Article de méthode

Imagerie dynamique des lymphocytes T récepteurs de l’antigène chimérique avec [18F]Tomographie par émission de positons tétrafluoroborates/Tomodensitométrie

DOI :

10.3791/62334

⸱

17 février 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Hematology, Mayo Clinic, 3Department of Radiology, Mayo Clinic, 4Regenerative Sciences PhD, Mayo Clinic, 5Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 6Department of Immunology, Mayo Clinic

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la méthodologie de suivi non invasif des lymphocytes T génétiquement modifiés pour exprimer les récepteurs d’antigènes chimériques in vivo avec une plate-forme cliniquement disponible.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les lymphocytes T génétiquement modifiés pour exprimer les récepteurs de l’antigène chimérique (CAR) ont montré des résultats sans précédent dans des essais cliniques pivots chez des patients atteints de tumeurs malignes à cellules B ou de myélome multiple (MM). Cependant, de nombreux obstacles limitent l’efficacité et interdisent l’utilisation généralisée des thérapies à base de cellules CAR-T en raison d’un mauvais trafic et d’une infiltration dans les sites tumoraux ainsi que d’un manque de persistance in vivo. De plus, les toxicités potentiellement mortelles, telles que le syndrome de libération de cytokines ou la neurotoxicité, sont des préoccupations majeures. L’imagerie et le suivi efficaces et sensibles des cellules CAR-T permettent l’évaluation du trafic, de l’expansion et de la caractérisation in vivo des lymphocytes T et permettent le développement de stratégies pour surmonter les limites actuelles de la thérapie cellulaire CAR-T. Cet article décrit la méthodologie pour incorporer le symporteur d’iodure de sodium (NIS) dans les cellules CAR T et pour l’imagerie des cellules CAR T en utilisant la tomographie par émission de tétrafluoroborate-positron [18F] ([18F]TFB-PET) dans des modèles précliniques. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres constructions CAR et gènes cibles en plus de ceux utilisés pour cette étude.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La thérapie cellulaire par récepteur T de l’antigène chimérique (CAR T) est une approche émergente et potentiellement curative dans les hémopathies malignes1,2,3,4,5,6. Des résultats cliniques extraordinaires ont été rapportés après une thérapie par cellules CAR T (CART19) dirigée par CD19 ou par antigène de maturation des cellules B (BCMA)2. Cela a conduit à l’approbation par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis des cellules CART19 ....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole suit les lignes directrices du comité d’examen institutionnel de la clinique Mayo, du comité de biosécurité institutionnel et du comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la clinique Mayo.

1. Production de cellules NIS+ BCMA-CAR T

REMARQUE : Ce protocole suit les lignes directrices du Comité d’examen institutionnel de la Mayo Clinic (CISR 17-008762) et du Comité de biosécurité institutionnelle (IBC Bios00000006.04).

  1. Production de BCMA-CAR, NIS et de lentivirus codant pour la protéine fluorescente vert luciférase (GFP).
    NOTE: Une construction BCMA-CAR de de....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La figure 1 représente les étapes de génération des cellules NIS+BCMA-CAR T. Le jour 0, isolez les PBMC, puis isolez les lymphocytes T par sélection négative. Ensuite, stimulez les lymphocytes T avec des billes anti-CD3/CD28. Le jour 1, transduire les lymphocytes T avec les lentivirus NIS et BCMA-CAR. Aux jours 3, 4 et 5, comptez les lymphocytes T et nourrissez-les avec un milieu pour ajuster la concentration à 1,0 × 106/mL. Pour les lymphocytes T transduites par NIS, a.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit une méthodologie pour incorporer le NIS dans les cellules CAR T et l’imagerie des cellules CAR T perfusées in vivo par [18F]TFB-PET. Comme preuve de concept, les cellules NIS+BCMA-CAR T ont été générées par double transduction. Nous avons récemment signalé que l’incorporation de NIS dans les cellules CAR-T n’altère pas les fonctions et l’efficacité des cellules CAR-T in vivo et permet le trafic et l’expansion des cellules CAR-T30. Alors qu.......

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SSK est un inventeur de brevets en immunothérapie CAR sous licence Novartis (par le biais d’un accord entre Mayo Clinic, l’Université de Pennsylvanie et Novartis) et Mettaforge (par l’intermédiaire de Mayo Clinic). RS, MJC et SSK sont des inventeurs de brevets dans le domaine de l’immunothérapie CAR qui sont concédés sous licence à Humanigen. SSK reçoit des fonds de recherche de Kite, Gilead, Juno, Celgene, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis, Leahlabs et Lentigen. Les figures ont été créées avec BioRender.com.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été en partie soutenu par le pipeline K2R de la Mayo Clinic (SSK), le Mayo Clinic Center for Individualized Medicine (SSK) et la Predolin Foundation (RS). Les figures 1, 2 et 4 ont été créées avec BioRender.com.

....

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille de calibre 22Covidien8881250206
Seringue à insuline de calibre 28BD329461
plaque à 96 puitsCorning3595
Anti-humain (ETNL) NISImanisREA009L’anticorps ETNL se lie à l’extrémité C-terminale cytosolique de NIS
BCMA anti-humain, clone 19F2, PE-Cy7BioLegend357507Anticorps Flow
Anti-humain CD45, clone HI30, BV421BioLegend304032Anticorps
anti-flux Anti-souris CD45, clone 30-F11, APC-Cy7BioLegend103116Anticorps
anti-lapin IgGR& DF0110Anticorps secondaire pour la coloration des NIS
Construction BCMA-CAR, IDT de deuxième génération, Coralville, IA
BD  ; Kit de solution de fixation/perméabilisation Cytofix/CytopermBD554714
CD3 Anticorps monoclonaux (OKT3), PE, eBioscienceInvitrogen12-0037-42
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28Gibco40203D
CytoFLEX System  ; B5-R3-V5Beckman CoulterC04652Cytomètre
en flux Diméthyl sulfoxydeMillipore SigmaD2650-100ML
Seringues jetables avec embouts Luer-LokBD309646
D-Luciférin, Sel de potassiumBiotechnologie d’orLUCK-1G
D-PBS (Saline tamponnée au phosphate de Dulbecco)Gibco14190-144
Dulbecco’s Phosphate-Buffered SalineGibco14190-144
Dynabeads MPC-S (concentrateur de particules magnétiques)Applied BiosystemsA13346
Easy 50 EasySep MagnetSTEMCELL Technologies18002
EasySep Human T Cell Isolation KitSTEMCELL Technologies17951Sélection négative billes magnétiques ; 17951RF comprend des pointes et tampon
Sérum fœtal bovinMillipore SigmaF8067
Chèvre anti-souris IgG (H+L) Anticorps secondaire adsorbé croisé, Alexa Fluor 647InvitrogenA-21235
Inveon Multiple Modality Scanner PET/CTSiemens Medical Solutions USA, Inc.10506989 VFT 000 03
Isoflurane liquidePiramal Critical Care66794-017-10
IVIS Lumina S5 Système d’imageriePerkinElmerCLS148588
IVIS® ; Système d’imagerie in vivoSpectrum PerkinElmer  ;
Lipofectamine 3000 Réactif de transfectionInvitrogenL3000075
LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes Aqua fixable, pour excitation 405 nmInvitrogenL34966
LymphoprepSTEMCELL Technologies07851
Filtre à vide Nalgene Rapid-Flow 500 mL, 0,22 uM, stérileThermo Scientific450-0020
Filtre à vide Nalgene Rapid-Flow 500 mL, 0,45 uM, stérileThermo Scientific450-0045
NOD. Cg-Prkdcscid  ; Il2rgtm1Wjl/SzJJackson laboratoire05557
OPM-2DSMZCRL-3273lignée cellulaire du myélome multiple
pBMN(CMV-copGFP-Luc2-Puro)Addgene80389vecteur lentiviral codant pour la luciférase-GFP
Pénicilline-Streptomycine-Glutamine (100x), LiquideGibco10378-016
Logiciel PMODPMODPBAS et P3D
Pool Human AB Serum Plasma Derived RechercheinnovanteIPLA-SERAB-H-100ML
Dichlorhydrate de puromycineMP Biomedicals, Inc.
RoboSep-SSTEMCELL Technologies21000Séparateur de cellules entièrement automatisé
RPMI (Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium)Gibco21870-076
SepMate-50 (IVD)STEMCELL Technologies85450Tubes de séparation à gradient
de densité Azoture de sodium, 5 % (p/v)Ricca Chemical7144.8-16
Fiole T175Corning353112
Terrell (isoflurane, USP)Piramal Critical Care Inc66794-019-10
Webcol Alcohol PrepCovidien6818
X-VIVO 15 Milieu cellulaire hématopoïétique sans sérumLonza04-418Q
1242620210055210

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Porter, D. L., et al. Chimeric antigen receptor T cells persist and induce sustained remissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia. Science Translational Medicine. 7 (303), (2015).
  2. Raje, N., et al.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Cellules T CARImagerie TEP TDMSymporteur d iodure de sodiumMigration des cellules TExpansion des cellules TCytom trie en fluxTransduction lentiviraleIsolement des cellules TPrise de greffe dans la moelle osseuseImagerie par bioluminescence

Articles connexes