Ici, nous présentons un protocole pour générer un modèle de peau tridimensionnel simplifié et indifférencié à l’aide d’une plate-forme microfluidique micro-usinée. Une approche à flux parallèle permet le dépôt in situ d’un compartiment dermique pour l’ensemencement de cellules épithéliales sur le dessus, le tout contrôlé par des pompes à seringues.
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Article de méthode
Génération d’un modèle tridimensionnel simplifié de peau sur puce dans une plate-forme microfluidique micro-usinée
Dans cet article
Résumé
Résumé
Ce travail présente une nouvelle plate-forme microfluidique rentable et fiable avec le potentiel de générer des tissus multicouches complexes. Comme preuve de concept, une peau humaine simplifiée et indifférenciée contenant un compartiment dermique (stromale) et un compartiment épidermique (épithélial) a été modélisée. Pour ce faire, un dispositif polyvalent et robuste à base de vinyle divisé en deux chambres a été développé, surmontant certains des inconvénients présents dans les dispositifs microfluidiques à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour des applications biomédicales, tels que l’utilisation d’équipements coûteux et spécialisés ou l’absorption de petites molécules et protéines hydrophobes. De plus, une nouvelle méthode basée sur l’écoulement parallèle a été développée, permettant le dépôt in situ des compartiments dermique et épidermique. La construction de la peau se compose d’une matrice de fibrine contenant des fibroblastes primaires humains et d’une monocouche de kératinocytes immortalisés ensemencés sur le dessus, qui est ensuite maintenue dans des conditions de culture dynamique. Cette nouvelle plateforme microfluidique ouvre la possibilité de modéliser les maladies de la peau humaine et d’extrapoler la méthode pour générer d’autres tissus complexes.
Introduction
Récemment, des progrès ont été réalisés dans le développement et la production de modèles de peau humaine in vitro pour l’analyse de la toxicité des produits cosmétiques et pharmaceutiques1. Les chercheurs des industries pharmaceutiques et des soins de la peau ont utilisé des animaux, les souris étant les plus courantes, pour tester leurs produits2,3,4,5. Cependant, tester des produits sur des animaux n’est pas toujours prédictif de la réponse chez l’homme, ce qui conduit fréquemment à une défaillance du médi....
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Protocole
1. Paramètres de conception de la puce et de micro-usinage
- Concevoir les couches de puces microfluidiques avec le logiciel de conception open source FreeCAD; reportez-vous au tableau 1 pour connaître les dimensions des canaux. Inclure quatre trous de 2,54 mm de diamètre dans la conception pour utiliser un aligneur sur mesure pour une superposition de couche correcte.
| Longueur (μm) | Largeur (μm) | |
| Chambre basse | 28,400 | 800 |
| Chambre haute |
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Résultats
La puce conçue est composée de deux chambres fluidiques séparées par une membrane PC de 5 μm de taille de pore qui permet la croissance de la cellule en permettant le passage de molécules favorisant la croissance de la chambre inférieure. La chambre supérieure contient la construction tissulaire, dans ce cas, une monocouche de hBC sur un hydrogel de fibrine contenant des hFB.
La hauteur des canaux est déterminée par le nombre de feuilles adhésives ajoutées à chaque canal. La chambre inférieure.......
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Discussion
La motivation pour développer cette méthode était le désir de modéliser les maladies de la peau et d’étudier les effets de thérapies nouvelles et innovantes dans une plate-forme à haut débit. À ce jour, ce laboratoire produit ces équivalents dermo-épidermiques en coulant - manuellement ou à l’aide de la technologie de bio-impression 3D - le gel de fibrine avec des fibroblastes dans une plaque d’insertion de culture cellulaire et en ensemençant les kératinocytes dessus. Une fois que les kératinocytes atteignent la conflue.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.
Remerciements
Nous remercions sincèrement le Dr Javier Rodríguez, le Dr María Luisa López, Carlos Matellán et Juan Francisco Rodríguez pour leurs suggestions, discussions et/ou données préliminaires très utiles. Nous remercions également les contributions de Sergio Férnandez, Pedro Herreros et Lara Stolzenburg à ce projet. Nous remercions tout particulièrement la Dre Marta García pour les hFB et les hKC étiquetés GFP. Enfin, nous reconnaissons l’excellente assistance technique de Guillermo Vizcaíno et Angélica Corral. Ce travail a été soutenu par le « Programa de Actividades de I+D entre Grupos de Investigación de la Comunidad de Madrid », Projet S2018/BAA-4480, Biopieltec-CM. Ce t....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Amchafibrin | Rottafarm | Acide tranexamique | |
| Antibiotique/antimycosique | Thermo Scientific HyClone | ||
| Chlorure de calcium | Sigma Aldrich | ||
| Plaques de culture | Fisher | ||
| DMEM | Invitrogen Life Technologies | ||
| Ruban adhésif double face vynil | ATP Systèmes adhésifs | GM 107CC, 12 et micro ; m thick | |
| Traceur de bord | Brother | Scanncut CM900 | |
| FBS | Thermo Scientific HyClone | ||
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | Extrait du plasma humain | |
| Lame de verre | Thermo Scientific | ||
| GFP-Fibroblastes dermiques humains-Primaire | . Don de la Dre Marta Garcí ; une | ||
| lignée cellulaire H2B-GFP-HaCaT | ATCC | Kératinocytes immortalisés. Don de la Dre Marta Garcí ; un | |
| kit Live/dead | Invitrogen | ||
| PBS | Sigma Aldrich | ||
| Membrane polycarbonate | Merk TM 5 | µ ; m taille des pores | |
| Polydiméthylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Chlorure de sodium | Sigma Aldrich | ||
| Seringues | Terumo | 5 mL | |
| Thrombin | Sigma Aldrich | 10 NIH/flacon | |
| Vinyle adhésif transparent | Mactac | JT 8500 CG-RT, 95 µ ; | |
| Tube Trypsine/EDTA | Sigma Aldrich d’épaisseur | ||
| IDEX | Téflon, 1/16" OD, 0,020 po Id |
Références
- McNamee, P., et al. A tiered approach to the use of alternatives to animal testing for the safety assessment of cosmetics: Eye irritation. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 54 (2), 197-209 (2009).
- Mathes, S. H., Ruffner, H., Graf-Hausner, U.
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Réimpressions et autorisations
