Étude de la phagocytose de Leishmania à l’aide de la microscopie confocale

La leishmaniose est une maladie tropicale négligée causée par des parasites protozoaires du genre Leishmania, entraînant un large éventail de manifestations cliniques chez l’hôte vertébré, notamment la leishmaniose cutanée, la leishmaniose cutanéo-muqueuse et la leishmaniose viscérale¹. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) estime que plus d’un milliard de personnes sont à risque, avec plus d’un million de nouveaux cas signalés chaque année².

Les espèces du genre Leishmania sont des protozoaires intracellulaires obligatoires qui survivent à l’intérieur des cellules hôtes, y compris les monocytes, les macrophages et les cellules dendritiques³. L’interaction leishmanie-macrophage est un processus complexe qui implique plusieurs récepteurs de cellules hôtes et ligands parasitaires soit par interaction directe, soit par opsonisation impliquant les récepteurs du complément ^4,5. Les récepteurs de surface classiques, tels que CR1, CR3, mannose-fucose, fibronectine, récepteurs de type Toll et charognards, interviennent dans la fixation du parasite aux macrophages ^6,7,8. Ces récepteurs reconnaissent les molécules à la surface de Leishmania, notamment la glycoprotéine de 63 kDa (gp63) et le lipophosphoglycane glycolipidique (GPL)⁹. Ce sont les molécules les plus abondantes à la surface des promastigotes et jouent un rôle essentiel dans la subversion de la réponse immunitaire de l’hôte, favorisant l’établissement d’une infection parasitaire dans les cellules de^{mammifères10}. Une fois que les ligands de surface du parasite se lient aux récepteurs des macrophages, la F-actine s’accumule sur les surfaces cellulaires des mammifères, entourant les parasites au fur et à mesure qu’ils sont phagocytés. Par la suite, cela conduit à la formation d’un compartiment induit par le parasite appelé vacuole parasiphore (PV), qui présente des caractéristiques phagolysosomales¹¹. Une fois à l’intérieur de ces phagolysosomes, les parasites subissent plusieurs altérations essentielles à la survie et à la^{multiplication3}.

La biogenèse des PV est un processus de trafic membranaire hautement réglementé essentiel à la survie intracellulaire de cet agent pathogène¹². La formation de ce compartiment résulte d’événements de fusion séquentielle entre les phagosomes et les compartiments de la voie endocytaire de l’hôte. Des études classiques de biologie cellulaire ont révélé que la maturation des PV implique l’acquisition de protéines G monomères Rab 5 et Rab 7, qui sont principalement associées à une maturation précoce et tardive des endosomes, respectivement¹³. De plus, ces compartiments acquièrent les protéines membranaires associées aux lysosomes 1 et 2 (LAMP 1, LAMP 2), les principaux constituants protéiques de la membrane lysosomale et la protéine 1A/1B-light chain 3 (CL3) associée aux microtubules, un marqueur autophagosome¹⁴. Malgré des similitudes apparentes, la cinétique de formation de PV^15,16 et la morphologie de ces compartiments varient selon les espèces de Leishmania. Par exemple, une infection causée par L. mexicana ou L. amazonensis induit la formation de grands compartiments contenant un grand nombre de parasites¹⁷. En revanche, d’autres espèces, comme L. braziliensis et L. infantum, forment des vacuoles plus petites qui ne contiennent normalement qu’un ou deux parasites dans chaque vacuole¹⁸.

Malgré cette connaissance de l’interaction entre la cellule hôte et la leishmanie, les événements initiaux déclenchés par le contact entre les récepteurs de l’hôte et les ligands du parasite n’ont pas été entièrement élucidés. Ces événements sont connus pour être des déterminants de l’issue de l’infection parasitaire et dépendent des espèces parasitaires, du type de récepteurs de la cellule hôte recrutés pour reconnaître les parasites et de l’activation des voies de signalisation des macrophages^19,20. Par conséquent, il est essentiel d’identifier les molécules impliquées dans la biogenèse des PV induites par Leishmania et de déterminer le(s) rôle(s) joué(s) par ces molécules dans l’établissement et l’issue de l’infection. Ici, nous décrivons une méthode de surveillance des événements précoces survenant au cours de la phagocytose de Leishmania, y compris la liaison, l’internalisation, la formation et la maturation des phagosomes. Ce travail pourrait aider à clarifier la participation de PLC, Akt, Rab5, Rab7 et LC3 dans la formation de PV induite par différentes espèces de Leishmania. Il est important de noter que ce protocole peut être utilisé pour étudier la participation d’autres protéines impliquées dans la maturation PV. Les études futures élargiront les connaissances sur les mécanismes impliqués dans l’interaction Leishmania-cellule hôte et contribueront à la conception de nouvelles stratégies chimiothérapeutiques.

Les cellules ont été obtenues à partir de donneurs sains après l’approbation des procédures par les comités nationaux d’éthique de la recherche (ID: 94648218.8.0000.0040).

1. Cultures cellulaires

1. Macrophages dérivés de monocytes humains
   NOTE: Pour obtenir des macrophages dérivés de monocytes humains pour la différenciation in vitro en macrophages, prélever du sang de donneurs sains et purifier les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) comme décrit par D. English et B. R. Andersen²¹.
   1. Après avoir recueilli le sang périphérique (50 mL), versez-le dans un tube hépariné, puis diluez le sang 1:1 dans une solution tampon phosphate (PBS) à température ambiante. Placer délicatement le sang hépariné dilué sur le milieu de gradient de densité préalablement réparti.
   2. Centrifuger les tubes à 252 × g pendant 30 min à 24 °C pour éviter l’hémolyse.
      REMARQUE: Réglez la rupture de la centrifugeuse pour éviter le mélange des couches de gradient. Après centrifugation, des couches de gradient discontinues sont formées de bas en haut : érythrocytes, milieu de gradient de densité, cycle PBMC et plasma.
   3. Transférer l’anneau PBMC, situé entre le milieu de gradient de densité et les couches de plasma, dans un nouveau tube et remplir de PBS pour éliminer l’excès de milieu de gradient de densité.
   4. Laver les cellules une fois et centrifuger à 190 × g pendant 10 min à 4 °C.
   5. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 1 mL de milieu RPMI complet.
   6. Compter les cellules et plaquer 2 × 10⁶ cellules dans 500 mL du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté en 25 mM d’acide N-[2-hydroxyéthyl]pipérazine-N′-[2-éthane sulfonique] (HEPES), 2 g/L de bicarbonate de sodium, 2 mM de glutamine, 20 g/mL de ciprofloxacine et 10 % de sérum fœtal bovin inactivé (FBS) (milieu RPMI complet) pendant 7 jours à 37 °C sous 5 % de CO₂ dans une plaque de 24 puits pour permettre aux monocytes de se différencier en macrophages par adhérence.
2. Cultures THP-1
   1. Cultiver la lignée cellulaire THP-1 à une concentration de 2 × 10⁵ cellules dans 10 mL de milieu RPMI complet dans une fiole de culture de 75 cm² .
   2. Maintenir les cultures cellulaires dans un incubateur à 37 °C sous 5% de CO₂ pendant 7 jours.
   3. Centrifuger les cellules à 720 × g pendant 10 min à 4 °C et remettre la pastille en suspension dans un milieu RPMI complet.
   4. Compter les cellules dans une chambre de Neubauer.
   5. Cellules en plaques sur lamelles de verre de 13 mm à une concentration de 2 × 10⁵ cellules par puits dans 500 μL de milieu RPMI complet contenant 100 nM d’acétate de myristate de phorbol (PMA) à 37 °C sous 5% de CO₂ pour permettre la différenciation des cellules THP1 en macrophages.
   6. Après trois jours, laver deux fois les cellules avec une solution de NaCl à 0,9% pour éliminer le milieu contenant de la PMA.
   7. Incuber des cellules THP-1 différenciées dans un milieu RPMI complet sans PMA à 37 °C sous 5% de CO 2 pendant₂ jours supplémentaires avant de commencer l’expérimentation.

2. Cultures de parasites et coloration rouge CellTracker

REMARQUE: Pour visualiser les parasites par microscopie à fluorescence, effectuez une coloration à l’aide du colorant fluorescent rouge CellTracker (CMTPX). Alternativement, d’autres marqueurs, y compris la carboxyfluorescéine, peuvent être utilisés conformément aux instructions du fabricant ou des promastigotes exprimant de manière constitutive GFP, RFP ou d’autres gènes rapporteurs fluorescents. Les parasites utilisés pour infecter les cellules sont ceux en phase stationnaire de croissance obtenus à partir d’une culture axénique promastigote ne dépassant pas 7 passages.

1. Cultiver Leishmania spp. promastigotes à 1 x 10 5 parasites par 1 000 μL de milieu dans une fiole de culture cellulaire contenant⁵ mL de milieu de Schneider supplémentés en gentamicine à 50 μg/mL et 10 % de FBS.
2. Après avoir incubé des cultures axéniques de parasites dans une demande biochimique en oxygène (B.O.D.) à 24 °C, effectuer un comptage quotidien dans une chambre de Neubauer. Vérifiez la forme du parasite (mince, allongé) et la mobilité pendant 5 jours. Les parasites sont considérés comme en phase stationnaire de croissance lorsque deux comptages consécutifs avec 8 heures d’intervalle affichent des quantités similaires.
3. Lorsque vous atteignez la phase stationnaire de croissance, incuber les parasites dans 4 mL de solution de NaCl à 0,9% avec 1 μM CMTPX pendant 15 min à 37 °C sous 5% de CO₂ en évitant le contact avec la lumière.
4. Ajouter FBS à une proportion de 1:1 et incuber la suspension du parasite pendant 1 minute supplémentaire.
5. Laver les parasites trois fois avec du PBS, puis les centrifuger à 1 781 × g pendant 10 min.
6. Suspendre la pastille parasitaire dans 1 000 μL de milieu complet RPMI.
7. Comptez les parasites dans une chambre de Neubauer.

3. Évaluation de la liaison de Leishmania aux macrophages

1. Graine 2 × 10^{cellules 5} THP-1 ou macrophages dérivés de monocytes humains dans 500 μL de milieu RPMI complet par puits sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm.
2. Cultiver des cellules à 37 °C sous 5% de CO₂ pendant 24 h.
3. Laver les cellules deux fois avec une solution de NaCl à 0,9% et incuber dans un milieu RPMI complet à 4 °C pendant 10 min.
4. Ajouter des promastigotes en phase stationnaire tels que décrits par A. L. Petersen²² dans un rapport de 10:1 avec les plaques de puits, puis centrifuger à 720 × g pendant 5 min sous 4 °C.
5. Incuber à 4 °C pendant 5 min.
6. Lavez les cellules deux fois avec une solution de NaCl à 0,9% pour éliminer les promastigotes non internalisés.
7. Fixer les cellules dans du paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min à température ambiante.
8. Incuber les lames de couverture avec 15 mM_NH4Cl pendant 15 min à température ambiante.
9. Laver trois fois avec du PBS 0,15 % d’albumine sérique bovine (BSA). Incuber avec une solution bloquante (3% BSA dans PBS) pendant 1 h à température ambiante.
10. Laver trois fois avec du PBS, puis perméabiliser avec du PBS-Saponin à 0,15 % pendant 15 min à température ambiante.
11. Ajouter la phalloïdine (diluée 1:1 200) pendant 1 h à température ambiante et protéger de la lumière.
12. Montez les lamelles de recouvrement à l’aide d’un support de montage.
13. Acquérir des images au moyen d’un microscope confocale à fluorescence à l’aide d’un objectif 63×/1,4.

4. Évaluation de la phagocytose de Leishmania par les macrophages

1. Graine 2 × 10^{cellules 5} THP-1 ou macrophages dérivés de monocytes humains dans 500 μL de milieu RPMI complet par puits sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm.
2. Cultiver des cellules pendant 24 h à 37 °C sous 5% de CO₂.
3. Laver les cellules deux fois dans une solution de NaCl à 0,9 % et incuber dans un milieu RPMI complet dans une plaque de 24 puits à 4 °C pendant 10 min.
4. Ajouter la phase stationnaire Leishmania spp. comme décrit par A. L. Petersen²² à un rapport 10:1 (parasite:cellule hôte), puis centrifuger à 720 × g pendant 10 min sous 4 °C.
5. Incuber les cellules à 4 °C pendant 5 min.
6. Lavez les cellules deux fois avec une solution de NaCl à 0,9% pour éliminer les promastigotes non internalisés.
7. Incuber les cellules dans un milieu RPMI supplémenté à 37 °C pendant 1 h.
8. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 15 min.
9. Montez les lamelles de recouvrement à l’aide du support de montage préféré.
10. Compter pas moins de 400 cellules dans des champs aléatoires sous un microscope à fluorescence en utilisant un objectif de 100×/1,4.

5. Évaluation de la maturation vacuole induite par Leishmania

NOTE: La transfection cellulaire THP-1 doit être effectuée comme décrit par M. B. Maess, B. Wittig et S. Lorkowski ²³. Nous résumons ici ce protocole, avec un minimum de modifications. La nucléofection est une méthode de transfection spécifique qui nécessite un nucléofector. Comme méthode alternative, les cellules peuvent être transfectées en utilisant la lipofectamine²⁴ et la transduction du lentivirus²⁵.

1. Pour étudier la biogenèse de la PV induite par Leishmania, transfecter des cellules THP1 avec PLC 26,27, Akt 26,27, Rab 5 28,29,30 ou Rab 7^28,29,31 plasmides.
   REMARQUE: Cette méthodologie peut être utilisée pour transfecter les cellules THP-1 avec d’autres gènes que ceux énumérés ci-dessus.
2. Cellules THP-1 de semence à 1,5 x 10⁷ dans 75 cm² de flacons de culture tissulaire contenant 10 mL de milieu RPMI complet supplémenté avec 100 ng/mL de PMA et 50 μM de 2-mercaptoéthanol pendant 48 h.
3. Laver les cellules une fois dans une solution de NaCl à 0,9%.
4. Détacher les cellules à l’aide d’une solution de dissociation cellulaire non enzymatique et centrifuger (250 × g) pendant 5 min à température ambiante.
5. Resuspendre les cellules THP-1 dans 1 mL de milieu RPMI et effectuer des comptages dans une chambre Neubauer.
6. Centrifuger à nouveau les cellules THP-1 à 250 × g pendant 10 min à température ambiante. Jetez le surnageant.
7. Resuspendre 2 × 10⁶ cellules dans 100 μL de solution de Nucleofector et incuber avec 0,5 μg du plasmide codant pour la protéine d’intérêt, marqué avec une protéine fluorescente.
8. Transférer la suspension contenant des cellules THP-1 et de l’acide nucléique dans la cuvette Nucleofector.
9. Transfect de cellules THP1 à l’aide du programme Nucleofector Y-001.
10. Récupérer les cellules transfectées (2x10⁶) et les ensemencer dans un milieu RPMI de 500 μL sur des plaques de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm (4 puits/transfection).
11. Incuber les cellules THP-1 dans un milieu RPMI complet à 37 °C pendant 0,5, 2, 4, 6, 12 et 24 h.
12. Répétez les étapes 3.13 et 3.13.

6. Évaluation du recrutement de LC3 à Leishmania spp. PVs

REMARQUE : Le marqueur membranaire autophagique LC3 peut être utilisé pour déterminer si les phagosomes présentent des caractéristiques autophagiques. Le recrutement de CL3 dans les PV induites par Leishmania peut être évalué pendant l’infection par immunomarquage des cellules avec l’anticorps anti-LC3, comme décrit précédemment par C. Matte³² et B. R. S. Dias³³.

1. Semer 2 × 10^{cellules 5} THP-1 ou macrophages dérivés de monocytes humains dans un milieu RPMI complet de 500 μL sur une plaque de 24 puits avec des lamelles de verre de 13 mm.
2. Cultiver des cellules pendant 24 h à 37 °C sous 5% de CO₂.
3. Laver les cellules deux fois dans une solution de NaCl à 0,9% et incuber dans un milieu RPMI complet.
4. Ajouter des promastigotes Leishmania spp. en phase stationnaire tels que décrits par A. L. Petersen²² dans un rapport de 10:1 (parasite: cellules hôtes) et centrifuger les cellules à 720 × g pendant 5 min sous 4 °C.
5. Incuber à 37 °C pendant 30 min ou 4 h. Ensuite, lavez deux fois et fixez les cellules pour évaluer le recrutement de CL3 dans les membranes photovoltaïques induites par Leishmania aux premiers stades de l’infection.
   1. Alternativement, pour évaluer le recrutement de CL3 sur les membranes PV aux stades ultérieurs de l’infection, laver deux fois un autre groupe de macrophages à 4 h d’infection pour éliminer tous les promastigotes non internalisés. Incuber les cellules infectées dans un milieu RPMI complet pendant 12 h et 24 h supplémentaires, pour finalement laver deux fois et fixer.
      REMARQUE: Les cellules fixes peuvent être conservées dans une solution de PBS ou de NaCl à 0,9% à 4 °C jusqu’à l’étiquetage.
6. Bloquer et perméabiliser simultanément les cellules fixées dans 0,1% de Triton X-100, 1% de BSA, 20% de sérum de chèvre normal, 6% de lait en poudre écrémé et 50% de FBS pendant 20 minutes à température ambiante.
7. Incuber les cellules avec l’anticorps anti-LC3 (1: 200) dilué dans du PBS pendant 2 h à température ambiante.
   NOTE: En tant que contrôle négatif de l’immunomarquage, un groupe de cellules doit être incubé avec l’immunoglobuline G (IgG) de l’animal d’origine anticorps primaire à une concentration équivalente à celle utilisée pour l’anticorps primaire.
8. Laver les cellules trois fois avec une solution de NaCl à 0,9% à température ambiante.
9. Incuber les cellules avec des IgG anti-lapin de chèvre conjuguées AlexaFluor 488 (1:500) ou les anticorps secondaires conjugués à colorant fluorescent préféré pendant 1 h à température ambiante.
10. Laver les cellules trois fois avec une solution de NaCl à 0,9% à température ambiante.
11. Montez les lamelles de recouvrement à l’aide du support de montage préféré.
12. Acquérir des images au microscope confocale à fluorescence à l’aide d’un objectif 63x/1,4.

7. Acquisition de la microscopie confocale et quantification des Fidji

REMARQUE: L’acquisition d’images d’immunofluorescence doit être effectuée à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser. Pour obtenir une meilleure résolution, utilisez un objectif 63x à immersion dans l’huile.

1. Laissez les lamelles de verre de 13 mm à température ambiante et protégez-les de la lumière au moins 30 minutes avant l’acquisition.
2. Nettoyez les lamelles de couverture avec un mouchoir absorbant.
3. Ajoutez une goutte d’huile d’immersion à l’objectif et ajoutez la lame.
4. Déplacez l’objectif vers le haut jusqu’à ce que l’huile touche la glissière.
5. Observez et ajustez la mise au point sur le microscope et choisissez l’objectif 63x avec huile.
6. Ouvrez le programme Leica et ajustez les lasers dans les longueurs d’onde 488, 552 et 405.
7. Sélectionnez la résolution de l’image 1 024 x 1 024.
8. Cliquez sur le bouton Live , définissez la pile Z et appuyez sur l’option Commencer . Ensuite, recommencez et appuyez sur le bouton Fin . Nous recommandons 20 μm pour l’épaisseur de la tranche afin d’obtenir des images confocales avec de bonnes résolutions.
9. Attendez l’acquisition de l’image, puis sélectionnez l’option « Projection maximale » dans les outils Leica.
10. Enregistrez l’expérience.
11. Exportez les images au format lif ou tiff vers un ordinateur et ouvrez le programme FIJI.
12. Ouvrez l’expérience et définissez la pile de vues avec la pile hyper. Sélectionnez ensuite ouvrir les fichiers individuellement et assembler les tuiles.
13. Sélectionnez l’outil mains libres dans la barre d’outils Fidji et tracez soigneusement la cellule à la main.
14. Appuyez sur le bouton Analyser et mesurez pour visualiser l’intensité de fluorescence.
15. Répétez ce processus à chaque cellule par groupe.
16. Enregistrez les mesures et exportez-les vers un éditeur de tableur.
17. Ajoutez ces données à un programme d’analyse statistique et effectuez l’analyse statistique.

8. Analyse statistique

REMARQUE : Pour l’analyse des données et les graphiques, utilisez un programme d’analyse statistique.

1. Ouvrez le programme.
2. Insérez les données obtenues et testez les paramètres de normalité.
3. Pour les données avec une distribution normale, utilisez le test t de Student et pour les tests non paramétriques, le test de Mann-Whitney.
4. Considérez les données présentant une différence statistiquement significative lorsque la valeur de p est inférieure à 0,05.
5. Préparez des graphiques représentant les données, avec des mesures de tendance centrale (moyenne ou médiane) et des mesures de variation.

Ce rapport vise à évaluer les événements précoces survenant au cours de la phagocytose de L. braziliensis isolé chez des patients présentant la forme L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL de CL. En utilisant la microscopie confocale, nous avons étudié les principaux événements associés à la phagocytose des parasites: liaison, internalisation et maturation du phagosome. Nous avons d’abord évalué la liaison et la phagocytose de L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL par des macrophages dérivés de monocytes humains. Les données montrent que L. braziliensis-LCL et L. braziliensis-DL se lient de la même manière aux macrophages (Figure 1). De plus, aucune différence n’a été observée concernant la phagocytose de L. braziliensis-LCL et de L. braziliensis-DL par les cellules hôtes (Figure 2). Enfin, nous avons comparé le recrutement de CL3 aux PV induits par L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL dans les cellules infectées. Après 30 min, 4 et 12 h d’infection, nous avons observé des pourcentages similaires de PV décorés de LC3 dans les macrophages infectés par L. braziliensis-LCL et L. braziliensis-DL (Figure 3). Ces résultats représentatifs ont montré que L. braziliensis-LCL et L. braziliensis-DL interagissent de manière similaire avec les macrophages lors de la liaison, de la phagocytose et de la biogenèse des PV, concernant le recrutement de la CL3.

Des images microscopiques représentant des cellules THP-1 transfectées efficacement avec des plasmides PLC-GFP, Rab5-GFP, Rab7-GFP sont montrées à la figure 4.

Graphique 1. Évaluation de la liaison de L. braziliensis-LCL et de L. braziliensis-DL aux macrophages humains. Des macrophages humains dérivés de monocytes ont été infectés par L. braziliensis-LCL- ou L. braziliensis-DL. Après 10 min à 4 °C, la liaison a été évaluée par microscopie confocale. (A) Images de microscopie confocale de L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL (marquées avec CMTPX, rouge) se liant aux macrophages (marquées à la phalloïdine, vert). Pour la microscopie confocale, les noyaux cellulaires ont été marqués avec DAPI (bleu). Les flèches représentent la liaison Leishmania-macrophage. (B) Pourcentage de Leishmania se liant aux macrophages. Au total, 30 cellules par groupe ont été analysées. Les données représentent chaque répétition d’une expérience réalisée en quintuplicate (test t non apparié, p > 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 2. Évaluation de la phagocytose de L. braziliensis-LCL et de L. braziliensis-DL par des macrophages humains. Des macrophages dérivés de monocytes humains ont été incubés avec L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL pendant 10 min à 4 °C, suivis de 1 h supplémentaires à 37 °C. Les cellules ont ensuite été analysées par microscopie à fluorescence en comptant un total de 400 cellules. (A) Images de microscopie confocale de macrophages humains infectés par L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL. Pour la microscopie confocale, les noyaux cellulaires ont été marqués avec DAPI (bleu). Les flèches représentent les noyaux des parasites Leishmania. (B) Pourcentage de phagocytose de Leishmania. Les cercles représentent les données de chaque répétition d’une expérience réalisée en triple exemplaire (test t non apparié, p > 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 3. Évaluation du recrutement de CL3 dans les PV induit par L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL dans les macrophages. Des macrophages humains dérivés de monocytes ont été infectés puis colorés avec des anticorps anti-LC3 pendant 30 min, 4 et 12 h. (A) Images de microscopie confocale de macrophages infectés par L. braziliensi s-LCL ou L. braziliensis-DL marqués avec anti-LC3 suivies de l’anticorps secondaire anti-lapin IgG conjugué à Alexa Fluor 488 (vert). Pour la microscopie confocale, les noyaux cellulaires ont été marqués avec DAPI (bleu); (B) Pourcentage de PV induits par L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL décorés de CL3-II. Au total, 30 cellules par groupe ont été analysées. Les cercles correspondent à chaque champ sélectionné au hasard analysé (test t non apparié, p > 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Graphique 4. Cellules THP-1 exprimant PLC, Rab5 ou Rab7. Après différenciation en macrophages, les cellules THP-1 ont été soumises à la nucléofection avec chaque gène d’intérêt couplé à des sondes fluorescentes GFP : PLC, Rab5 et Rab7. Par la suite, ces cellules ont été fixées, ont eu le noyau coloré avec DAPI (bleu) et ont été observées sous un microscope confocal en utilisant un objectif 63x / 1.4. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte ou l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.