Le mécanisme associé à la phagocytose dans l’infection à Leishmania reste mal compris. Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes.
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Article de méthode
Étude de la phagocytose de Leishmania à l’aide de la microscopie confocale
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
La phagocytose est un processus orchestré qui implique des étapes distinctes : la reconnaissance, la liaison et l’internalisation. Les phagocytes professionnels absorbent les parasites Leishmania par phagocytose, consistant à reconnaître les ligands sur les surfaces des parasites par de multiples récepteurs de cellules hôtes. La liaison de Leishmania aux membranes des macrophages se produit par le récepteur du complément de type 1 (CR1) et le récepteur du complément de type 3 (CR3) et les récepteurs de reconnaissance de formes. Le lipophosphoglycane (LPG) et la glycoprotéine de 63 kDa (gp63) sont les principaux ligands impliqués dans les interactions macrophage-leishmania . Après la reconnaissance initiale des ligands du parasite par les récepteurs de la cellule hôte, les parasites deviennent intériorisés, survivent et se multiplient dans les vacuoles parasitophres. Le processus de maturation des vacuoles induites par Leishmania implique l’acquisition de molécules à partir de vésicules intracellulaires, y compris la protéine G monomère Rab 5 et Rab 7, la protéine membranaire associée lysosomale 1 (LAMP-1), la protéine membranaire associée lysosomale 2 (LAMP-2) et la protéine 1A / 1B-chaîne légère 3 associée aux microtubules (CL3).
Ici, nous décrivons des méthodes pour évaluer les événements précoces se produisant lors de l’interaction de Leishmania avec les cellules hôtes en utilisant la microscopie confocale, y compris (i) la liaison (ii) l’internalisation et (iii) la maturation du phagosome. En ajoutant à l’ensemble des connaissances entourant ces déterminants de l’issue de l’infection, nous espérons améliorer la compréhension de la pathogenèse de l’infection à Leishmania et soutenir la recherche éventuelle de nouvelles cibles chimiothérapeutiques.
Introduction
La leishmaniose est une maladie tropicale négligée causée par des parasites protozoaires du genre Leishmania, entraînant un large éventail de manifestations cliniques chez l’hôte vertébré, notamment la leishmaniose cutanée, la leishmaniose cutanéo-muqueuse et la leishmaniose viscérale1. L’Organisation mondiale de la santé (OMS) estime que plus d’un milliard de personnes sont à risque, avec plus d’un million de nouveaux cas signalés chaque année2.
Les espèces du genre Leishmania sont des protozoaires intracellulaires obligatoires qui survivent à l’intérieur des cellules hôtes,....
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Protocole
Les cellules ont été obtenues à partir de donneurs sains après l’approbation des procédures par les comités nationaux d’éthique de la recherche (ID: 94648218.8.0000.0040).
1. Cultures cellulaires
- Macrophages dérivés de monocytes humains
NOTE: Pour obtenir des macrophages dérivés de monocytes humains pour la différenciation in vitro en macrophages, prélever du sang de donneurs sains et purifier les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) comme décrit par D. English et B. R. Andersen21.- Après avoir recueilli le sang périphérique (50 mL), versez-le dans un tube hépariné, puis dilue....
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Résultats
Ce rapport vise à évaluer les événements précoces survenant au cours de la phagocytose de L. braziliensis isolé chez des patients présentant la forme L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL de CL. En utilisant la microscopie confocale, nous avons étudié les principaux événements associés à la phagocytose des parasites: liaison, internalisation et maturation du phagosome. Nous avons d’abord évalué la liaison et la phagocytose de L. braziliensis-LCL ou L. braziliensis-DL par des macrop.......
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Discussion
L’interaction leishmanie-macrophage est un processus complexe qui implique plusieurs étapes qui peuvent influencer le développement de la maladie5. Pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l’interaction de Leishmania non opsonisée et des cellules hôtes, nous avons décrit un protocole qui utilise la microscopie confocale à fluorescence pour évaluer la phagocytose des stades précoces à avancés de l’infection à Leishmania. L’utilisation de techniques de fluoresce.......
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Déclarations de divulgation
Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte ou l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit. Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.
Remerciements
Nous remercions l’Institut Gonçalo Moniz, Fiocruz Bahia, Brésil et le département de microscopie pour leur aide. Ce travail a été soutenu par INOVA-FIOCRUZ numéro 79700287000, P.S.T.V. détient une subvention pour la productivité dans la recherche du CNPq (305235/2019-2). Les plasmides ont été aimablement fournis par Mauricio Terebiznik, Université de Toronto, CA. Les auteurs tiennent à remercier Andris K. Walter pour la révision de la langue anglaise et l’aide à la révision des manuscrits.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 2-mercaptoéthanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| AlexaFluor 488 Chèvre conjuguée anti-lapin IgG | Thermo Fisher Scientific | Tem varios no site | |
| anti-LC3 Anticorps | Novus Biologicals | NB600-1384 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Thermo Fisher Scientific | X | |
| CellStripper | Corning | 25-056-CI | |
| CellTracker Rouge (CMTPX) Colorant | Thermo Fisher Scientific | C34552 | |
| Centrí ; fuga | Thermo Fisher Scientific | ||
| Ciprofloxacine | Isofarma | X | |
| Incubateur CO2 | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Microscope confocal à fluorescence (Leica SP8) | Leica | Leica SP8 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibco | 10270106 | |
| Microscope à fluorescence (Olympus Lx73) | Olympus | Olympus Lx73 | |
| Gentamicine | Gibco | 15750045 | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 35050-061 | |
| HEPES (N-2-hydroxyethyl piperazine-N'-2-éthane-sulfonique) | Gibco | X | |
| Histopaque | Sigma | 10771 | |
| M-CSF | Peprotech | 300-25 | |
| NH4Cl | Sigma | A9434 | |
| Sérum de chèvre normal | Sigma | NS02L | |
| Nucleofector 2b Dispositif | Lonza | AAB-1001 | |
| Solution de nucléofecteur | Lonza | VPA-1007 | |
| Paraformaldéhyde | Sigma | 158127 | |
| Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Acétate de myristate de Phorbol (PMA) | Sigma | P1585 | |
| Solution tampon de phosphate (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| ProLong Gold Antifade kit | Life Technologies | P36931 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 moyen | Gibco | 11875-093 | |
| Saponin | Thermo Fisher Scientific | X | |
| Schneider’s Insect medium | Sigma | S0146 | |
| Bicarbonate de sodium | Sigma | S5761 | |
| Pyruvate de sodium | Sigma | S8636 | |
| Triton X-100 | Sigma | X |
Références
- Goto, H., Lauletta Lindoso, J. A. Cutaneous and mucocutaneous leishmaniasis. Infectious Disease Clinics of North America. 26 (2), 293-307 (2012).
- World Health Organization. Control of the leishmaniases. World Health Organization Technical Report Series. (949), 1(201....
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