Ici, nous présentons un protocole de transplantation tumorale pour la caractérisation des lymphocytes infiltrés tumoraux inhérents à la tumeur et dérivés de la périphérie dans un modèle tumoral murin. Le traçage spécifique de l’afflux de cellules immunitaires dérivées du receveur avec cytométrie en flux révèle la dynamique des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules au cours des réponses immunitaires antitumorales.
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Article de méthode
Transplantation tumorale pour évaluer la dynamique des lymphocytes T CD8+ infiltrant la tumeur chez la souris
Dans cet article
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Résumé
Résumé
L’immunité médiée par les lymphocytes T joue un rôle crucial dans les réponses immunitaires contre les tumeurs, les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) jouant le rôle principal dans l’éradication des cellules cancéreuses. Cependant, les origines et la reconstitution des lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène tumoral dans le microenvironnement tumoral (TME) restent obscures. Ce protocole utilise la lignée cellulaire de mélanome B16F10-OVA, qui exprime de manière stable le néoantigène de substitution, l’ovalbumine (OVA) et les souris OT-I transgéniques TCR, dans lesquelles plus de 90% des lymphocytes T CD8+ reconnaissent spécifiquement le peptide dérivé de l’OVA OVA257-264 (SIINFEKL) lié à la molécule H2-Kb du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de classe I. Ces caractéristiques permettent d’étudier les réponses des lymphocytes T spécifiques de l’antigène au cours de la tumorigenèse.
En combinant ce modèle avec la chirurgie de transplantation tumorale, les tissus tumoraux de donneurs ont été transplantés dans des souris receveuses syngéniques appariées à une tumeur pour tracer avec précision l’afflux de cellules immunitaires dérivées du receveur dans les tissus de donneurs transplantés, permettant l’analyse des réponses immunitaires de CD8+ spécifiques à l’antigène inhérent à la tumeur et d’origine périphérique Lymphocytes T. Une transition dynamique s’est produite entre ces deux populations. Collectivement, cette conception expérimentale a fourni une autre approche pour étudier avec précision les réponses immunitaires des lymphocytes T CD8+ dans le TME, ce qui apportera un nouvel éclairage sur l’immunologie tumorale.
Introduction
La réponse immunitaire médiée par les lymphocytes T CD8+ joue un rôle central dans le contrôle de la croissance tumorale. Au cours de la tumorigenèse, les lymphocytes T CD8+ naïfs sont activés lors de la reconnaissance de l’antigène d’une manière restreinte au CMH de classe I, puis se différencient en cellules effectrices et s’infiltrent dans la masse tumorale 1,2. Cependant, dans le microenvironnement tumoral (TME), une exposition prolongée à l’antigène, ainsi que des facteurs immunosuppresseurs, conduisent les lymphocytes T CD8+ spécifiques à la tumeur infiltrés dans un état ....
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Protocole
Toutes les expériences sur la souris ont été réalisées conformément aux directives des comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux de la troisième université médicale militaire. Utilisez des souris C57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines et des souris transgéniques OT-I naïves pesant de 18 à 22 g. Utilisez à la fois l’homme et la femme sans randomisation ni « aveugle ».
1. Préparation du milieu et des réactifs
- Préparer le milieu de culture cellulaire D10 tel que décrit précédemment29 en ajoutant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 U/mL de pénicilline, 100 mg/mL de streptomycine et 2 mM de L-gluta....
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Résultats
Le schéma de ce protocole est illustré à la figure 1. Huit jours après l’inoculation tumorale, des cellules CD45.1+ et CD45.1+CD45.2+ OT-I ont été injectées dans des souris C57BL/6 porteuses de tumeurs B16F10-OVA. La tumeur a été disséquée chirurgicalement à partir de souris implantées par cellules CD45.1+ OT-I (donneuse) le jour 8 après le transfert et transplantée dans des souris CD45.1 + CD45.2+ OT-I implantées dans le flan.......
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Discussion
L’immunité médiée par les lymphocytes T joue un rôle crucial dans les réponses immunitaires contre les tumeurs, les CTL jouant le rôle principal dans l’éradication des cellules cancéreuses. Cependant, les origines des CTL spécifiques de l’antigène tumoral dans le TME n’ont pas été élucidées30. L’utilisation de ce protocole de transplantation tumorale a fourni un indice important que les lymphocytes T CD8+ spécifiques de l’antigène intratumoral peuvent ne pas persister longtemps, malgré .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par des subventions du National Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (n ° 31825011 à LY) et de la National Natural Science Foundation of China (n ° 31900643 à QH, n ° 31900656 à ZW).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,22 &mu ; m filter | Millipore | SLGPR33RB | |
| 1 mL | KDL | BB000925 | |
| 1,5 mL Tube à centrifuger | KIRGEN | KG2211 | |
| 100 U | BD Biosciences | 320310 | |
| Tube conique 15 mL | BEAVER | 43008 | |
| 2,2,2-Tribromoéthanol (Avertin) | Sigma | T48402-25G | |
| 2-Méthyl-2-butanol | Sigma | 240486-100ML | |
| 70 &mu ; m passoire cellulaire en nylon | BD Falcon | 352350 | |
| APC anti-souris CD45.1 | BioLegend | 110714 | Clone :A20 |
| B16F10-OVA lignée cellulaire | bluefbio | BFN607200447 | |
| BSA-V (albumine sérique bovine) | Bioss | bs-0292P | |
| BV421 Souris Anti-souris CD45.2 | BD Horizon | 562895 | Clone :104 |
| boîte | de culture cellulaireBEAVER | 43701/43702/43703 | |
| centrifugeuse | Eppendorf | 5810R-A462/5424R | |
| cyclophosphamide | Sigma | C0768-25G | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | C11995500BT | |
| EasySep Mouse CD8+ T Cell Isolation | Kit | 19853 | |
| EDTA | Sigma | EDS-500g | |
| Tubes FACS | BD Falcon | 352052 | |
| sérum fœtal bovin | Gibco | 10270-106 | |
| Cytomètre en flux | BD | FACSCanto II | |
| hémocytomètre | PorLab Scientific | HM330 | |
| isoflurane | RWD sciences de la vie | R510-22-16 | |
| KHCO3 | Sangon Biotech | A501195-0500 | |
| LIVE/DEAD Kit de coloration à cellules mortes proche IR fixable, pour excitation 633 ou 635 nm | Life Technologies | L10199 | |
| porte-aiguille | RWD Life Science | F31034-14 | |
| NH4Cl | Sangon Biotech | A501569-0500 | |
| paraformaldéhyde | Beyotime | P0099-500ml | |
| PE anti-souris TCR V&alpha ; 2 | BioLegend | 127808 | Clone :B20.1 |
| Pen Strep Glutamine (100x) | Gibco | 10378-016 | |
| PerCP/Cy5.5 anti-souris CD8a | BioLegend | 100734 | Clone :53-6.7 |
| RPMI-1640 | Sigma | R8758-500ML | |
| azoture de sodium | Sigma | S2002 | |
| pince chirurgicale | RWD Life Science | F12005-10 | |
| ciseaux chirurgicaux | RWD Life Science | S12003-09 | |
| fil de suture | RWD Life Science | F34004-30 | |
| trypsine-EDTA | Sigma | T4049-100ml |
Références
- Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion. Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).
- Leko, V., Rosenberg, S. A. Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors. Cancer Cell. 38 (4),....
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Réimpressions et autorisations
Erratum
Formal Correction: Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice
Posted by JoVE Editors on 4/29/2022. Citeable Link.
An erratum was issued for: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice. The Protocol was updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse's eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered.
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
