Article de méthode

Différenciation dirigée de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines

DOI :

10.3791/62391

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31 mars 2021

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1Department of Cell Biology, University of Virginia, 2Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Medicine, Yale University School of Medicine, 4Department of Genetics, Yale University School of Medicine, 5Yale Cardiovascular Research Center, Yale University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

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Présenté ici est un protocole simple pour la différenciation dirigée des cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches pluripotentes humaines en environ 1 semaine.

Résumé

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Les vaisseaux sanguins sont omniprésents dans tous les tissus du corps et remplissent diverses fonctions. Ainsi, la dérivation de cellules endothéliales vasculaires matures, qui tapissent les lumières des vaisseaux sanguins, à partir de cellules souches pluripotentes humaines est cruciale pour une multitude d’applications d’ingénierie tissulaire et de régénération. In vivo, les cellules endothéliales primordiales sont dérivées de la lignée mésodermique et sont spécifiées vers des sous-types spécifiques, y compris artériel, veineux, capillaire, hémogène et lymphatique. Les cellules endothéliales hémogènes présentent un intérêt particulier car, au cours du développement, elles donnent naissance à des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, qui génèrent ensuite toutes les lignées sanguines tout au long de la vie. Ainsi, la création d’un système pour générer des cellules endothéliales hémogènes in vitro fournirait l’occasion d’étudier la transition endothéliale-hématopoïétique et pourrait conduire à la production ex vivo de produits sanguins humains et à une réduction de la dépendance à l’égard des donneurs humains. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la dérivation des cellules endothéliales progénitrices et primordiales, la génération de cellules endothéliales hémogènes bien caractérisées à partir de cellules souches humaines n’a pas été décrite. Ici, une méthode de dérivation de cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches embryonnaires humaines en environ 1 semaine est présentée: un protocole de différenciation avec des cellules de stries primitives formées en réponse à l’inhibiteur de GSK3β (CHIR99021), puis induction de la lignée mésodermique médiée par le FGFb, suivie du développement des cellules endothéliales primordiales favorisé par BMP4 et VEGF-A, et enfin de la spécification des cellules endothéliales hémogènes induite par l’acide rétinoïque. Ce protocole produit une population bien définie de cellules endothéliales hémogènes qui peuvent être utilisées pour mieux comprendre leur régulation moléculaire et leur transition endothéliale-hématopoïétique, ce qui pourrait être appliqué à des applications thérapeutiques en aval.

Introduction

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Les cellules endothéliales (CE) sont une population hétérogène de cellules qui remplissent de multiples fonctions dans tout le corps humain et dans les tissus modifiés. En plus de soutenir et de réguler d’autres types de cellules (c.-à-d. cardiomyocytes1, cellules ostéoblastiques2), ces fonctions comprennent la formation d’une barrière sélective entre le sang et les tissus et l’aide à la formation des tissus3. La différenciation des EC matures au cours du développement normal nécessite diverses voies de signalisation. Les CE primordiaux sont dérivés des progéniteurs du mésoderme, et sont ensuite spécifiés vers les phénotypes artériels, veineux, capillaires et lymphatiques matures4. En outre, un petit sous-ensemble de CE dans le sac vitellin extraembryonnaire et la région embryonnaire Aorte-Gonade-Mésonéphros (AGM) sont également spécifiés pour devenir des CE hémogènes, qui donnent naissance à des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) qui migrent vers le foie fœtal et la moelle osseuse fœtale, où elles restent postnatales et génèrent tous les types de cellules sanguines tout au long de la vie4. La diversité des phénotypes EC est essentielle pour tout développement et entretien tissulaire.

Ainsi, les CE et leurs dérivés sont des composantes essentielles des études visant à modéliser et à élucider les mécanismes du développement humain et/ou des maladies, ainsi que les applications de la médecine régénérative et de l’ingénierie tissulaire 5,6,7,8. Cependant, la principale limite de ces types d’études est le manque de disponibilité des EC humaines primaires dans la quantité requise. Il a été estimé qu’un minimum de 3 x 108 EC serait nécessaire pour la majorité des applications thérapeutiques6. Pour résoudre ce problème, l’utilisation de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPhi) a été proposée en raison de leur potentiel de lignée diversifiée et de leur capacité à générer un grand nombre de descendants 6,9.

En effet, l’utilité des cellules dérivées des CSEh ou des CSPh a été démontrée dans de multiples études axées sur la modélisation de la maladie et le dépistage de médicaments10,11,12. La technologie Organ-on-a-Chip (OOC) a été utilisée pour récapituler plus fidèlement la physiologie du corps humain en intégrant des cellules et des tissus dans des échafaudages tridimensionnels. En outre, la connexion de plusieurs OOC individuels (un soi-disant corps ou humain sur puce, BOC / HOC) peut être réalisée via la microfluidique pour permettre la diaphonie entre les organes d’intérêt13,14,15. Les tissus de soutien, tels que le système vasculaire, sont des composants essentiels des COO et des BOC/HOC; L’incorporation du système vasculaire permet le transport des nutriments, de l’oxygène et des facteurs paracrines dans les tissus, favorisant ainsi le microenvironnement tissulaire spécifique requis 3,12. Ainsi, les méthodes de dérivation des CE humains matures, telles que les CE artérielles, veineuses, lymphatiques et hémogènes, sont cruciales pour faire progresser ces approches d’ingénierie tissulaire.

Plusieurs protocoles ont été publiés détaillant les étapes pour la dérivation des CE primordiales ou progénitrices humaines à partir de CSEh ou de CSPh 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Bon nombre de ces protocoles reposent sur la formation de corps embryoïdes (EB) ou la co-culture d’ESC/CSPi avec une couche nourricière murine de cellules stromales. Ces stratégies ont tendance à être difficiles et à prendre beaucoup de temps, avec de faibles rendements EC et/ou une contamination des CE humaines par des cellules murines. Les protocoles qui reposent strictement sur la culture 2D sans l’utilisation de cellules stromales nécessitent souvent de longues inductions, utilisent des combinaisons complexes de facteurs de croissance et / ou d’inhibiteurs pour l’induction, ont des périodes d’expansion prolongées après la séparation cellulaire, ou une combinaison de ces facteurs. L’avancement des connaissances sur les voies de signalisation et les facteurs impliqués dans la dérivation des types EC matures in vivo jette les bases d’un protocole de différenciation in vitro simple et robuste.

Auparavant, les rôles clés des voies de signalisation Notch et de l’acide rétinoïque (RA) dans la spécification des CE artérielles et hémogéniques murines, respectivement, au cours du développement ont été identifiés. La voie de signalisation Notch joue de multiples rôles dans la spécification et le maintien du phénotype EC artériel. Les travaux utilisant le modèle de vascularisation rétinienne murine ont identifié une voie dans laquelle la contrainte de cisaillement des fluides induit un axe de signalisation Notch-Cx37-p27, favorisant l’arrêt du cycle cellulaire G1, ce qui permet la spécification EC artérielle27. On a émis l’hypothèse que les états du cycle cellulaire jouent un rôle dans les décisions relatives au devenir cellulaire en fournissant des fenêtres d’opportunité distinctes dans lesquelles les cellules sont réceptives à certains signaux qui peuvent induire l’expression des gènes et des changements phénotypiques28. Cet arrêt G1 médié par Notch a permis l’expression de gènes enrichis en EC artériels, notamment ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 et Notch 4 (examinés dans29,30). Il a également été démontré que la spécification CE hémogénique est encouragée in vivo via la signalisation RA31,32. Des études supplémentaires ont identifié que, en aval de la signalisation RA, l’expression de c-Kit et Notch régule p27, ce qui permet une spécification hémogénique dans le sac vitellin murin et AGM33. Les CE hémogènes murins peuvent être identifiés de manière minimale par l’expression des marqueurs endothéliaux (CD31, KDR) et hématopoïétiques (c-à-d. c-Kit, CD34)4. Enfin, les CE hémogènes subissent une transition endothéliale-hématopoïétique (EHT) pour former des HSPC, qui peuvent donner naissance à tous les types de cellules sanguines 4,34,35.

Des travaux récents ont testé si cette même hiérarchie de signalisation peut promouvoir la spécification EC hémogénique humaine. Pour ce faire, un protocole de culture 2D sans sérum et sans alimentation pour dériver des CE hémogènes à partir de CSEh a été développé, et ces CE hémogéniques ont été caractérisés au niveau cellulaire comme CD31+ KDR+ c-Kit + CD34+ VE-Cadhérine- CD45-. Cette étude a également tiré parti du rapporteur FUCCI (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), qui identifie différents états du cycle cellulaire, en utilisant des CSEh H9 qui expriment la construction du rapporteur FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. Dans des études avec ces cellules, il a été démontré que la PR favorise l’arrêt précoce du cycle cellulaire G1 dans les CE, et que l’état G1 précoce permet une spécification hémogénique in vitro37. Ici, un protocole détaillé pour la différenciation de ces cellules endothéliales hémogènes humaines et des tests confirmant leur identité sont fournis. Cette méthode simple fournit un moyen utile de générer ce sous-ensemble spécialisé de CE pour de futures études sur les mécanismes du développement des cellules sanguines humaines.

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Protocole

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1. Réactifs et préparation des réactifs

REMARQUE : Une liste des réactifs est fournie dans le Tableau des matériaux.

  1. Obtenir les lignées de cellules souches pluripotentes humaines : H1-hESC, H9-Fucci-hESC.
    REMARQUE: La génération d’EC hémogènes peut être plus efficace dans la lignée cellulaire H1.
  2. Préparer les souches de protéines matricielles : Aliquote la protéine matricielle dans des tubes pré-réfrigérés de 1,5 mL (sur glace) de sorte que chaque tube contienne 1 mg de protéine matricielle. 1 mg de protéine matricielle suffit pour recouvrir tous les puits de deux plaques de 6 puits (12 puits au total). Conserver les aliquotes à -20 °C jusqu’à utilisation.
    NOTE: Effectuez toutes les étapes impliquant la protéine matricielle sur la glace ou à 4 ° C. Décongeler le flacon congelé de protéine matricielle sur de la glace à 4 °C pendant la nuit. Une fois décongelé, agiter le flacon pour s’assurer que le contenu est mélangé. Prérefroidir les tubes microcentrifugeuses de 1,5 mL pendant au moins 1 h à -20 °C et transférer dans la glace immédiatement avant l’aliquote.
  3. Préparer des plaques recouvertes de protéines matricielles: Décongeler les aliquotes de protéines de la matrice sur de la glace à 4 °C. Ajouter 12,5 ml de DMEM:F12 glacé dans un tube conique prérefroidi sur de la glace. À l’aide d’embouts de pipettes prérefroidis, transférer une partie aliquote (1 mg) de protéine matricielle dans le tube conique et bien mélanger en pipetant de haut en bas. Aliquote de 1 mL de la protéine matricielle diluée dans chaque puits de plaques de 6 puits prérefroidies (sur glace) à l’aide d’une pipette sérologique prérefroidie. Tourbillonnez et bercez les plaques de manière à ce que l’ensemble du puits soit recouvert uniformément. Incuber les plaques pendant au moins 30 minutes à température ambiante pour permettre à la protéine matricielle de se solidifier. Envelopper les plaques de parafilm et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Utilisez des plaques recouvertes de protéines matricielles dans les 2 semaines suivant la préparation.
    REMARQUE: Utilisez les plaques matricielles à 6 puits recouvertes de protéines pour le passage de routine des cellules et la différenciation en cellules endothéliales primordiales et hémogènes. Effectuez toutes les étapes sur la glace. Prérefroidir les plaques à 6 puits, les pointes de pipettes, les pipettes sérologiques et les tubes coniques avant utilisation pendant au moins 1 h à -20 °C. Transférez ces articles sur de la glace lorsqu’ils sont prêts à être utilisés.
  4. Préparer le milieu de différenciation basique en ajoutant 5 mL de PFHM à 100 mL de milieu de différenciation des cellules souches pluripotentes. Conserver à 4 °C.
  5. Préparer du BSA-PBS à 0,1 % en dissolvant 0,1 g de BSA dans 100 mL de PBS. Filtrer stériliser BSA-PBS en passant à travers un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C.
  6. Préparer 5 mM HCl en diluant le HCl (12 M) 1:2 400 avec de l’eau. Ajustez le pH à 3,0 en utilisant NaOH. Filtrer stériliser la solution en passant à travers un filtre de 0,22 μm et conserver à 4 °C.
  7. Préparer des stocks de FGFB, BMP4, VEGF-A, acide rétinoïque (PR) et DLL4.
    1. bFGF: Reconstituer la poudre lyophilisée à 100 μg/mL dans 0,1% BSA-PBS. Aliquote et conserver à -20 °C. Utilisez les stocks de FGFb dans les 3 mois suivant la préparation. Décongeler les aliquotes immédiatement avant utilisation.
    2. BMP4 : Reconstituer la poudre lyophilisée à 1 mg/mL dans 5mM HCl, pH 3,0. Diluer davantage à 50 μg/mL dans du BSA-PBS à 0,1 %. Aliquote et conserver à -20 °C. Utilisez les stocks BMP4 dans les 3 mois suivant leur préparation. Décongeler les aliquotes immédiatement avant utilisation.
    3. VEGF-A : Reconstituer la poudre lyophilisée à 1 mg/mL dansdH2O. Diluer davantage à 100 μg/mL dans du BSA-PBS à 0,1 %. Aliquote et conserver à -20 °C. Utilisez les stocks du VEGF-A dans les 3 mois suivant leur préparation. Décongeler les aliquotes immédiatement avant utilisation.
    4. RA : Reconstituer la poudre lyophilisée à 100 mM dans du DMSO. Aliquote et conserver à -80 °C. Utilisez les stocks RA dans le 1 mois suivant la préparation. Décongeler les aliquotes immédiatement avant utilisation.
      REMARQUE : Protégez les stocks de PR de la lumière.
    5. DLL4: Reconstituer la poudre lyophilisée à 1 mg / mL dans PBS. Aliquote et conserver à -20 °C. Utilisez les stocks DLL4 dans les 12 mois suivant leur préparation. Décongeler les aliquotes immédiatement avant utilisation.
  8. Préparer le milieu de différenciation des cellules endothéliales immédiatement avant utilisation en diluant le VEGF-A et le BMP4 dans le milieu de différenciation basique (étape 1.4) de sorte que les concentrations finales soient respectivement de 25 ng/mL et 50 ng/mL.
  9. Préparer l’AR de travail immédiatement avant l’utilisation en diluant 100 mM de stock 1:1 000 dans du DMSO à 100 μM.
    REMARQUE: Protégez la RA de la lumière.
  10. Préparer le milieu de différenciation des cellules endothéliales hémogènes immédiatement avant utilisation en diluant le VEGF-A, le BMP4 et le PR actif dans le milieu de différenciation basique (étape 1.4) de sorte que les concentrations finales soient de 25 ng/mL, 50 ng/mL et 0,5 μM, respectivement.
  11. Préparez le tampon de coloration des anticorps en fabriquant du HBSS contenant 10% de FBS et complétez avec un réactif antimicrobien dilué 1:500. Filtrer le tampon stérile et l’utiliser immédiatement.
  12. Préparez le tampon de tri cellulaire en fabriquant du HBSS contenant 1% de FBS et complétez avec un réactif antimicrobien dilué à 1:500. Filtrer le tampon stérile et l’utiliser immédiatement.
  13. Préparer des souches de fibronectine à 1 mg/mL en ajoutant 5 mL d’eau stérile à 5 mg de fibronectine lyophilisée. Aliquote et conserver à -20 °C. Utilisez les stocks de fibronectine avant la date de péremption indiquée sur l’étiquette du produit lyophilisé. Décongeler les aliquotes immédiatement avant utilisation.
  14. Préparez les plats de 35 mm enrobés de fibronectine. Diluer les stocks de fibronectine (1 mg/mL) à 4 μg/mL dans de l’eau stérile. Ajouter 1 mL de cette solution d’enrobage de fibronectine à chaque plat et incuber à 37 °C pendant 30 min à 1 h. Utilisez la vaisselle immédiatement après l’enrobage.
  15. Préparer 3 ou 4 mL d’aliquotes de milieu à base de méthylcellulose en suivant les instructions du fabricant. Conserver les aliquotes à -20 °C jusqu’à utilisation. Utiliser les aliquotes à base de méthylcellulose avant la date de péremption indiquée sur l’étiquette du produit stocké. Décongeler les aliquotes immédiatement avant utilisation.
  16. Préparer la solution d’enrobage DLL4 en diluant le stock humain recombinant DLL4 à une concentration finale de 10 μg/mL dans du PBS.
  17. Préparer et conserver le milieu de croissance des cellules endothéliales conformément aux instructions du fabricant.
  18. Préparez le tampon d’analyse de cytométrie en flux en fabriquant du PBS contenant 0,1% de BSA. Filtrer le tampon stérile et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation.

2. Culture cellulaire et passage des CSEh

  1. Laissez les plaques recouvertes de protéines matricielles, le milieu de croissance des cellules souches et le DMEM:F12 se réchauffer à température ambiante.
  2. Cultiver les lignées cellulaires de CSEh dans un milieu de croissance de cellules souches (2 mL/puits) sur des plaques à 6 puits recouvertes de protéines matricielles dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 .
  3. Vérifiez les cellules quotidiennement et retirez les cellules différenciées si nécessaire en les grattant doucement de la plaque à l’aide d’un embout de pipette p200.
    NOTE: Des cellules différenciées apparaîtront à la périphérie des colonies. Reportez-vous au manuel du produit du milieu de croissance des cellules souches pour obtenir des exemples de cellules différenciées en culture.
  4. Passez les cellules une fois qu’elles atteignent 70%-80% de confluence. Pour passer des cellules, procédez comme suit.
    REMARQUE: Les cellules doivent être divisées avant d’atteindre une confluence de 70% à 80% si une différenciation accrue se produit.
    1. Retirer le milieu au-dessus des cellules et laver doucement avec 1 mL de DMEM:F12 par puits.
    2. Ajouter 1 mL de DMEM:F12 par puits.
    3. Ajouter 160 μL/mL de Dispase par puits et incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 pendant 45 min.
    4. Après l’incubation de Dispase, ajouter 1 mL supplémentaire de DMEM:F12 par puits et pipeter doucement pour soulever les cellules.
      REMARQUE: Évitez de dissocier les cellules en une suspension unicellulaire. Passez les cellules comme de petits touffes.
    5. Transférer les cellules dans un tube conique contenant 12 mL de DMEM:F12 et permettre aux cellules de se déposer par gravité (~5-10 min).
    6. Retirer le surnageant et remettre délicatement la pastille en suspension dans 0,5 mL de milieu de croissance des cellules souches par puits de cellules soulevées pour obtenir de petits amas de cellules.
      REMARQUE: Évitez de dissocier les cellules en une suspension unicellulaire. Passez les cellules comme de petits touffes.
    7. Aspirer la solution d’enrobage des protéines matricielles des puits de la plaque recouverte de protéines matricielles préparée et ajouter 1,5 mL du milieu de croissance des cellules souches par puits.
    8. Ajouter le volume souhaité de cellules remises en suspension (étape 2.4.6) à chaque puits de la plaque préparée recouverte de protéines de la matrice.
    9. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2 . Changez le milieu toutes les 24 heures pour un milieu de croissance de cellules souches fraîches.

3. Différenciation des CSEh en cellules endothéliales primordiales

  1. Jour -1: Culture et passage des cellules comme décrit ci-dessus dans la section 2. Ensemencer les cellules (étape 2.4.6) en petits amas (~50 μm) à une densité d’environ 2 touffes par centimètre carré38.
    REMARQUE : Évaluer la densité des graines et l’affiner empiriquement si nécessaire.
  2. Jour 0: 24 h après l’ensemencement des cellules, aspirer le milieu de chaque puits et laver doucement les cellules avec 1 mL de DMEM:F12 par puits. Ajouter 1 mL du milieu de différenciation basique contenant 5 μM de GSK3i (CHIR99021, ajouté frais) à chaque puits et incuber pendant 24 h (37 °C, 5 % CO2).
    REMARQUE: Pour toutes les étapes de lavage, ajoutez lentement le produit de lavage indiqué à la plaque en pipetant contre la paroi du puits de la plaque. Remuez doucement la plaque de manière à ce que toute la surface du puits soit recouverte de lavage. Inclinez légèrement la plaque de sorte que le média de lavage s’accumule à la position six heures et aspirez soigneusement le produit de lavage.
  3. Jour 1: Aspirer le milieu de chaque puits et laver doucement les cellules avec 1 mL de DMEM:F12 par puits. Ajouter 1 mL du milieu de différenciation basique contenant 50 ng/mL de FGFb (ajouté frais, 1:2 000 à partir de bouillon congelé) dans chaque puits et incuber 24 h (37 °C, 5 % CO2).
  4. Jour 2 : Aspirer le milieu de chaque puits et laver doucement les cellules avec 1 mL de DMEM:F12 par puits. Ajouter 1 mL du milieu de différenciation des cellules endothéliales à chaque puits et incuber 24 h (37 °C, 5% CO2).
  5. Jour 3 : Remplacer le milieu au-dessus des cellules par 1 mL de milieu de différenciation des cellules endothéliales fraîchement préparé par puits et incuber 24 h (37 °C, 5 % de CO2).
  6. Jour 4 : Remplacer le milieu au-dessus des cellules par 1 mL de milieu de différenciation des cellules endothéliales fraîchement préparé par puits et incuber 24 h (37 °C, 5 % de CO2).
  7. Jour 5: FACS purifie les cellules pour évaluer le phénotype EC (sections 4-5) ou les maintient en culture et les différencie en cellules endothéliales hémogènes (section 6).

4. Purification FACS des cellules endothéliales primordiales

  1. Aspirer le milieu au-dessus des cellules et laver doucement une fois avec 1 mL de DMEM:F12 par puits.
  2. Ajouter 1 mL de solution de détachement cellulaire par puits et incuber les cellules pendant 12 minutes dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 , ou jusqu’à ce que les cellules se soient dissociées.
  3. Transférer les cellules dissociées dans un tube conique contenant 12 mL de DMEM:F12 et granuler par centrifugation pendant 5 min, 1 000 x g.
  4. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 12 mL de DMEM:F12 pour le laver.
  5. Enduire les cellules par centrifugation pendant 5 min, 1 000 x g.
  6. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans un tampon de coloration d’anticorps glacé et compter les cellules. Ajuster la concentration à l’aide d’un tampon de coloration d’anticorps glacés à 1 x 105 cellules/mL.
  7. Répartir les cellules uniformément dans des tubes de microcentrifugation sur de la glace, chacun contenant un minimum de 600 μL de cellules à 1 x 105 cellules/mL, pour la coloration des anticorps.
    REMARQUE: Quatre tubes de cellules sont nécessaires pour la coloration des CE primordiaux: contrôle non coloré, contrôle d’anticorps unique CD31, contrôle d’anticorps unique CD45 et échantillon contenant à la fois des anticorps CD31 et CD45. Des renseignements sur les anticorps sont fournis dans le tableau des matières.
  8. Ajouter des anticorps aux tubes contenant les cellules, le cas échéant, et incuber sur de la glace et à l’abri de la lumière pendant 30 min.
    1. Contrôle non coloré : N’ajoutez aucun anticorps.
    2. Contrôle de l’anticorps unique CD31 : Ajouter uniquement l’anticorps CD31.
    3. Contrôle de l’anticorps unique CD45 : Ajouter uniquement l’anticorps CD45.
    4. Échantillon : Ajouter les anticorps CD31 et CD45.
      REMARQUE : La concentration finale d’anticorps dans l’échantillon, ainsi que les conjugués fluorescents, doivent être optimisés en fonction des anticorps spécifiques et du trieur cellulaire utilisés.
  9. Enduire les cellules par centrifugation dans une microcentrifugeuse de table à 4 °C pendant 5 min à 1 000 x g.
  10. Retirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles de la cellule dans 600 μL de tampon de tri glacé.
  11. Filtrer les échantillons à travers les bouchons filtrants de tubes FACS de 5 ml et stocker les cellules sur de la glace, à l’abri de la lumière, pour un FACS immédiat.
  12. Obtenez des cellules endothéliales primordiales (CD31+ CD45-), en effectuant les étapes suivantes.
    1. Identifier la population de cellules CD45 négatives et la porte (CD45-).
    2. Dans (CD45-), identifier la population de cellules CD31-positives (CD31+) et trier les cellules dans un tampon de tri de cellules glacées de 6 mL. Utilisez ces cellules pour les applications en aval (voir section 5).

5. Dosage pour confirmer le phénotype des cellules endothéliales primordiales

  1. Enduire trois puits d’une plaque à 6 puits avec une solution de revêtement DLL4 à 1 mL/puits pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 . Comme témoin, enduire les trois autres puits de la plaque de 1 mL/puits de PBS.
  2. Aspirer la solution d’enrobage DLL4 et le PBS, et plaquer 25 000 cellules endothéliales primordiales triées (voir étape 4.12) dans 2 mL de milieu de croissance des cellules endothéliales par puits.
  3. Incuber les cellules pendant 24 h dans un incubateur à 37 °C, 5% CO2 .
  4. Aspirer le milieu au-dessus des cellules et laver une fois avec 2 mL/puits PBS. Analyser les cellules par qPCR ou cytométrie en flux (pour les cellules exprimant la construction FUCCI).
    1. Pour analyser les cellules par qPCR, procédez comme suit.
      1. Aspirez le liquide au-dessus des cellules et isolez l’ARN dans les cellules à l’aide d’un kit d’extraction d’ARN selon le protocole du fabricant.
      2. Effectuer des réactions de transcription inverse avec un mélange maître de transcription inverse selon le protocole du fabricant.
      3. Effectuer des réactions qPCR avec un mélange-maître SYBR Green selon le protocole du fabricant.
        REMARQUE : Les amorces utilisées (EFNB2, GJA5, GJA4, NR2F2, EPHB4, HEY2) sont énumérées dans le tableau 1.
    2. Pour analyser les cellules exprimant la construction FUCCI par cytométrie en flux, procédez comme suit.
      1. Aspirer le liquide au-dessus des cellules et ajouter 500 μL/puits 0,25 % trypsine-EDTA.
      2. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur à 5% de CO2 jusqu’à levée, ~5 min.
      3. Transférer les cellules dans un tube de microcentrifugation et granuler les cellules dans une microcentrifugeuse à 4 °C pendant 5 min à 1 000 x g.
      4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de tampon d’analyse de cytométrie en flux glacé.
      5. Filtrer les échantillons à travers le capuchon filtrant d’un tube FACS de 5 ml et stocker les cellules sur de la glace, à l’abri de la lumière, pour une analyse immédiate par cytométrie en flux.
      6. Analysez le pourcentage de cellules plaquées sur DLL4 par rapport au contrôle PBS au début de G1 (sans couleur), à la fin de G1 (mCherry+/mVenus-), G1/S (mCherry+/mVenus+) et S/G2/M (mCherry-/mVenus+).

6. Différenciation des CSEh en cellules endothéliales hémogènes

REMARQUE: Différencier les cellules des CE primordiales du jour 4, comme décrit ci-dessus dans les sections 3.1-3.6.

  1. Jour 5: Aspirer le milieu au-dessus des cellules et laver doucement les cellules avec 1 mL de DMEM:F12 par puits. Ajouter 1 mL de milieu de différenciation des cellules endothéliales hémogènes fraîchement préparé par puits et incuber 24 h (37 °C, 5 % de CO2).
  2. Jour 6 : Remplacer le milieu au-dessus des cellules par 1 mL de milieu de différenciation des cellules endothéliales hémogènes fraîchement préparé par puits et incuber 24 h (37 °C, 5 % CO2).
  3. Jour 7 : Remplacer le milieu au-dessus des cellules par 1 mL de milieu de différenciation des cellules endothéliales hémogènes fraîchement préparé par puits et incuber 24 h (37 °C, 5 % CO2).
  4. Jour 8 : FACS isole les cellules endothéliales hémogènes (voir rubrique 7).

7. FACS-isolement des cellules endothéliales hémogènes

  1. Soulever et laver les cellules comme décrit ci-dessus aux sections 4.1-4.6.
  2. Répartir les cellules uniformément dans des tubes de microcentrifugation sur de la glace, chacun contenant un minimum de 600 μL de cellules à 1 x 105 cellules/mL, pour la coloration des anticorps.
    REMARQUE: Huit tubes de cellules sont nécessaires pour la coloration des anticorps des CE hémogènes: contrôle non coloré, contrôle d’anticorps unique CD31, contrôle d’anticorps unique CD45, contrôle d’anticorps unique KDR, contrôle d’anticorps unique c-Kit, contrôle d’anticorps unique CD34, contrôle d’anticorps unique VE-cadhérine et échantillon contenant les six anticorps.
    REMARQUE : Les renseignements sur les anticorps sont fournis dans le tableau des matériaux.
  3. Ajouter des anticorps aux tubes contenant les cellules, le cas échéant, et incuber sur de la glace et à l’abri de la lumière pendant 30 min.
    1. Contrôle non coloré : N’ajoutez pas d’anticorps.
    2. Contrôle de l’anticorps unique CD31 : Ajouter uniquement l’anticorps CD31.
    3. Contrôle de l’anticorps unique CD45 : Ajouter uniquement l’anticorps CD45.
    4. Contrôle de l’anticorps unique KDR : ajoutez uniquement l’anticorps KDR.
    5. Contrôle de l’anticorps unique c-Kit : Ajouter uniquement l’anticorps c-Kit.
    6. Contrôle de l’anticorps unique CD34 : Ajouter uniquement l’anticorps CD34.
    7. Contrôle de l’anticorps unique VE-cadhérine : Ajouter uniquement l’anticorps VE-cadhérine.
    8. Exemple : Ajouter les anticorps CD31, CD45, KDR, c-Kit, CD34 et VE-cadhérine.
      REMARQUE : La concentration finale d’anticorps dans l’échantillon, ainsi que les conjugués fluorescents, doivent être optimisés en fonction des anticorps spécifiques et du trieur cellulaire utilisés.
  4. Enduire les cellules par centrifugation dans une microcentrifugeuse à 4 °C pendant 5 min à 1 000 x g.
  5. Retirer le surnageant et remettre les granulés en suspension dans 600 μL de tampon de tri glacé.
  6. Filtrer les échantillons à travers le capuchon filtrant des tubes FACS de 5 ml et stocker les cellules sur de la glace, à l’abri de la lumière, pour un FACS immédiat.
  7. Pour obtenir des cellules endothéliales hémogènes (CD31+KDR+c-Kit+ CD34+ VE-Cadhérine- CD45-), procédez comme suit.
    1. Identifier la population de cellules CD45 et la porte (CD45-).
    2. À l’intérieur (CD45-), identifiez la population de cellules CD31+ et la porte (CD31+).
    3. À l’intérieur (CD31+), identifier la population de cellules VE-cadhérine et la porte (CDH5-).
    4. À l’intérieur (CDH5-), identifiez la population de cellules c-Kit+ et la porte (KIT+).
    5. À l’intérieur (KIT+), identifiez la population de cellules CD34+ et la porte (CD34+).
    6. À l’intérieur (CD34+), identifiez et triez les cellules KDR+ dans un tampon de tri de cellules glacées de 6 mL. Utilisez ces cellules dans les applications en aval (voir section 8).

8. Essai unitaire de formation de colonies

  1. Décongeler les aliquotes du milieu à base de méthylcellulose en suivant les instructions du fabricant.
    REMARQUE : Une partie aliquote de 3 mL est suffisante pour deux échantillons et une aliquote de 4 mL est suffisante pour trois échantillons.
  2. Compter les cellules endothéliales hémogènes triées obtenues à l’étape 7.7.
  3. En suivant les instructions du fabricant, calculer le volume de cellules triées à ajouter à chaque aliquote à base de méthylcellulose afin que chaque échantillon contienne au moins 1 000 cellules endothéliales hémogènes.
    REMARQUE: Le nombre de cellules peut être ajusté si nécessaire.
  4. Ajouter soigneusement le volume calculé de cellules au milieu aliquote à base de méthylcellulose et au vortex. Laisser reposer les cultures de milieu à base de méthylcellulose à température ambiante pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que les bulles se dissipent.
  5. Aspirer la solution d’enrobage de fibronectine des plats préparés de 35 mm. En suivant les instructions du fabricant, distribuer 1 mL de culture moyenne à base de méthylcellulose par boîte de 35 mm. Tournez doucement le plat pour répartir uniformément la culture.
  6. Placez ces boîtes de 35 mm, ainsi que deux autres boîtes de 35 mm remplies d’eau stérile, dans une boîte de culture tissulaire de 15 cm.
  7. Incuber les cultures dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 , et observer les cultures les jours 8 et 14.
    1. Le jour 8, comptez les colonies CFU-E et BFU-E.
    2. Au jour 14, comptez les colonies CFU-GM et CFU-GEMM.
      NOTA : Se reporter au manuel du milieu à base de méthylcellulose pour l’identification morphologique des types de colonies.

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Résultats

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La figure 1 présente un schéma décrivant la spécification des CE primordiales et des CE hémogènes à partir des CSEh, ainsi qu’une image représentative des cellules 24 h après le placage. Conformément aux spécifications, les EC primordiaux et les EC hémogènes sont purifiés FACS aux jours 5 et 8, respectivement. Les EC primordiaux sont définis comme CD31+ CD45- et les EC hémogènes sont définis comme CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadhérine- CD45

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Discussion

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Les étapes de production de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches embryonnaires humaines en environ 1 semaine à l’aide d’un système de culture 2D murin sans alimentation et sans sérum (Figure 1) sont décrites. Ce protocole développe une méthode décrite par Sriram et al. (2015) pour obtenir des CE primordiales38. La nature primordiale et le potentiel de spécification des CD31+ CD45- EC sont démontrés en cultivant ces cel...

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Déclarations de divulgation

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L’auteur n’a rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été partiellement soutenu par les subventions HL128064 et U2EB017103 des NIH. Un soutien supplémentaire a été fourni par CT Innovations 15-RMB-YALE-04.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Boîtes de 15 cmCorning430599traitées pour la culture tissulaire
Boîtes de 35 mmCorning430165traitées pour la culture tissulaire
Plaques 6 puitsCorning3516traitées pour la culture tissulaire
Réactif antimicrobien
Nom de marque : Normocin		Invitrogenant-nr-1
bFGFR& D systems233-FB-025à 50 ng/mL
BMP4BioLegend595202utilisation à 25 ng/mL
d’albumine sérique bovine (BSA)Fisher ScientificBP1600-1
Cell Detachment Solution
Marque : Accutase		Stemcell Technologies7920
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma AldrichD2650-100mL
DispaseStemcell Technologies7913
DLL4R& D systèmes1506-D4/CFrecombinant humain ; utilisation à 10 &mu ; g/mL
DMEM :F12Gibco11320-033
Sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS)Gibco14190144
Milieu de croissance des cellules endothéliales
Nom de marque : EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)		LonzaCC-3162
Tubes FACSCorning352235fond rond en polystyrène avec capuchon filtrant
Sérum fœtal bovin (FBS)Gemini Bio100-106
FibronectineThermoFisher Scientific33016015utilisation à 4 &mu ; g/cm2
GSK3i/CHIR99021Stemgent04-0004-0210 mM de stock ; utiliser à 5 &mu ;
M Hanks Solution saline équilibrée (HBSS)Gibco14175-095
Acide chlorhydrique (HCl)Fisher ScientificA144S-500
Protéine matricielle  ;
Nom de marque : Matrigel		Corning356230Facteur de croissance réduit. Reportez-vous au certificat d’analyse du lot pour déterminer la concentration en protéines (Matrigel). Cette concentration est nécessaire pour calculer le volume de Matrigel qui contient 1 mg de protéines.
Milieu à base de méthylcellulose
Nom de marque : MethoCult H4435 Enriched		Stemcell Technologies4435
Milieu de différenciation des cellules souches pluripotentes
Nom de marque : STEMdiff APEL 2		Stemcell Technologies5270
Cellules souches pluripotentes : H1, H9, H9-FUCCIWiCellWA09 (H9), WA01 (H1)humain ; Les H9-FUCCI ont été obtenus dans le laboratoire du Dr Ludovic Vallier au Cambridge Stem Cell Institute
Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)Gibco12040077
Retinoic AcidSigma AldrichR2625-50mgutilisation à 0,5 &mu ; M
Reverse transcription master mix
Nom de marque : iScript Reverse Transcription Supermix BioRad		1708840
Kit d’extraction d’ARN
Nom de marque : RNeasy Mini Kit		Qiagen74104
Hydroxyde de sodium (NaOH)Fisher ScientificSS255-1
Milieu de croissance de cellules souches
Nom de marque : mTeSR1		Stemcell Technologies85850
SYBR Green master mix
Nom de marque : iTaq Universal SYBR Green Master Mix		BioRad1725121
Trypsine-EDTAGibco252999560,25 %
VEGF165 (VEGF-A)PeproTech100-20à utiliser à 50 ng/mL
&alpha ;-CD31-FITCBioLegend3031042 &mu ; g/mL*
&alpha ;-CD34-Pacific BlueBioLegend3435122 &mu ; g/mL*
&alpha ;-CD45-APC/Cy7BioLegend3040142 &mu ; g/mL*
&alpha ;-c-Kit-APCBioLegend3132062 &mu ; g/mL*
&alpha ;-Flk-1-PE/Cy7BioLegend3599112 &mu ; g/mL*
&alpha ;-VE-Cadherin-PEBioLegend3485062 &mu ; g/mL*
* Les conjugués fluorescents d’anticorps doivent être optimisés en fonction du trieur de cellules utilisé. Les concentrations finales utilisées dans cette étude sont présentées ici.

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Diff renciation endoth lialetransition endoth liale h matopo tiqueunit s formant coloniestri par cytom trie en fluxcellules CD34 positivesinduction de la lign e m sodermiqueinduction l acide r tino queculture sans cellules nourrici res

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