Article de méthode

Analyse de la constante de ressort moléculaire par spectroscopie de sonde de force de biomembrane

DOI :

10.3791/62490

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20 novembre 2021

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1School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney, 2Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 3Heart Research Institute, 4Department of Chemistry, The Hong Kong University of Science and Technology, 5School of Aerospace, Mechanical and Mechatronic Engineering, Faculty of Engineering, The University of Sydney

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une sonde de force biombrane (BFP) est une technique de spectroscopie de force dynamique (DFS) in situ. BFP peut être utilisé pour mesurer la constante de ressort des interactions moléculaires sur les cellules vivantes. Ce protocole présente une analyse de la constante de ressort pour les liaisons moléculaires détectées par BFP.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Une sonde de force biomébrarane (BFP) a récemment émergé en tant que nanooutil de spectroscopie de force dynamique (DFS) à surface cellulaire native ou in situ qui peut mesurer la cinétique de liaison moléculaire unique, évaluer les propriétés mécaniques des interactions ligand-récepteur, visualiser les changements conformationnels dynamiques des protéines et élucider de manière plus excitante les mécanismes de mécanosension cellulaire médiés par les récepteurs. Plus récemment, le BFP a été utilisé pour mesurer la constante de ressort des liaisons moléculaires. Ce protocole décrit la procédure étape par étape pour effectuer une analyse DFS de la constante de ressort moléculaire. Plus précisément, deux modes de fonctionnement BFP sont discutés, à savoir les modes Bead-Cell et Bead-Bead. Ce protocole se concentre sur la dérivation des constantes de ressort de la liaison moléculaire et de la cellule à partir de données brutes DFS.

Introduction

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En tant que technique DFS à cellules vivantes, BFP conçoit un globule rouge humain (RBC; Figure 1) dans un transducteur de force ultrasensible et accordable avec une plage constante de ressort compatible à 0,1-3 pN/nm1,2,3. Pour sonder l’interaction ligand-récepteur, BFP permet des mesures DFS à ~1 pN(10 -12 N), ~3 nm(10 -9 m) et ~0,5 ms (10-3 s) en force, résolution spatiale et temporelle4,5. Sa configuration expérimentale se compose de deux micropipettes opposées, à savoir la sonde et la cible. La micropipette Probe aspire un globules biologiques et une perle est collée à son sommet via une interaction biotine-streptavidine. La perle est recouverte du ligand d’intérêt (Figure 1A). La micropipette cible aspire soit une cellule, soit une perle portant le récepteur d’intérêt, correspondant aux modes Bead-Cell(Figure 1B)et Bead-Bead(Figure 1C),respectivement5.

La construction BFP, l’assemblage et les protocoles expérimentaux DFS ont été décrits en détail précédemment1,6. En bref, un cycle tactile BFP se compose de 5 étapes : Approcher, Impinge, Contact, Retract et Dissocier(Figure 1D). La position horizontale de l’apex RBC est notée ΔxRBC. Au début, la déformation RBC non étayée (force nulle) ΔxRBC est 0(tableau 1). La cible est ensuite entraînée par un piézotranslateur pour empiéter et se rétracter sur le cordon de la sonde(Figure 1D). La sonde RBC est d’abord comprimée par la cible avec une déformation RBC négative ΔxRBC < 0. Dans un cas de liaison, l’étage de rétraction passe d’une phase de compression à une phase de traction avec une déformation RBC positive ΔxRBC > 0(Figure 2C et D). Selon la loi de Hooke, la force de roulement BFP peut être mesurée comme F = kRBC × ΔxRBC, où kRBC ( Tableau1) est la constante de ressort RBC du BFP. À la rupture de la liaison et à la fin d’un cycle tactile, le bille de sonde revient à la position de force nulle avec ΔxRBC = 0(Figure 1D).

Pour déterminer le kRBC,nous mesurons et enregistrons les rayons de l’orifice interne de la micropipette de sonde (Rp), du RBC (R0) et de la zone de contact circulaire (Rc) entre le RBC et le bille de sonde ( Figure1A). Ensuite, kRBC est calculé selon le modèle d’Evan (Eq. 1)7,8 à l’aide d’un programme LabVIEW qui agit comme un instrument virtuel (VI) pour faire fonctionner le BFP(Figure S1A)8,9.

Équation d’équilibre statique pour kRBC en dynamique des fluides, montrant les variables et les termes logarithmiques. (Eq. 1)

Avec un BFP établi et des données brutes DFS obtenues, nous présentons ici comment analyser la constante de ressort de la paire ligand-récepteur ou des cellules. Les données brutes DFS sur l’interaction de la protéine glycosylée Thy-1 et de la cellule K562 portant l’intégrine α5β1 (Thy-1-α5β1; Figures 3A et 3B)10 et celle de l’intégrine enduite de fibrinogène et de billes αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; Figure 3C) 11,12 ont été utilisés pour démontrer les modes d’analyse Bead-Cell et Bead-Bead, respectivement.

Préparation expérimentale BFP
Pour plus de détails sur la préparation expérimentale et l’instrumentation du BFP, veuillez vous référer aux protocoles précédemment publiés3. En bref, les globules biologiques humains ont été biotinylés à l’aide du Biotin-PEG3500-NHS dans le tampon carbone/bicarbonate. Les protéines d’intérêt ont été couplées de manière covalente aux billes de verre borosilicate en utilisant MAL-PEG3500-NHS dans le tampon de phosphate. Pour se fixer au globule rouge biotinylé, la bille de sonde est également recouverte de streptavidine (SA) à l’aide du MAL-SA. Veuillez consulter le tableau des matériaux et le tableau 2.

Pour assembler le BFP(Figure 1, à gauche),la troisième micropipette appelée « Helper » sera utilisée pour délivrer la bille de sonde et la coller à l’apex du RBC1,3. L’interaction covalente entre la bille de sonde revêtue de SA et les globules rouges biotinylés est beaucoup plus forte que la liaison ligand-récepteur d’intérêt. Ainsi, l’étape dissociée peut être interprétée comme la rupture de la liaison ligand-récepteur plutôt que le détachement de la perle de sonde du globule rouge.

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Protocole

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1. Obtenir des événements DFS analysables

  1. Démarrez l’expérience dans le logiciel (par exemple, LabVIEW VI) pour le contrôle BFP et le réglage des paramètres (Figure S1A).
  2. Observez les touches répétitives perles cibles de perles/cellules de la sonde dans le logiciel pour BFP Monitor (Figure S1B).
  3. Testez et atteignez la fréquence d’adhérence ≤ 20% dans les 50 premières touches en réglant la force d’impingement et le temps de contact, ce qui garantit que ≥ 89% de l’événement d’adhérence DFS sont médiées par des liaisons simples12,13,14.
    REMARQUE: Pour chaque paire Bead-Cell/Bead, nous effectuons 200 cycles tactiles répétitifs. Pour obtenir une qualité de données publiable, nous effectuons généralement n ≥ 3 paires Perle-Perle ou Perle-Cellule.
    1. Enregistrez les données, sous la forme de Force vs. Time, dans le dossier dirigé par l’utilisateur à la fin de chaque paire, invité par le logiciel pour le contrôle BFP et le réglage des paramètres.
  4. Collectez les données brutes Force vs Temps des événements Bond, comme illustré dans la Figure 2A, à l’aide de la plate-forme d’acquisition BFP (Figure S1C).
    1. Ouvrez le logiciel d’analyse de données BFP. Cliquez sur l’icône du dossier jaune et sélectionnez le fichier de données brutes correspondant en double-cliquant dessus.
  5. Exécutez le programme, puis cliquez sur les boutons haut et bas pour basculer entre les événements. Utilisez les critères d’exclusion des valeurs aberrantes (Figure S2) pour éliminer les événements non valides. Sélectionnez le type de données d’exportation au format Force vs. Heure et cliquez sur le bouton Exporter les données des tracés.

2. Convertissez la courbe Force vs Temps en Courbe Force vs Déplacement

  1. Exportez le segment de données correspondant à l’étape De retrait vers une feuille de calcul(Figure 2A, cadre de sélection carré),ce qui est pertinent pour l’analyse de la constante de ressort.
  2. Tracez la courbe Force vs Temps à l’aide d’un tableur. Pour obtenir la courbe Force vs Déplacement, convertissez les valeurs de temps(Figure 2A,axe des x)en valeurs de déplacement total (Δxtot)en multipliant les valeurs de temps par la vitesse de mouvement piézoélectrique (c’est-à-dire 4 000 nm/s par préréglage).
  3. Élilinez le premier point de données à zéro en soustrayant la plus petite valeur de déplacement de chaque valeur de déplacement acquise. Cette transformation horizontale n’affecte pas les pentes ascendantes de l’étage De rétraction ni le calcul ultérieur de la constante de ressort.
  4. Notamment, le BFP est considéré comme un système de ressorts en série dans lequel Δxtot (Tableau 1) additionne les déformations du RBC, ΔxRBC (Tableau 1), la liaison moléculaire, Δxmol (Tableau 1), et la cellule Cible, Δxcellule (Tableau 1), comme l’Eq. 2:
    Équation d’équilibre statique Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell, formule mathématique. (Eq. 2)
  5. Tracez la courbe Force (F) vs Déplacement (Δxtot)comme illustré à la figure 2B.

3. Analyse de ressort Cnstant du mode perle-cellule

  1. Dans la courbe Force vs Déplacement, deux pentes distinctes peuvent être identifiées, où chacune peut représenter la phase de compression et la phase de traction. Ajuster une ligne de régression à chaque groupe de données (Figure 2B), où la plus grande pente d’ajustement linéaire représente la constante totale du ressort en phase de compression (Figure 2B, rouge), notée k1 (Tableau 1); et la plus petite pente d’ajustement linéaire représente la constante totale du ressort à la phase de traction (Figure 2B, bleu), notée k2 (Tableau 1).
  2. Pour les ressorts connectés en série par description de l’étape 2.2, exprimer la réciproque de la constante totale du ressort, ktot (Tableau 1), comme la somme des inverses de la constante du ressort de RBC, kRBC (Tableau 1), la liaison moléculaire, kmol (Tableau 1), et la cellule cible, kcellule (Tableau 1). Pendant la phase de compression du mode Bead-Cell, la liaison moléculaire n’est pas étirée, donc kmol n’est pas pris en considération. La réciproque du ktot dans ce scénario (1/k1) est exprimée comme
    Équation représentant la cinétique cellulaire en biologie ; Schéma des constantes cinétiques : k1, kRBC, kcell. (Eq. 3).
    Dans les exemples de données, kRBC est prédéterminé (0,25 pN/nm par défaut). Lacellule k peut être dérivée de l’Eq. 3 avec les k1 et kRBC acquis(Figure 3B).
  3. Pendant la phase de traction, l’adhésion se forme entre la paire ligand-récepteur. Exprimer la réciproque du ktot dans ce scénario (1/k2) comme
    Équation de résistance en série, montrant 1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcellule, utilisée dans l’étude cinétique. (Eq. 4)
    où k2 (Tableau 1) représente la constante totale du ressort pendant la phase de traction.
  4. Dériver kmol en soustrayant 1/k1 de 1/k2 (comparer Eq. 3 vs Eq. 4).

4. Analyse constante du ressort du mode perle-perle

  1. Ajuster une ligne de régression aux données de phase de compression pour obtenir k1 (similaire à la figure 2B, rouge). Il est à noter qu’en mode Perle-Perle, la cellule cible est remplacée par une perle de verre recouverte du récepteur d’intérêt(Figure 1C). Étant donné que la déformation des billes est négligeable, le termede cellule 1 /kpeut être retiré de l’Eq. 3 et de l’Eq. 4 en conséquence. Le ktot réciproque de la phase de compression (1/k1)peut être exprimé comme :
    Équation montrant la relation : 1/k1 = 1/kRBC ; Clé pour les constantes de vitesse cinétique dans l’analyse biochimique. (Eq. 5)
  2. Ajuster une ligne de régression aux données de phase de traction pour obtenir k2 (similaire à la figure 2B, bleu). Le ktot réciproque de la phase de traction (1/k2) peut être exprimé comme :
    Équation de vitesse de réaction, diagramme des constantes de vitesse inverses ; Termes k2, kRBC, kmol pour l’analyse cinétique. (Eq. 6)
  3. Dériver kmol en soustrayant 1/k1 de 1/k2 (comparer Eq. 5 vs Eq. 6).

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Résultats

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Dans ce travail, nous avons démontré le protocole de l’analyse constante du ressort BFP. Pour le mode d’analyse Bead-Cell, nous avons analysé le kmol de la liaison moléculaire entre la protéine glycosylé Thy-1 enrobée sur la perle de la sonde et l’intégrine α5β1 exprimée sur la cellule Cible K562 (Thy-1-intégrine α5β1; Figure 3A) 10. Lacellule kest également dérivée du mode Bead-Cell ...

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Discussion

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En résumé, nous avons fourni un protocole d’analyse de données détaillé pour le prétraitement des données brutes DFS et la dérivation des constantes de ressort moléculaire dans les modes d’analyse BFP Bead-Bead et Bead-Cell. Des modèles biomécaniques et des équations nécessaires à la détermination des constantes de ressort moléculaires et cellulaires sont présentés. Bien que différentes intégrines soient étudiées, le kmol mesuré par le mode Perle-Perle et le mode Perle-Cellule possède des différences ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents à signaler concernant la présente étude.

Remerciements

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Nous remercions Guillaume Troadec pour la discussion utile, Zihao Wang pour la consultation sur le matériel, et Sydney Manufacturing Hub, Gregg Suaning et Simon Ringer pour le soutien de notre démarrage de laboratoire. Ce travail a été soutenu par l’Australian Research Council Discovery Project (DP200101970 - L.A.J.), le NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Early-Mid Career Researcher Grant - L.A.J.), le Sydney Research Accelerator prize (SOAR - L.A.J.), ramaciotti Foundations Health Investment Grant (2020HIG76 - L.A.J.), la National Health and Medical Research Council Ideas Grant (APP2003904 - L.A.J.) et le Fonds de démarrage et le programme d’équipement majeur de la Faculté d’ingénierie de l’Université de Sydney (L.A.J.). Lining Arnold Ju est un boursier DECRA de l’Australian Research Council (DE190100609).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS)Uct, Specialties, llc4420-74-0Fonctionnalisation des billes de verre
Anhy. Phosphate de sodium dibasique (Na2HPO4)Sigma-AldrichS7907Préparation du tampon
phosphate Acquisition de données BFP VILabVIEWContrôle BFP et réglage des paramètres
Analyse des données BFP VILabVIEWBFP Analyse des données
brutes Biotin-PEG3500-NHSJenKemA5026-1Biotinylation
RBCBorosilicate Perles de verreDistrilab Particle Technology, Pays-Bas9002Fonctionnalisation des billes de verre
Albumine sérique bovineSigma-AldrichA0336Fonctionnalisation du ligand
Caméra VILabVIEWBFP monitoring
D-glucoseSigma-AldrichG7021Tyrode' s préparation du tampon
HepesSigma-AldrichH3375Tyrode' s préparation tampon
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1Fonctionnalisation des billes de verre
Chlorure de potassium (KCl)Sigma-AldrichP9541Tyrode' s préparation
Bicarbonate de sodium (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Préparation tampon carbonate/bicarbonate ; Tyrode' s
préparation tampon Carbonate de sodium (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Préparation tampon carbonate/bicarbonate
Chlorure de sodium (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tyrode' s préparation tampon
Phosphate de sodium monobasique monohydraté (NaH2PO4&bull ; H2O)Sigma-AldrichS9638Préparation de tampons phosphates
Streptavidine-MaléimideSigma-AldrichS9415Fonctionnalisation des billes de verre
tampon

Références

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  2. Su, Q. P., Ju, L. A. Biophysical nanotools for single-molecule dynamics. Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).
  3. Ju, L. Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds. Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).
  4. An, C., et al. Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells. Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).
  5. Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. Receptor-mediated cell mechanosensing. Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).
  6. Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes. Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).
  7. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces. Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).
  8. Ju, L., Zhu, C. Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models. Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).
  9. Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces. Biophysical Journal. 68, 2580(1995).
  10. Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex. Nature Communications. 5, 4886(2014).
  11. Passam, F., et al. Mechano-redox control of integrin de-adhesion. Elife. 7, (2018).
  12. Chen, Y., et al. An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation. Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).
  13. Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. Force regulated conformational change of integrin αVβ3. Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).
  14. Liu, B., Chen, W., Zhu, C. Molecular force spectroscopy on cells. Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).
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  16. Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα. Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).
  17. Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals. Elife. 5, 15447(2016).

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Mots-clés

Biomembrane Force ProbeMolecular Spring ConstantDynamic Force SpectroscopySingle Molecule BindingLigand Receptor InteractionCell MechanosensingBead Cell ModeBead Bead ModeForce Versus DisplacementHooke s Law

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