Utilisation de la culture d’organes de type Trowell pour étudier la régulation des cellules souches dentaires

Résumé

La méthode de culture d’organes de type Trowell a été utilisée pour démêler les réseaux de signalisation complexes qui régissent le développement des dents et, plus récemment, pour étudier la régulation impliquée dans les cellules souches de l’incisive de souris en croissance continue. Les modèles animaux fluorescents-rapporteurs et les méthodes d’imagerie en direct facilitent les analyses approfondies des cellules souches dentaires et de leur microenvironnement de niche spécifique.

Résumé

Le développement, la fonction et la régénération des organes dépendent des cellules souches, qui résident dans des espaces anatomiques discrets appelés niches de cellules souches. L’incisive de souris à croissance continue fournit un excellent modèle pour étudier les cellules souches spécifiques aux tissus. Les cellules souches spécifiques du tissu épithélial de l’incisive sont situées à l’extrémité proximale de la dent dans une niche appelée boucle cervicale. Ils fournissent un afflux continu de cellules pour contrebalancer l’abrasion constante de la pointe auto-affûtante de la dent. Un protocole détaillé pour l’isolement et la culture de l’extrémité proximale de l’incisive de souris qui abrite les cellules souches et leur niche est présenté ici. Il s’agit d’un protocole modifié de culture d’organes de type Trowell qui permet la culture in vitro de morceaux de tissus (explants), ainsi que les tranches de tissu épaisses à l’interface liquide/air sur un filtre soutenu par une grille métallique. Le protocole de culture d’organes décrit ici permet des manipulations tissulaires impossibles in vivo et, lorsqu’il est combiné à l’utilisation d’un ou de plusieurs rapporteurs fluorescents, il fournit une plate-forme pour l’identification et le suivi de populations cellulaires discrètes dans les tissus vivants au fil du temps, y compris les cellules souches. Diverses molécules régulatrices et composés pharmacologiques peuvent être testés dans ce système pour leur effet sur les cellules souches et leurs niches. Cela fournit en fin de compte un outil précieux pour étudier la régulation et le maintien des cellules souches.

Introduction

Les incisives de souris se développent continuellement en raison de la préservation à vie des cellules souches (SC) qui soutiennent la production incessante de composants dentaires. Il s’agit notamment des SC épithéliales, qui génèrent des améloblastes producteurs d’émail, et des cellules souches mésenchymateuses (CSM), qui génèrent des odontoblastes producteurs de dentine, entre autres cellules¹. Les SC épithéliaux dans les incisives en croissance continue ont été initialement identifiés comme des cellules retenant le marquage^2,3 et il a depuis été démontré qu’ils expriment un certain nombre de gènes souches bien connus....

Protocole

Ce protocole implique l’utilisation d’animaux et toutes les procédures ont été approuvées par les comités d’éthique sur l’utilisation et le soin des animaux et l’animalerie de l’Université d’Helsinki.

1. Préparation du plat de culture d’organes

1. Effectuer toutes les procédures dans une hotte à flux laminaire. Nettoyez les surfaces de travail avec 70 % d’éthanol et utilisez des instruments et des solutions en verre autoclavé. Stérilisez les ciseaux et autres équipements métalliques dans un stérilisateur à billes de verre.
2. Préparer les filtres normalement stockés dans de l’éthanol à 70 % en les lavant trois fois dans 1x PBS....

Résultats

Les SC épithéliaux résident dans une niche appelée anse cervicale, située à l’extrémité proximale de l’incisive (Figure 3A). Les anses cervicales sont des structures morphologiquement distinctes composées d’épithélium d’émail interne et externe qui enveloppent le réticulum étoilé, un noyau de cellules épithéliales disposées de manière lâche (Figure 3B,C). Il y a deux anses cervicales dans chaque incisive (Figure 3A).......

Discussion

La culture d’organes in vitro a été largement utilisée pour étudier le potentiel inductif et les interactions épithélio-mésenchymateuses qui régissent la croissance et la morphogenèse des organes. Le laboratoire de Thesleff a montré comment adapter la modification Saxén de la culture d’organes de type Trowell et l’utiliser pour étudier le développement des dents¹⁴. Les conditions reproductibles et les progrès dans les rapporteurs fluorescents en ont fait une méthode utile pour surveiller .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Seringues en plastique de
Aiguilles hypodermiques jetables de calibre 20/26	Terumo
DMEM	Gibco	61965-026
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Gibco	14287
Ciseaux de Bonn extra fins	F.S.T.	14084-08
F-12	Gibco	31765-027
FBS Amérique du Sud (CE)	LifeTechn.	10270106	diviser en aliquotes, stocker à -20° ; C
Stérilisateur à billes de verre, Steri 250 Seconds-Sterilizer	Simon Keller Ltd	4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide)	Gibco	35050-038
Isopore Polycarb.Filtres, 0,1 um 25 mm de diamètre	MerckMillipore	VCTP02500	Conserver dans 70 % d’éthanol à température ambiante.
Acide L-Ascobique	Sigma	A4544-25g	dilué 100 mg/ml en MilliQ, filtre strérilisé et divisé en 20&mu ; l aliquotes, stocker à l’obscurité, -20° ; C
Agarose à faible point de fusion	TopVision	R0801
Grilles			Disponible dans le commerce, ou fabriquée par vous-même à partir d’un treillis en acier inoxydable (résistant à la corrosion, taille de la maille 0,7 mm). Coupez un disque d’environ 30 mm de diamètre et pliez les bords pour donner une hauteur de 3 mm. Utilisez des clous pour faire des trous.
Micro pince	Medicon	07.60.03
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich
Pénicilline-Streptomycine (10 000U/ml) sol.	Gibco	15140-148
Boîtes de Pétri, verre sodocalcique	DWK Life Sciences	9170442
Pétride 35 mm, avec évent	Duran	237554008
Pétride 90 mm, sans évent classique	Thermo Fisher	101RT/C
Petits ciseaux

1 mL métalliques