In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

Leonie Müller; Carl Elias Kutzner; Vishnu Balaji; Thorsten Hoppe

doi:10.3791/62393

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Article de méthode

In vitro Analyse de la fonction E3 Ubiquitin Ligase

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DOI :

10.3791/62393

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14 mai 2021

Leonie Müller¹ , Carl Elias Kutzner¹^,² , Vishnu Balaji¹ , Thorsten Hoppe¹^,²

¹Institute for Genetics and Cologne Excellence Cluster on Cellular Stress Responses in Aging Associated Diseases (CECAD), University of Cologne, ²Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne

Dans cet article

Résumé

La présente étude fournit des protocoles détaillés de dosage d’ubiquitylation in vitro pour l’analyse de l’activité catalytique de l’ubiquitine ligase E3. Les protéines recombinantes ont été exprimées à l’aide de systèmes procaryotes tels que la culture d’Escherichia coli.

Résumé

La fixation covalente de l’ubiquitine (Ub) au(x) résidu(s) interne(s) de lysine d’une protéine de substrat, un processus appelé ubiquitylation, représente l’une des modifications post-traductionnelles les plus importantes chez les organismes eucaryotes. L’ubiquitylation est médiée par une cascade séquentielle de trois classes d’enzymes, notamment les enzymes activatrices de l’ubiquitine (enzymes E1), les enzymes conjuguant l’ubiquitine (enzymes E2) et les ligas d’ubiquitine (enzymes E3), et parfois les facteurs d’allongement de la chaîne ubiquitine (enzymes E4). Ici, des protocoles in vitro pour les tests d’ubiquitylation sont fournis, qui permettent l’évaluation de l’activité de l’ubiquitine ligase E3, la coopération entre les paires E2-E3 et la sélection du substrat. Les paires E2-E3 coopérantes peuvent être examinées en surveillant la génération de chaînes de poly-ubiquitine libres et/ou l’auto-ubiquitylation de la ligase E3. L’ubiquitylation du substrat est définie par liaison sélective de la ligase E3 et peut être détectée par transfert occidental de la réaction in vitro. En outre, un test de décharge E2 ~ Ub est décrit, ce qui est un outil utile pour l’évaluation directe de la coopération fonctionnelle E2-E3. Ici, le transfert dépendant de l’E3 de l’ubiquitine est suivi de l’enzyme E2 correspondante sur des acides aminés lysine libres (imitant l’ubiquitylation du substrat) ou des lysines internes de la ligase E3 elle-même (auto-ubiquitylation). En conclusion, trois protocoles in vitro différents sont fournis qui sont rapides et faciles à réaliser pour traiter la fonctionnalité catalytique de la ligase E3.

Introduction

L’ubiquitylation est le processus par lequel Ub est lié de manière covalente à une protéine de substrat¹. La modification Ub est catalysée par des réactions enzymatiques successives impliquant l’action de trois classes d’enzymesdifférentes, à savoir les enzymes activatrices Ub (E1s), les enzymes conjuguantes Ub (E2s), les ligas Ub (E3s), et éventuellement les facteurs d’allongement de la chaîne Ub (E4s)²^,³^,⁴^,⁵. Après l’activation de l’Ub dépendant de l’adénosine triphosphate (ATP) et du magnésium (Mg^2+),....