Contrôle de la géométrie cellulaire par micropatterning assisté par laser infrarouge

Résumé

Le protocole présenté ici permet la fabrication automatisée de micropatterns qui normalisent la forme des cellules pour étudier les structures cytosquelettiques dans les cellules de mammifères. Cette technique conviviale peut être mise en place avec des systèmes d’imagerie disponibles dans le commerce et ne nécessite pas d’équipement spécialisé inaccessible aux laboratoires de biologie cellulaire standard.

Résumé

Le micropatterning est une technique établie dans la communauté de la biologie cellulaire utilisée pour étudier les liens entre la morphologie et la fonction des compartiments cellulaires tout en contournant les complications découlant des variations naturelles de cellule à cellule. Pour normaliser la forme des cellules, les cellules sont soit confinées dans des moules 3D, soit contrôlées pour la géométrie adhésive à travers des îlots adhésifs. Cependant, les techniques traditionnelles de micropatternage basées sur la photolithographie et la gravure uv profonde dépendent fortement des salles blanches ou de l’équipement spécialisé. Nous présentons ici une technique de micropatterning assistée par laser infrarouge (microphotopatterning) modifiée à partir de Doyle et al. qui peut être facilement configurée avec des systèmes d’imagerie disponibles dans le commerce. Dans ce protocole, nous utilisons un système d’imagerie Nikon A1R MP+ pour générer des micropatterns avec une précision de micron grâce à un laser infrarouge (IR) qui abrexage les régions prédéfinies sur des lamules recouvertes d’alcool poly vinylique. Nous utilisons un script personnalisé pour permettre la fabrication automatisée de motifs avec une efficacité et une précision élevées dans les systèmes non équipés d’une mise au point automatique matérielle. Nous montrons que ce protocole de micropatterning assisté par laser IR (microphotopatterning) se traduit par des motifs définis auxquels les cellules se fixent exclusivement et prennent la forme souhaitée. En outre, les données d’un grand nombre de cellules peuvent être moyennales en raison de la normalisation de la forme des cellules. Les modèles générés avec ce protocole, combinés à l’imagerie haute résolution et à l’analyse quantitative, peuvent être utilisés pour des écrans à débit relativement élevé afin d’identifier les lecteurs moléculaires médiant le lien entre la forme et la fonction.

Introduction

La forme cellulaire est un déterminant clé des processus biologiques fondamentaux tels que la morphogenèse tissulaire^1,la migration cellulaire^2,la prolifération cellulaire³et l’expression^{génique 4.} Les changements de forme cellulaire sont entraînés par un équilibre complexe entre les réarrangements dynamiques du cytosquelette qui déforme la membrane plasmique et les facteurs extrinsèques tels que les forces externes exercées sur la cellule et la géométrie des adhérences cellule-cellule et cellule-matrice^5. Les cellules mésenchymateuses migratrices, p....

Protocole

1. Prétraitement de coverslip

1. Préparer des lamelle de couverture propre et grinçante comme décrit dans Waterman-Storer, 1998²⁵.
2. Préparer la solution à 1% de (3-aminopropyl)triméthoxysilane (APTMS) et incuber les lamaux dans la solution pendant 10 min avec une agitation douce. Assurez-vous que les lamelle se déplacent librement dans la solution.
3. Laver les lamelle deux fois avec dH₂O pendant 5 min chacune.
4. Préparer une solution de glutaraldéhyde (GA) à 0,5 % et incuber les lamaux de couverture dans la solution pendant 30 min sur un agitateur. Pour 25 lamaux de couverture, utilisez 50 mL de soluti....

Résultats

La qualité des données expérimentales obtenues par micropatterning dépend en grande partie de la qualité des modèles. Pour déterminer la qualité des motifs générés avec la méthode ci-dessus, nous avons d’abord utilisé la microscopie à réflectance pour évaluer la forme et la taille des zones photo-ablées de la lame de couverture. Nous avons constaté que chaque motif individuel ressemblait beaucoup au masque d’ablation et présentait des pensionnaires clairs et une surface qui réfléchissait uniformément à la lumière

Discussion

Les résultats ci-dessus démontrent que le protocole de micropatterning (microphotopatterning) assisté par laser IR décrit fournit des modèles adhérents reproductibles de diverses formes qui permettent la manipulation de la forme cellulaire et de l’architecture cytosquelettique. Bien que de nombreuses méthodes de micropatterning aient été développées avant et après les débuts du microphotopatterning, cette méthode présente plusieurs avantages. Tout d’abord, il ne nécessite pas d’équipement spécialisé et de salles blanches.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
(3-Aminopropyl)triméthoxysilane	Aldrich	281778
10 cm Antenne de culture cellulaire	VWR	10062-880	Polystyrène, traité TC, ventilé
25X Apo LWD Objectif de trempage dans l’eau	Nikon	MRD77225
3,5 cm Antenne de culture cellulaire	VWR	10861-586	Polystyrène, traité TC, ventilé
4',6-Diamidino-2-Phénylindole (DAPI)	Thermo	62248	1mg/mL solution de dichlorhydrate
Sérine bovine BioShop		ALB005
Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline	Wisent	311-425-CL
Éthanolamine	Sigma-Aldrich	E9508
Fibronectine	Sigma-Aldrich	FC010	1mg/mL dans un tampon pH 7,5
Anticorps anti-fibronectine	BD	610077	Souris
Fiji	ImageJ		Version 1.53c
Phalloïdine	fluorescente Invitrogen	A12380	568nm
Lentille de protection en verre	VWR	16004-302	22 × ; 22 mm
Glutaraldéhyde	Microscopie électronique Sciences	16220	Solution aqueuse à 25 %
Acide chlorhydrique	Caledon	6025-1-29	Solution aqueuse à 37 %
IR Laser	Cohérent	Caméléon Vision
Minimal Essentiel Moyen &alpha ;	Gibco	12561-056
Support de montage	Sigma	F4680
Souris Anticorps secondaires	de signalisation cellulaire	4408S	chèvre, 488nm
Microscope multiphotonique	Nikon	A1R MP+
Myosin Chaîne légère	de signalisation cellulaire d’anticorps	3672S	lapin
NIS Elements	Nikon		Édition 5.21.03
Acide nitrique	Caledon	7525-1-29	Solution aqueuse à 70 %
Photoshop	Adobe		Version 21.2.1
Pluronic F-127	Sigma	P2443	Poudre
Poly(alcool vinylique)	Aldrich	341584	MW 89000-98000, 98 % hydrolysé
Lapin Anticorps secondaires	de signalisation cellulaire	4412S	Chèvre, 488nm
Shaker	VWR	10127-876	Aussi connu sous le nom de rocker analogique
Borohydrure de sodium	Aldrich	452882	Poudre
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	S8045
Phosphate de sodium Dibasic	Sigma	S5136	Poudre
Phosphate de sodium Monobasic	Sigma	S5011	Poudre
Spyder	Anaconda	4.1.4
Trypsine	Wisent	325-042-CL	solution aqueuse à 0,05 % avec 0,53 mM d’EDTA