al. Simplified CRISPR tools for efficient genome editing and streamlined protocols for their delivery into mammalian cells and mouse zygotes. Methods. 121-122, 16-28 (2017).
  16. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  17. Haupt, A., Grancharova, T., Arakaki, J., Fuqua, M. A., Roberts, B., Gunawardane, R. N. Endogenous Protein Tagging in Human Induced Pluripotent Stem Cells Using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (138), (2018).
  18. Li, S., Xue, H., Long, B., Sun, L., Truong, T., Liu, Y. Efficient generation of hiPSC neural lineage specific knockin reporters using the CRISPR/Cas9 and Cas9 double nickase system. Journal of Visualized Experiments. (99), e52539(2015).
  19. Schumann, K., et al. Generation of knock-in primary human T cells using Cas9 ribonucleoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10437-10442 (2015).
  20. Hamilton, J. R., et al. Targeted delivery of CRISPR-Cas9 and transgenes enables complex immune cell engineering. Cell Reports. 35 (9), 109207(2021).
  21. Luo, J., et al. Speed genome editing by transient CRISPR/Cas9 targeting and large DNA fragment deletion. Journal of Biotechnology. 281, 11-20 (2018).
  22. Bourgonje, A. R., et al. Angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), SARS-CoV-2 and the pathophysiology of coronavirus disease. Journal of Pathology. 251 (3), 228-248 (2020).
  23. Schultze, J. L., Aschenbrenner, A. C. COVID-19 and the human innate immune system. Cell. 184 (7), 1671-1692 (2021).
  24. Taefehshokr, N., Taefehshokr, S., Hemmat, N., Heit, B. Covid-19: Perspectives on Innate Immune Evasion. Frontiers in Immunology. 11 (2549), (2020).
  25. Waldman, A. D., Fritz, J. M., Lenardo, M. J. A guide to cancer immunotherapy: from T cell basic science to clinical practice. Nature Reviews: Immunology. 20 (11), 651-668 (2020).
  26. Chandran, S. S., Klebanoff, C. A. T cell receptor-based cancer immunotherapy: Emerging efficacy and pathways of resistance. Immunological Reviews. 290 (1), 127-147 (2019).
  27. Dower, N. A., et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling. Nature Immunology. 1 (4), 317-321 (2000).
  28. Soriano, P. Generalized lacZ expression with the ROSA26 Cre reporter strain. Nature Genetics. 21 (1), 70-71 (1999).
  29. Chu, V. T., et al. Efficient generation of Rosa26 knock-in mice using CRISPR/Cas9 in C57BL/6 zygotes. BMC Biotechnology. 16, 4(2016).
  30. Irion, S., Luche, H., Gadue, P., Fehling, H. J., Kennedy, M., Keller, G. Identification and targeting of the ROSA26 locus in human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (12), 1477-1482 (2007).
  31. Concordet, J. -P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46, 242-245 (2018).
  32. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  33. Jang, D. E., et al. Multiple sgRNAs with overlapping sequences enhance CRISPR/Cas9-mediated knock-in efficiency. Experimental and Molecular Medicine. 50 (4), 1-9 (2018).
  34. Miura, H., Quadros, R. M., Gurumurthy, C. B., Ohtsuka, M. Easi-CRISPR for creating knock-in and conditional knockout mouse models using long ssDNA donors. Nature Protocols. 13 (1), 195-215 (2018).
  35. Paix, A., Rasoloson, D., Folkmann, A., Seydoux, G. Rapid Tagging of Human Proteins with Fluorescent Reporters by Genome Engineering using Double-Stranded DNA Donors. Current Protocols in Molecular Biology. 129 (1), 102(2019).
  36. Ebert, O., et al. Lymphocyte apoptosis: induction by gene transfer techniques. Gene Therapy. 4 (4), 296-302 (1997).
  37. Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. The expression of exogenous genes in macrophages: obstacles and opportunities. Methods in Molecular Biology. 531, 123-143 (2009).
  38. Chu, V. T., et al. Efficient CRISPR-mediated mutagenesis in primary immune cells using CrispRGold and a C57BL/6 Cas9 transgenic mouse line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (44), 12514-12519 (2016).
  39. Banan, M. Recent advances in CRISPR/Cas9-mediated knock-ins in mammalian cells. Journal of Biotechnology. 308, 1-9 (2020).
  40. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2017).
  41. Bukhari, H., Müller, T. Endogenous Fluorescence Tagging by CRISPR. Trends in Cell Biology. 29 (11), 912-928 (2019).
  42. Koch, B., Nijmeijer, B., Kueblbeck, M., Cai, Y., Walther, N., Ellenberg, J. Generation and validation of homozygous fluorescent knock-in cells using CRISPR-Cas9 genome editing. Nature Protocols. 13 (6), 1465-1487 (2018).
  43. Abraham, R. T., Weiss, A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm. Nature Reviews Immunology. 4 (4), 301-308 (2004).
  44. Freen-van Heeren, J. J. -, Popović, B., Guislain, A., Wolkers, M. C. Human T cells employ conserved AU-rich elements to fine-tune IFN-γ production. European Journal of Immunology. 50 (7), 949-958 (2020).
  45. Roncagalli, R., et al. The scaffolding function of the RLTPR protein explains its essential role for CD28 co-stimulation in mouse and human T cells. Journal of Experimental Medicine. 213 (11), 2437-2457 (2016).
  46. He, L., et al. ARHGAP45 controls naïve T- and B-cell entry into lymph nodes and T-cell progenitor thymus seeding. EMBO Reports. 22 (4), 52196(2021).
  47. Sadelain, M., Papapetrou, E. P., Bushman, F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome. Nature Reviews: Cancer. 12 (1), 51-58 (2011).
  48. Papapetrou, E. P., Gene Schambach, A. Insertion Into Genomic Safe Harbors for Human Gene Therapy. Molecular Therapy. 24 (4), 678-684 (2016).
  49. Wang, X., et al. A transgene-encoded cell surface polypeptide for selection, in vivo tracking, and ablation of engineered cells. Blood. 118 (5), 1255-1263 (2011).
  50. Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Insertion CRISPR Cas9Lign es cellulaires de macrophagesLocus Rosa26Protocole d lectroporationRapporteurs fluorescentsRecombinaison homologueCytom trie en flux

Articles connexes