L’annotation numérique avec dissection tissulaire automatisée fournit une approche innovante pour enrichir la tumeur dans les cas à faible teneur tumorale et est adaptable aux types de paraffine et de tissus congelés. Le flux de travail décrit améliore la précision, la reproductibilité et le débit et pourrait être appliqué à la fois à la recherche et aux milieux cliniques.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Protocole de dissection automatisé pour l’enrichissement des tumeurs dans les tissus à faible teneur tumorale
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’enrichissement tumoral dans les tissus à faible teneur tumorale, ceux dont la teneur en tumeurs est inférieure à 20% selon la méthode, est nécessaire pour générer des données de qualité reproductibles avec de nombreux tests en aval tels que le séquençage de nouvelle génération. La dissection tissulaire automatisée est une nouvelle méthodologie qui automatise et améliore l’enrichissement des tumeurs dans ces tissus communs à faible teneur tumorale en diminuant l’imprécision dépendante de l’utilisateur de la macro-dissection traditionnelle et les limites de temps, de coût et d’expertise de la microdissection de capture laser en utilisant une superposition d’annotation d’image numérique sur des diapositives non colorées. Ici, les annotations numériques d’hématoxyline et d’éosine (H & E) sont utilisées pour cibler de petites zones tumorales à l’aide d’une lame de250 μm 2 de diamètre dans des sections de paraffine fixes non colorées (FFPE) ou de sections fraîches congelées jusqu’à 20 μm d’épaisseur pour un enrichissement tumoral automatisé avant l’extraction des acides nucléiques et le séquençage de l’exome entier (WES). La dissection automatisée peut récolter des régions annotées dans des tissus à faible teneur tumorale à partir d’une ou de plusieurs sections pour l’extraction d’acides nucléiques. Il permet également de capturer des mesures de collecte étendues avant et après la récolte tout en améliorant la précision, la reproductibilité et en augmentant le débit avec l’utilisation de moins de diapositives. Le protocole décrit permet l’annotation numérique avec dissection automatisée sur des FFPE animaux et/ou humains ou des tissus frais congelés à faible teneur en tumeurs et pourrait également être utilisé pour tout enrichissement de région d’intérêt afin de renforcer l’adéquation pour les applications de séquençage en aval dans les flux de travail cliniques ou de recherche.
Introduction
Le séquençage de nouvelle génération (NGS) est de plus en plus utilisé à la fois pour les soins aux patients et dans la recherche sur le cancer afin d’aider à orienter les traitements et à faciliter les découvertes scientifiques. Les tissus sont souvent limités et de petits échantillons à teneur tumorale variable sont couramment utilisés. L’adéquation et l’intégrité des tumeurs restent donc un obstacle à l’obtention de données significatives. Les échantillons avec des pourcentages tumoraux plus faibles peuvent avoir de la difficulté à distinguer les vraies variantes des artefacts de séquençage et sont souvent inéligibles pour NGS1. Il a été démontré que l’enrichissement tumoral des cas à faible teneur tumorale, ceux inférieurs à 20%, aide à produire suffisamment de matériel pour générer des données de séquençage reproductibles et garantir que les variantes à basse fréquence ne sont pas manquées 2,3. Cependant, les limites varieront en fonction des plates-formes utilisées et de l’utilisation prévue des données générées.
Traditionnellement, l’enrichissement des régions tumorales pour l’extraction est effectué par macrodissection manuelle ou microdissection par capture laser (LCM) de lames de formol incorporées dans de la paraffine fixe (FFPE). La macrodissection manuelle, ou le grattage de zones tissulaires spécifiées à partir de lames, permet d’enlever les régions tumorales pour les utiliser dans des essais en aval à un coût relativement faible, mais avec une faible précision et une faible précision 2,4. Une précision technique minimale peut être très efficace avec des cas de contenu tumoral plus élevé où de grandes étendues de tumeur sont présentes et / ou une perte tissulaire minimale n’a pas d’impact significatif sur les résultats, mais les cas à faible teneur tumorale ou les cas avec une tumeur plus dispersée nécessitent une précision accrue. Le LCM a donc été inventé dans les années 1990 et est devenu un moyen précieux d’éliminer avec précision les petites régions microscopiques de tissu définies des lames de formol incorporées dans la paraffine fixe (FFPE) 5,6,7,8. La LCM peut être utilisée pour collecter des populations unicellulaires lorsqu’il existe une hétérogénéité complexe de l’échantillon9 permettant la collecte de populations cellulaires auparavant difficiles à séparer. Cependant, LCM nécessite des machines coûteuses qui nécessitent une expertise technique approfondie et un temps pratique 10,11,12,13,14.
L’instrument utilisé pour la dissection tissulaire automatisée a une précision comprise entre celle du LCM (~10 μm) et des macrodissections (~1 mm)15. En outre, il présente à la fois des exigences de coût et d’expertise technique entre celle de la macrodissection et de la LCM et est conçu pour effectuer un enrichissement rapide des tissus à partir de lames FFPE séquentielles afin d’atténuer les inconvénients des méthodes précédentes15. La dissection automatisée de cette manière utilise des annotations numériques ou des superpositions d’images de référence de diapositives sur scène sur des lames de tissu non colorées sectionnées en série pour disséquer et enrichir les régions d’intérêt. L’instrument utilise des pointes de fraisage à lame filante en plastique, des tubes de collecte de 1,5 mL et peut être utilisé avec un certain nombre de fluides différents pour la dissection afin de collecter les régions d’intérêt pour les essais en aval, y compris l’extraction et le séquençage nucléiques. La pointe de fraisage en plastique en filature utilise des réservoirs de baril de seringue intérieurs et extérieurs et un piston pour collecter le tampon, puis fraise et collecte le tissu16. Le diamètre variable de la pointe de fraisage (250 μm, 525 μm, 725 μm) peut permettre la dissection de zones tissulaires séparées à des fins de comparaison, de régions multifocales pouvant être regroupées ou de petites zones individuelles à partir de lames FFPE simples ou multiples. Les épaisseurs de section utilisées pour la récolte peuvent être ajustées en fonction des besoins individuels de l’expérience et les utilisateurs peuvent s’assurer que les régions d’intérêt n’ont pas été épuisées en effectuant un H & E supplémentaire sur une section en série immédiatement après la dernière section utilisée pour la récolte.
La dissection automatisée a été identifiée comme un moyen d’enrichir le contenu tumoral dans les cas à faible teneur tumorale et nous avons testé et étendu la fonctionnalité prévue d’un instrument de dissection tissulaire automatisé, qui est actuellement commercialisé pour une utilisation sur des échantillons cliniques FFPE jusqu’à 10 μm d’épaisseur. Les travaux montrent que la dissection automatisée peut être appliquée à la fois aux FFPE et aux coupes de tissus humains ou animaux fraîchement congelés jusqu’à 20 μm d’épaisseur à des fins de recherche. Le protocole démontre également une approche pour annoter numériquement et automatiser la dissection pour l’enrichissement de la tumeur dans les tissus à faible teneur tumorale et / ou les cas avec une tumeur imbriquée et dispersée où une macrodissection significative est difficile ou impossible et montre à la fois la qualité et le rendement de l’acide nucléique suffisant pour le NGS. La dissection automatisée peut donc fournir une précision de niveau intermédiaire et un débit accru pour l’enrichissement des tumeurs et pourrait également être appliquée pour enrichir d’autres régions d’intérêt ou combinée avec d’autres plates-formes pour répondre à des questions de recherche ou cliniques.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Avant l’initiation, obtenir les échantillons de tissus appropriés conformément aux protocoles du Comité d’examen institutionnel (CISR). Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de Genentech, Inc.
1. Préparation des tissus et des lames
- Sélectionnez FFPE ou blocs de tissus frais congelés et utilisez la méthode de traitement correspondante ci-dessous.
- Coupez des sections de blocs de tissu sur des lames de verre chargées positivement à l’épaisseur souhaitée. Découper en série le tissu FFPE en rubans avec la première section de référence coupée à une épaisseur appropriée pour la coloration H & E (c.-à-d. 4 μm), suivie de 1 à 4 sections à une épaisseur allant de 4 à 20 μm en fonction des besoins et de la disponibilité des tissus. Collectez les sections de tissus sur des lames de microscope en verre chargées positivement.
REMARQUE: Les sections de tissus de référence fraîchement congelées doivent être colorées immédiatement avec de l’hématoxyline et de l’éosine (H & E) en utilisant des protocoles de routine pour les sections congelées et les sections congelées non colorées maintenues à -20 ° C jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires pour la récolte. - Laissez toutes les sections FFPE sécher à température ambiante pendant la nuit.
- Cuire les lames de référence FFPE à 60 °C pendant 30 min, puis les tacher avec H&E en utilisant des protocoles de routine.
- Scannez les diapositives colorées H&E sur un imageur de diapositives entières à un grossissement de 20x ou plus.
- Annotez les images de diapositives numérisées pour les régions tumorales d’intérêt à l’aide d’une plate-forme de visualisation fournie par le fournisseur ou d’une visionneuse open source. Exportez ces annotations sous forme de capture d’écran à faible grossissement ou enregistrez-les en tant que fichier de métadonnées contenant les coordonnées des pixels X-Y correspondant aux sommets des polygones.
REMARQUE: Le premier est moins difficile techniquement à utiliser, mais le second offre des avantages dans l’automatisation des processus. - Créez des masques numériques des régions annotées d’intérêt conformément à l’approche utilisée et exportez les annotations manuelles.
REMARQUE: Si une capture d’écran / image des annotations est utilisée, un logiciel de traitement d’image simple peut être utilisé pour sélectionner une région et remplir toute la sélection. L’utilisation des coordonnées X-Y pour chaque retour sur investissement nécessite l’utilisation d’un langage de programmation pour lire à la fois les données d’image et les coordonnées de polygone afin de créer une image à faible mag avec des régions d’intérêt remplies. L’utilisateur doit travailler avec le fournisseur d’instruments de dissection automatisés pour établir un processus basé sur la disponibilité et les besoins de son logiciel individuel. Si la numérisation, l’annotation numérique des diapositives et/ou la création de masques numériques ne sont pas disponibles, une annotation minutieuse sur la diapositive à l’aide d’un marqueur peut être effectuée et utilisée à la place d’un masque numérique comme image de référence. Le pseudocode pour la création de masques numériques a été fourni dans le fichier supplémentaire 1.
2. Dissection tissulaire automatisée
- Placez les lames de tissu d’échantillon non colorées sur la scène dans les positions de la première à la quatrième diapositive lorsque vous utilisez une référence de diapositive numérique. Lorsque vous utilisez l’annotation sur diapositive plutôt qu’une option numérique, placez les diapositives de tissu d’échantillon non colorées sur la scène dans les positions de la deuxième à la quatrième diapositive avec une diapositive de référence en première position.
- Créer une tâche de fraisage à l’aide du logiciel automatisé de dissection de tissus : Sélection de tâches > Créer une nouvelle tâche > ID de cas > Nommez la tâche de fraisage ; accédez à Epaisseur > Epaisseur de section à l’aide de l’onglet flèche haut ou bas ; puis allez dans Préparation des tissus > Paraffinisé ou déparaffinisé, Image de référence > À partir d’un fichier > Importer une image > Fichier à importer à partir de la liste déroulante en tant que référence numérique, le cas échéant. Sélectionnez À partir de la scène pour la référence de diapositive sur la scène. Lorsque les champs sont remplis, scannez la scène en sélectionnant le bouton Étape de numérisation dans le coin inférieur droit pour capturer chaque diapositive de tissu d’échantillon en première à quatrième position.
- Sélectionnez la zone tissulaire pour la capture d’image.
- Si vous utilisez une référence sur scène, faites glisser la zone d’un coin vers l’autre pour créer une zone rectangulaire sur le tissu. Sélectionnez la bulle circulaire sous la zone rectangulaire pour capturer l’image de référence de la scène. Si vous utilisez une image de référence numérique, superposez l’image sur la zone rectangulaire sélectionnée. Redimensionnez et alignez grossièrement la référence numérique dans le zoom du cours pour correspondre au mieux à la taille et à la position sur le tissu de l’échantillon.
- Copiez ce champ rectangulaire sur les diapositives de tissu d’échantillon restantes dans les positions de la deuxième à la quatrième diapositive en sélectionnant l’option de copie dans le coin supérieur droit de l’image de référence. Alignez et redimensionnez grossièrement si nécessaire.
REMARQUE : Lorsque vous utilisez une image de référence sur la diapositive plutôt qu’un masque numérique, sélectionnez la diapositive sur la scène à utiliser comme référence.
- Aligner les diapositives de référence et d’exemple
- Lorsque l’image de référence est grossièrement alignée sur des diapositives d’échantillons de tissus dans toutes les positions de diapositives, sélectionnez le bouton Scan Stage dans le coin inférieur droit de l’écran pour passer à l’étape de réglage fin. Sélectionnez la position de la première étape et l’icône de l’outil Transformation (la troisième icône vers le bas dans la barre d’outils de droite) pour effectuer des ajustements d’alignement et de zoom précis de la référence afin de correspondre au mieux à la superposition de diapositives d’échantillon. Utilisez la barre coulissante Référence à l’échantillon en bas de l’écran pour basculer entre l’image de référence et l’image d’échantillon, ainsi que les fonctions Zoom avant et Zoom arrière pour ajuster et obtenir l’alignement de chaque position de diapositive. Répliquez ce processus dans les positions de diapositive de la deuxième à la quatrième échantillon.
- Sélectionnez la zone de fraisage de la région d’intérêt
- Une fois que la superposition optimale de l’échantillon de chacune des quatre positions de diapositive est obtenue, dessinez les désignations de tracé de fraisage à l’aide de l’icône de l’outil Sélecteur de couleurs (la dixième icône vers le bas dans la barre d’outils de droite) sur la partie colorée de l’image de référence masquée. Activez la zone Étendre jusqu’à similaire si plusieurs diapositives ou zones sont annotées pour la dissection, puis sélectionnez le bouton Obtenir une ou plusieurs annotations en bas à droite pour dessiner des tracés de fraisage sur des diapositives d’échantillon.
- Sélectionnez le tracé de fraisage dans la première position de la diapositive.
REMARQUE : Lorsque le tracé de fraisage est sélectionné dans la première position de diapositive, il est copié sur les positions de diapositive restantes et l’utilisation de la pointe de fraisage est calculée. L’utilisation de la pointe de fraisage dans le coin supérieur gauche est calculée en fonction de la surface couverte et de la taille de la pointe sélectionnée. Si plus de quatre pointes sont calculées, une taille de pointe plus grande peut être sélectionnée pour capturer le retour sur investissement annoté. La taille de la pointe peut être sélectionnée ou modifiée sur le côté gauche de l’écran sous la flèche Pointe de fraisage et l’utilisation de la pointe sera recalculée. - Lorsque le chemin de fraisage est calculé, collectez le retour sur investissement annoté avec quatre pointes de fraisage ou moins. Sélectionnez le bouton Étape de configuration en bas à droite de l’écran pour inviter le chargement des embouts de fraisage des tubes de collecte placés dans leur désignation appropriée sur la scène.
- Remplissez le réservoir avec 3,0 mL du tampon de dissection le plus approprié pour le type de tissu (FFPE ou fraîchement congelé) et les besoins du kit d’extraction d’acides nucléiques en aval et sélectionnez le bouton Disséquer dans le coin inférieur droit de l’écran. Utilisez de l’huile minérale de qualité moléculaire ou un tampon approprié provenant de kits d’extraction d’acides nucléiques disponibles dans le commerce.
REMARQUE: La dissection automatisée des diapositives et des régions d’intérêt sélectionnées commence alors et des échantillons sont collectés par l’instrument. La tête de l’unité ramassera les pointes de fraisage à l’arrière de la scène et se remplira de liquide de dissection du réservoir. Les pointes tournent ensuite le long du chemin de fraisage en aspirant l’échantillon de tissu à partir des lames jusqu’à ce qu’elles soient complètes ou pleines. L’échantillon prélevé avec du liquide de dissection est ensuite distribué dans des tubes de prélèvement situés à l’arrière de la scène. - Une fois la dissection automatisée terminée, retirez les tubes de prélèvement et les lames d’échantillon disséquées de la scène et placez-les dans un rack à tubes et un rack à glissière, respectivement.
REMARQUE: Les récoltes fraîches congelées doivent être prises directement dans l’extraction des acides nucléiques conformément aux instructions du fabricant et les sections fraîches congelées après la dissection doivent être colorées immédiatement en utilisant des protocoles de routine pour les sections congelées. - Cuire les lames de tissu disséquées à 60 °C pendant 30 min, puis les tacher avec H&E en utilisant des protocoles de routine.
- Scannez les diapositives colorées H&E disséquées sur un imageur de diapositives entières à un grossissement de 20x et / ou archivez pour une référence du tissu qui n’a pas été collecté et reste sur la diapositive.
REMARQUE: Voir l’étape 1.5 ci-dessus pour d’autres options d’analyse.
3. Extraction des acides nucléiques
- Mettre en commun et abreuver le tissu. Effectuez l’extraction des acides nucléiques à l’aide d’un kit disponible dans le commerce et en suivant les instructions du fabricant.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Des coupes hépatiques de souris FFPE et FF contenant un cancer colorectal métastatique dans des xénogreffes ont été sélectionnées. Les sections ont été colorées H & E (Figure 1A, E, I) et numérisées sur un imageur de diapositives entières à un grossissement de 20x. Un pathologiste a annoté numériquement les régions tumorales d’intérêt et un masque a été généré à l’aide d’un logiciel commercial et formaté comme une image de référence png numérique (Fi...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Présenté ici est un protocole pour l’application de l’annotation numérique et de la dissection automatisée pour disséquer les régions tumorales à partir de FFPE à faible teneur tumorale ou de tissus frais congelés pour l’enrichissement et l’utilisation de la tumeur dans WES. La combinaison de l’annotation numérique et de la création de masques avec la dissection automatisée réduit considérablement le temps pratique et l’expertise requis communs aux méthodes classiques d’enrichissement des tumeurs, y compris la macrodisse...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Charles A Havnar, Oliver Zill, Jeff Eastham, Jeffrey Hung, Jennifer Giltnane, Nicolas Lounsbury, Daniel Oreper, Sarajane Saturnio et Amy A Lo sont des employés et des actionnaires de Genentech et Roche et Mana Javey et Emmanuel Naouri sont des employés et des actionnaires de Roche.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier Carmina Espiritu et Robin E. Taylor pour leur soutien dans le développement de dissections automatisées ainsi que le personnel du Genentech Pathology Core Laboratory qui a soutenu ce travail.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Agilent SureSelectXT | Agilent | G9611A | |
| AVENIO Millisect Station | de remplissage Roche | 8106533001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Base | Roche | 8106568001 | |
| AVENIO Millisect Instrument, Tête | Roche | 8106550001 | |
| AVENIO Millisect Pointes de fraisage Petit | Roche | 8106509001 | |
| AVENIO Millisect PC | Roche | 8106495001 | |
| BioAnalyzer | Agilent | G2939BA | |
| Eppendorf 5427R | Eppendorf | 22620700 | Micro-centrifugeuse |
| Tampon d’incubation | Promega | D920D | |
| Leica Autostainer XL | Leica | ST5010 | Colorateur automatisé |
| Huile minérale de qualité moléculaire | Sigma | M5904-500ML | |
| Protéinase K | Promega | V302B | Tampon de digestion |
| Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80284 | |
| Tampon RLT Plus | Qiagen | 80204 | |
| Superfrost Plus Lames de microscope chargées positivement | Thermo Scientific | 6776214 |
Références
- Cho, M., et al. Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences. Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).
- Smits, A. J. J., et al. The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate. Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).
- Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium. The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).
- Viray, H., et al. A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).
- El-Serag, H. B., et al. Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC Medical Genomics. 4, 48(2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC Medical Genomics. 2, 13(2009).
- Civita, P., et al. Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues. Frontiers in Oncology. 9, 482(2019).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).
- Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).
- Grafen, M., et al. Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).
- Javey, M., et al. innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics. The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).
- Adey, N., et al. A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation. BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29(2013).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
