Une sonde de force biombrane (BFP) est une technique de spectroscopie de force dynamique (DFS) in situ. BFP peut être utilisé pour mesurer la constante de ressort des interactions moléculaires sur les cellules vivantes. Ce protocole présente une analyse de la constante de ressort pour les liaisons moléculaires détectées par BFP.
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Article de méthode
Analyse de la constante de ressort moléculaire par spectroscopie de sonde de force de biomembrane
Dans cet article
Résumé
Résumé
Une sonde de force biomébrarane (BFP) a récemment émergé en tant que nanooutil de spectroscopie de force dynamique (DFS) à surface cellulaire native ou in situ qui peut mesurer la cinétique de liaison moléculaire unique, évaluer les propriétés mécaniques des interactions ligand-récepteur, visualiser les changements conformationnels dynamiques des protéines et élucider de manière plus excitante les mécanismes de mécanosension cellulaire médiés par les récepteurs. Plus récemment, le BFP a été utilisé pour mesurer la constante de ressort des liaisons moléculaires. Ce protocole décrit la procédure étape par étape pour effectuer une analyse DFS de la constante de ressort moléculaire. Plus précisément, deux modes de fonctionnement BFP sont discutés, à savoir les modes Bead-Cell et Bead-Bead. Ce protocole se concentre sur la dérivation des constantes de ressort de la liaison moléculaire et de la cellule à partir de données brutes DFS.
Introduction
En tant que technique DFS à cellules vivantes, BFP conçoit un globule rouge humain (RBC; Figure 1) dans un transducteur de force ultrasensible et accordable avec une plage constante de ressort compatible à 0,1-3 pN/nm1,2,3. Pour sonder l’interaction ligand-récepteur, BFP permet des mesures DFS à ~1 pN(10 -12 N), ~3 nm(10 -9 m) et ~0,5 ms (10-3 s) en force, résolution spatiale et temporelle4,5. Sa configuration expérimentale se compose de deux micropipettes....
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Protocole
1. Obtenir des événements DFS analysables
- Démarrez l’expérience dans le logiciel (par exemple, LabVIEW VI) pour le contrôle BFP et le réglage des paramètres (Figure S1A).
- Observez les touches répétitives perles cibles de perles/cellules de la sonde dans le logiciel pour BFP Monitor (Figure S1B).
- Testez et atteignez la fréquence d’adhérence ≤ 20% dans les 50 premières touches en réglant la force d’impingement et le temps de contact, ce qui garantit que ≥ 89% de l’événement d’adhérence DFS sont médiées par des liaisons simples12,13,
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Résultats
Dans ce travail, nous avons démontré le protocole de l’analyse constante du ressort BFP. Pour le mode d’analyse Bead-Cell, nous avons analysé le kmol de la liaison moléculaire entre la protéine glycosylé Thy-1 enrobée sur la perle de la sonde et l’intégrine α5β1 exprimée sur la cellule Cible K562 (Thy-1-intégrine α5β1; Figure 3A) 10. Lacellule kest également dérivée du mode Bead-Cell .......
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Discussion
En résumé, nous avons fourni un protocole d’analyse de données détaillé pour le prétraitement des données brutes DFS et la dérivation des constantes de ressort moléculaire dans les modes d’analyse BFP Bead-Bead et Bead-Cell. Des modèles biomécaniques et des équations nécessaires à la détermination des constantes de ressort moléculaires et cellulaires sont présentés. Bien que différentes intégrines soient étudiées, le kmol mesuré par le mode Perle-Perle et le mode Perle-Cellule possède des différences .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents à signaler concernant la présente étude.
Remerciements
Nous remercions Guillaume Troadec pour la discussion utile, Zihao Wang pour la consultation sur le matériel, et Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning et Simon Ringer pour le soutien de notre démarrage de laboratoire. Ce travail a été soutenu par l’Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), le NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), le Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), la National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) et le Fonds de démarrage et le programme d’équipement maj....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) | Uct, Specialties, llc | 4420-74-0 | Fonctionnalisation des billes de verre |
| Anhy. Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4) | Sigma-Aldrich | S7907 | Préparation du tampon |
| phosphate Acquisition de données BFP VI | LabVIEW | Contrôle BFP et réglage des paramètres | |
| Analyse des données BFP VI | LabVIEW | BFP Analyse des données | |
| brutes Biotin-PEG3500-NHS | JenKem | A5026-1 | Biotinylation |
| RBCBorosilicate Perles de verre | Distrilab Particle Technology, Pays-Bas | 9002 | Fonctionnalisation des billes de verre |
| Albumine sérique bovine | Sigma-Aldrich | A0336 | Fonctionnalisation du ligand |
| Caméra VI | LabVIEW | BFP monitoring | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | Tyrode' s préparation du tampon |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H3375 | Tyrode' s préparation tampon |
| MAL-PEG3500-NHS | JenKem | A5002-1 | Fonctionnalisation des billes de verre |
| Chlorure de potassium (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tyrode' s préparation |
| Bicarbonate de sodium (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Préparation tampon carbonate/bicarbonate ; Tyrode' s |
| préparation tampon Carbonate de sodium (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Préparation tampon carbonate/bicarbonate |
| Chlorure de sodium (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tyrode' s préparation tampon |
| Phosphate de sodium monobasique monohydraté (NaH2PO4&bull ; H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Préparation de tampons phosphates |
| Streptavidine-Maléimide | Sigma-Aldrich | S9415 | Fonctionnalisation des billes de verre |
Références
- Chen, Y., et al. Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell. The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).
- Su, Q. P., Ju, L. A.
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Réimpressions et autorisations
