Filtres de leucodeplétion Des cellules CD34+ dérivées comme source cellulaire pour étudier la différenciation des mégacaryocytes et la formation de plaquettes

Les plaquettes sanguines proviennent de grandes cellules polyploïdes spécialisées, les mégacaryocytes (MK), qui proviennent d’un processus de production constant et affiné connu sous le nom de mégacarylopoïèse (MKP). Au sommet de ce processus se trouvent les cellules souches hématopoïétiques qui, au contact de l’environnement de la moelle osseuse (cytokines, facteurs de transcription, niche hématopoïétique), seront capables de proliférer et de se différencier en progéniteurs hématopoïétiques (HP) capables de s’engager vers la voie mégacaryocytaire, donnant naissance à des MK immatures¹. Sous l’influence de diverses cytokines, et en particulier de la thrombopoïétine (TPO), qui est la cytokine majeure de MKP; le MK subira alors deux grandes étapes de maturation : l’endomitose et le développement de membranes de démarcation (DMS). Ce MK complètement mature apparaît alors à proximité d’un vaisseau sinusoïdal dans lequel il peut émettre des extensions cytoplasmiques, les proplaquettaires, qui seront libérées sous le flux sanguin puis remodelées en plaquettes fonctionnelles^2. Le clonage du TPO en 1994³ a donné un coup de pouce à l’étude du MKP en accélérant le développement de techniques de culture in vitro permettant la différenciation HP et la maturation du MK.

Il existe de nombreuses pathologies affectant les plaquettes sanguines, à la fois en termes de nombre de plaquettes (augmentation ou diminution) et de fonction^4,5. Être capable de récapituler la MKP in vitro à partir de HP humaine pourrait améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents à ce processus et, en fin de compte, la prise en charge thérapeutique des patients.

Diverses sources de HP humaine conviennent: sang de cordon, moelle osseuse et sang périphérique^6,7,8. La récolte de HP dans le sang périphérique soulève moins de problèmes logistiques et éthiques que leur récupération du sang de cordon ombilical ou de la moelle osseuse. HP peut être récupéré de la leucaphérèse ou du pelage bouffant, mais ces sources sont coûteuses et pas toujours disponibles dans les centres de transfusion sanguine. D’autres protocoles, moins coûteux et plus faciles à réaliser, permettent la récupération directe des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) sans qu’il soit nécessaire de s’isoler préalablement par CD34^4,8. Cependant, la pureté des mégacaryocytes n’est pas satisfaisante avec cette méthode et une sélection de cellules CD34+ de PBMC est recommandée pour une différenciation optimale en MK. Cela nous a amenés à mettre en œuvre une purification HP à partir de filtres de leucoréduction (LRF), couramment utilisés dans les banques de sang pour éliminer les globules blancs et ainsi éviter les réactions immunologiques indésirables⁹. En effet, depuis 1998, les concentrés de plaquettes sont automatiquement leucodés en France. À la fin de ce processus, les LRF sont jetés et toutes les cellules retenues dans le LRF sont détruites. Les cellules des LRF sont donc facilement disponibles sans frais supplémentaires. Les LRF ont un contenu cellulaire proche de celui obtenu par leucaphérèse ou dans des couches bouffantes, notamment dans leur composition en CD34+ HP ce qui en fait une source remarquablement attrayante^10. Il a déjà été démontré que le LRF en tant que source HP humaine fournit aux cellules des capacités fonctionnelles intactes¹¹. Cette source a l’avantage d’être abondante et abordable pour la recherche en laboratoire. Dans ce contexte, cet article décrit successivement : i) l’extraction et la sélection de CD34⁺ HP à partir de LRF ; ii) une culture optimisée en deux phases, qui récapitule l’engagement de HP dans la voie mégacaryocytaire et la maturation de MK capable d’émettre des proplaquettaires; iii) une méthode pour libérer efficacement les plaquettes de ces MK; et iv) une procédure de phénotypage de MK et de plaquettes cultivées.

Des échantillons humains témoins ont été obtenus auprès de donneurs de sang volontaires qui ont donné leur consentement éclairé écrit recruté par le centre de transfusion sanguine où la recherche a été effectuée (Etablissement Français du Sang-Grand Est). Toutes les procédures ont été enregistrées et approuvées par le ministère Français de l’Enseignement supérieur et de la Recherche et enregistrées sous le numéro AC_2015_2371.Les donneurs ont donné leur approbation dans le formulaire de consentement CODHECO numéro AC- 2008 - 562, afin que les échantillons soient utilisés à des fins de recherche. Des études humaines ont été réalisées conformément à la déclaration d’Helsinki.

1. Extraction et sélection des cellules CD34+ (HP) de LRF

1. Préparation du réactif (pour un LRF)
   1. Préparer 25 mL de tampon d’élution filtré : 21,25 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 2,5 mL d’acide-citrate-dextrose (ACD) et 1,25 mL de sérum fœtal bovin (FBS) décomplémenté. Filtrer à 0,22 μm et placer à 37 °C.
   2. Préparer 500 mL de PBS avec 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
   3. Disposer de 25 mL de milieu de gradient de densité (DGM) (1,077 g/mL) dans deux tubes de 50 mL.
2. Modalités de rinçage à contre-courant LRF (Figure 1)
   REMARQUE: Cette étape nécessite une machine de soudage de tubes stériles, permettant la connexion stérile de tubes thermoplastiques.
   1. Tout d’abord, connectez le LRF à un sac de transfert vide de 600 mL et le LRF à un jeu de tubes (Figure 1A). Sous l’armoire de biosécurité, injecter le volume total de tampon d’élution filtré et préparé correspondant au nombre de LRF manipulés (xLRF x 25 mL) dans le sac vide. Ensuite, à l’aide d’une seringue de 30 mL pour aspirer doucement tout le contenu du sac à travers le LRF, rinçez à nouveau et transférez les cellules dans un nouveau tube de 50 mL(Figure 1B).
   2. Pour la sédimentation des globules rouges, diluer la suspension cellulaire de moitié avec Duxtran 2% et bien mélanger pour agréger les globules rouges. Attendez 30 min à température ambiante (RT).

Figure 1: Modalités de rinçage arrière du LRF. (A) Schéma représentatif de (i) la connexion stérile du sac de transfert au LRF et (ii) le jeu de tubes au LRF. (B) Schéma représentatif de la connexion des seringues pour la collecte des cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Collection PBMC
   1. Après la sédimentation des globules rouges, retirez et transférez le surnageant dans un tube de 50 mL et remplissez-le de PBS-EDTA 2 mM. Superposez doucement le surnageant sur le DGM préparé ci-dessus. Laissez le surnageant s’écouler doucement sans casser le plan de surface du gradient de densité. Centrifuger à 400 x g à RT pendant 30 min en mode arrêt des freins.
   2. Collectez la couche PBMC à l’éventrante à l’éventreuse. Transférez les cellules de chaque tube DGM dans un nouveau tube stérile de 50 mL. Remplissez chaque tube avec PBS-EDTA 2 mM et lavez deux fois en 50 mL de PBS-EDTA 2 mM à 200 x g pendant 10 min à RT en mode freinage.
   3. Pipette et mise en commun de la pastille de cellule avec 50 mL PBS-EDTA 2 mM.
      REMARQUE: Il est possible d’arrêter la procédure en maintenant les cellules collectées sous agitation à 4 ° C pendant la nuit. Ensuite, filtrez la suspension avec une passoire cellulaire de 40 μm pour éliminer les agrégats formés.
4. Sélection des cellules CD34+
   1. Déterminez le nombre de cellules et centrifugez à 400 x g à température ambiante pendant 10 minutes avec la pause activée.
   2. Aspirer complètement le surnageant et le remise en caisse dans le volume approprié de PBS-EDTA 2 mM détaillé par le fabricant du kit de sélection CD34 (300 μL de PBS-EDTA pour 10⁸ cellules). Ajouter le réactif bloquant fcR et les microbilles CD34 à la concentration appropriée (50 μL pour 10⁸ cellules).
   3. Après 30 min à 4 °C, laver la suspension de la cellule et la remise en suspension dans le volume approprié de PBS-EDTA 2 mM détaillé par le fabricant du kit de sélection CD34 (500 μL pour 10⁸ cellules).
      REMARQUE: La sélection est faite sur les colonnes de tri pour le passage de maximum 2 x 10⁹ cellules par colonne.
   4. Passez l’échantillon sur la colonne humide de l’aimant. Laver deux fois avec 3 mL de PBS-EDTA 2 mM et éluer les cellules avec 5 mL de PBS-EDTA 2 mM. Une deuxième exécution sur une nouvelle colonne suivant la même procédure est nécessaire pour améliorer la pureté de l’échantillon.
      REMARQUE : Nombre prévu de 6,1 x 10⁵ cellules/LRF (Figure 2A). Pour des nombres de LRF plus élevés, augmentez les réactifs et les méthodes en conséquence.
5. Évaluation de la pureté des cellules CD34+
   1. Ajouter à une aliquote de 100 μL de suspension obtenue après la sélection^CD34+, 2 μL d’anticorps CD34-PE humain ou 2 μL d’IgG-PE (témoin). Bien mélanger et incuber pendant 15 min à 4 °C.
   2. Lavez les cellules en ajoutant 2 mL de PBS et centrifugez à 400 x g pendant 5 min. Aspirer complètement le surnageant et le rétablir dans 200 μL de PBS.
   3. Analyser la pureté par cytométrie en flux comme le montre la figure 2A et la discussion.
      REMARQUE: Une pureté des cellules CD34+ supérieure à 90% est attendue (Figure 2Bii).
   4. Utilisez les cellules CD34+ directement ou congelez-les pour une utilisation ultérieure.
6. Congélation de cellules CD34+
   REMARQUE: La congélation des cellules CD34+ se fait à une densité de 10⁶ cellules par mL.
   1. Après la détermination du nombre de cellules CD34+, préparer les milieux de cryoconservation suivants : (1) 60 % Stemspan + 40 % FBS, (2) 40 % Stemspan + 40 % FBS + 20 % Dimethyl Sulfoxide (DMSO) et permettre le refroidissement à 4 °C.
   2. Centrifuger les cellules CD34+ à 400 x g à température ambiante pendant 5 min et resuspender la pastille dans une solution froide 1 puis l’ajouter immédiatement à la solution froide 2 (v/v).
   3. Placez immédiatement les cryotubes dans un congélateur à -80 °C pendant 24 h, puis transférez les cryotubes dans le réservoir d’azote liquide.

2. Culture et différenciation de cellules CD34+ pour produire des mégacaryocytes matures porteurs de proplaquettaires

REMARQUE: Le protocole de culture cellulaire(Figure 3A),schéma représentatif de la procédure de culture cellulaire sont détaillés dans cette section.

1. Décongélation des cellules CD34+ (si nécessaire)
   1. Préparer la solution de décongélation : 13 mL de PBS-20 % FBS et placer à 37 °C pendant 15 min. Transférez rapidement les cryotubes dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à un seul petit cristal de glace. Sous l’armoire de culture biologique, pipetter tout le contenu et transférer lentement dans 13 mL de solution de décongélation pré-avertie.
   2. Déterminez le nombre de cellules et la viabilité des cellules.
2. Protocole culturel, étape 1 : du jour 0 au jour 7
   NOTE: Habituellement, les cultures sont faites dans des plaques de 24 puits avec 1 mL de milieu par puits à une densité de 40 000 cellules viables / mL, correspondant à 20 000 cellules viables / cm². Il est crucial de respecter cette densité si une mise à l’échelle est prévue.
   1. Préparation du milieu de croissance : Dans les milieux d’expansion des cellules hématopoïétiques sans sérum (préalablement chauffés à 37 °C), ajouter la pénicilline-streptomycine-glutamine (PSG) 1x, la lipoprotéine de basse densité humaine (hLDL) à 20 μg/mL, le cocktail de cytokines d’expansion mégacarytaire 1x et la stemrégénine 1 (SR1) à 1 μM.
   2. Ensemencement cellulaire : Centrifuger les cellules CD34+ décongelées à 400 x g à température ambiante pendant 5 min. Retirez soigneusement le surnageant et ressuspendez la pastille cellulaire dans 1 mL de milieu de culture et effectuez une numération cellulaire et une viabilité pour déterminer le volume approprié pour ensemencer les cellules.
   3. Centrifuger les cellules 400 x g à température ambiante pendant 5 min et ressuspender la pastille dans le volume approprié du milieu de croissance chaud. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 7 jours.
3. Protocole de culture, étape 2 : du jour 7 au jour 13(Figure 3B,images représentatives au jour 13)
   NOTE: Habituellement, les cultures sont faites dans des plaques de 24 puits avec 1 mL de milieu par puits à une densité de 50 000 cellules viables / mL, correspondant à 25 000 cellules viables / cm². Il est crucial de respecter cette densité si une mise à l’échelle est prévue.
   1. Préparation du milieu de maturation : Dans les milieux d’expansion des cellules hématopoïétiques sans sérum (préalablement chauffés à 37 °C), ajouter PSG 1x, hLDL à 20 μg/mL, TPO à 50 ng/mL et SR1 à 1 μM.
   2. Examinez les cellules au microscope. Au jour 7, les cellules présentent un aspect rond et homogène en remplissant les puits ou les flacons sans être trop confluentes.
   3. Sous une armoire de biosécurité, transférez doucement les cellules dans un tube de 15 mL. Lavez les puits avec PBS. Ensuite, déterminez le nombre de cellules et leur viabilité pour calculer le volume approprié pour ensemencer les cellules.
   4. Centrifuger les cellules à 400 x g à température ambiante pendant 5 min. Retirez le surnageant et ressuspendez les cellules dans le volume approprié de milieu chaud calculé à l’étape précédente. Incuber les cellules à 37 °C, 5% de CO₂ pendant 6 jours.
4. Libération plaquettaire cultivée au jour 13
   1. Ajouter 0,5 μM de prostaglandine_I2 (IGP₂₎ et 0,02 U/mL d’apyrase à la culture et effectuer cinq fois le pipetage successif avec une pipette de 1 mL.
      REMARQUE: Les plaquettes sont maintenant libérées dans le milieu.

3. Analyse par cytométrie en flux (phénotypage MK et numération plaquettaire cultivée)

REMARQUE: Ce protocole peut être appliqué au phénotypage des cellules les jours de culture sélectionnés. Il permet également de déterminer le nombre de la libération plaquettaire cultivée (Figure 4A,B).

1. Préparation à l’analyse MK
   1. Étiquetez quatre ensembles de tubes de microcentrifugation comme suit : Cellules non étiquetées comme témoin, cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Cellules + 5 μL CD34 - PECy7, Cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 5 μL CD34 - PECy7. Utilisez un minimum de 1,10⁵ cellules par tube, ne dépassez pas 1,10⁶ cellules par tube. Ajouter à 100 μL de suspension cellulaire par tube de cytométrie et les différents anticorps. Incuber dans l’obscurité pendant 30 min à 4 °C.
   2. Ensuite, ajoutez 2 mL de PBS-EDTA 2 mM par tube et centrifugez à 400 x g pendant 5 min à température ambiante. Pendant la centrifugation, préparer une solution de PBS-EDTA 2 mM + 7-Aminoactinomycine-D (7AAD) (1/100), prévoir une solution de 300 μL par tube.
   3. Retirez le surnageant et prenez la pastille dans 300 μL de PBS-EDTA 2 mM avec 7AAD. Faire passer les échantillons dans le cytomètre en flux dans les 30 minutes.
      REMARQUE : La stratégie d’analyse de la cytométrie en flux est illustrée à la figure 3C et dans la discussion.
2. Préparation de tubes pour l’analyse plaquettaire en culture
   1. Étiquetez quatre ensembles de tubes de microcentrifugation comme suit : Cellules non étiquetées comme témoin, Cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488, Cellules + 20 μL CD42a - PE, Cellules + 5 μL CD41 - Alexa Fluor 488 + 20 μL CD42a - PE. Après cinq pipetages successifs dans un puits de culture, transférer 300 μL de la suspension dans un tube pour cytométrie contenant un nombre étalonné de billes fluorescentes.
   2. Ajouter les anticorps et incuber dans l’obscurité à TA pendant 30 min.
   3. Passez les échantillons à travers le cytomètre en flux dans les 30 minutes et réglez l’acquisition pour le passage de 5 000 perles.
      REMARQUE : La stratégie d’analyse de la cytométrie en flux est illustrée à la figure 4B et dans la discussion.

Extraction et sélection de cellules CD34+ à partir de LRF
Ici, la méthode, dérivée de Peytour et al.9, décrit l’extraction et la sélection de cellules CD34+ à partir de LRF rejetées disponibles dans les banques de sang après l’élimination des leucocytes. À la suite de la procédure de rinçage arrière, habituellement 1,03 x10 9 ± 2,45 x10 8 cellules/LRF (Moyenne±SEM; n = 155) sont récupérés avec une viabilité de 94,88 ± 0,10 %(Figure 2A i). Après la sélection cd34 positive, on obtient une moyenne de 615,54 x10 3 ± 12,28 cellules/LRF (n = 155)(figure 2A ii). Si le nombre de cellules est inférieur à 300 000, il faut conclure que la procédure n’a pas été effectuée correctement et doit être arrêtée. Pour évaluer le succès de la sélection CD34, la pureté des cellules CD34+ est évaluée par cytométrie en flux(Figure 2B). En routine, une pureté supérieure à 90 % (91,88 ± 0,79 %) est attendue(Figure 2B). Une pureté inférieure à 75% pourrait signifier qu’il y a eu un problème dans la conduite du protocole et en particulier dans l’élution des colonnes. En dessous d’une pureté de 75%, les cellules ne sont pas conservées pour des expériences de culture.

Figure 2: Analyse du nombre decellules CD34+/LRF et de la pureté des CD34. (A) (i) Une analyse, par compteur de cellules, du nombre de cellules et de leur viabilité obtenues à la suite de la procédure, y compris la collecte du PBMC et la sélection du CD34, est effectuée ((1.03.109 ± 2.45.108 cellules/LRF (Moyenne ± SEM; n = 155) avec une viabilité de 94,88 ± 0,10% (n = 155)). (ii) Une analyse, par compteur de cellules, est également effectuée après sélection du CD34 (615,54 x 103 ± 12,28 cellules/LRF (n = 155)). (B) La pureté de CD34 est analysée par cytométrie en flux. (i) Les cellules ont été colorées avec un anticorps CD34-PE et identifiées sur leurs paramètres FSC/SSC. (ii) Sur la base du signal de diffusion et de l’analyse de l’expression CD34, la pureté est déterminée. Un pré-portail de positivité CD34 a été utilisé en fonction du contrôle négatif du marqueur CD34. (iii) Comme on peut le voir sur le graphique à barres, une pureté des cellules CD34+ supérieure à 90 % (91,88 ± 0,79 % (n = 17)) est attendue. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Différenciation et maturation des proplaquettaires porteurs de MK
La procédure de culture cellulaire décrite est divisée en deux étapes. Le premier, du jour (D) 0 à D7, est dédié à la prolifération et à l’engagement hp dans la voie mégacaryocytaire en réponse à une combinaison de cytokines et à l’ajout d’un composé chimique SR1. La seconde, de D7 à D13, est axée sur la maturation MK et l’extension proplaquettaire suite à l’ajout de TPO et SR1(Figure 3A). En tant que contrôle de la qualité de la culture, le comptage cellulaire, la détermination de la viabilité cellulaire et le phénotypage des cellules sont permédés à D7 et D10. Ces étapes ont été choisies car elles sont cruciales pour l’engagement HP, la maturation D7 et MK, D10, respectivement (données personnelles). À D7 et 10, la prolifération est systématiquement de x4,16 ± 0,25 (n = 34) et x2,30 ± 0,16 (n = 5), respectivement, avec une viabilité cellulaire comprise entre 86,38 ± 0,73 % (n = 34); et 84,80 ± 2,67 % (n = 5)(figure 3B). En ce qui concerne le phénotypage cellulaire, comme le montre la figure 3C,à D0, plus de 90% des cellules sont positives pour CD34. Ensuite, les cellules CD34+ s’engagent vers la lignée mégacaryocytaire, comme en témoigne l’apparition de CD41, un marqueur spécifique et précoce de MKP. En effet, à D7, 50,20 ± 2,90% des cellules sont positives pour CD34 et CD41(Figure 3Bii). Ensuite, MK améliore leur maturation. À D10, la majorité des MK sont matures, avec moins de 15,60 ± 4,70 % des cellules négatives pour CD41, 47,90 ± 8,90 % pour CD34+CD41+ et 36,40 ± 12,40 % pour CD34-CD41+ (Figure 3Biii).

Figure 3: Différenciation et maturation des proplaquettaires porteuses de MK. (A) Schéma représentatif de la procédure de culture cellulaire. Une méthode en deux étapes est utilisée : une étape de prolifération de D0 à D7 (SR1 et cocktail de cytokines) et une étape de maturation de D7 à D13 (SR1 et TPO). À D13, les plaquettes cultivées peuvent être libérées après cinq pipetages successifs. (B) (i) Taux de prolifération à D7 (x4,16 ± 0,25 (n = 34)) et viabilité cellulaire (86,38 ± 0,73 % (n = 34)). (ii) Taux de prolifération à D10 (x2,30 ± 0,16 (n = 5)) et viabilité cellulaire (84,80 ± 2,67 % (n = 5)). (C) Analyse de cytométrie en flux état de l’évolution phénotypique de MK en culture. À D0, 95,80 ± 0,80 % des cellules sont POSITIVES CD34 (n = 3). À D7, 50,20 ± 2,90 % des cellules sont positives pour CD34 et CD41. À D10, moins de 15,60 ± 4,70 % des cellules sont négatives pour cd41. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Libération de plaquettes cultivées, jour 13
L’examen des puits à D13 montre des MK ronds et des MK porteurs de proplaquettaires(Figure 4A). En moyenne, 35 % des MK cultivés étendent les proplaquettaires12. Il convient de noter que D13 représente le jour optimal pour l’extension proplaquettaire et la libération plaquettaire. Si le niveau requis de MK capable d’émettre des proplaquettaires n’est pas atteint, quelque chose doit avoir mal tourné tout au long du processus de culture et les résultats ne doivent pas être pris en compte.

Bien que les mécanismes exacts favorisant la libération plaquettaire par la MK mature soient encore mal compris, il est bien connu que les forces hémodynamiques sont indispensables. Pour imiter ces forces in vitro,la suspension contenant du MK proplaquettaire est aspirée et repoussée cinq fois avec un cône P1000, puis analysée par cytométrie en flux. À cette fin, des tubes contenant un nombre étalonné de perles fluorescentes sont utilisés. Tout d’abord, les billes présentes dans le tube sont fermées sur la fenêtre CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5(Figure 4Bi,en rouge). Ensuite, les plaquettes cultivées sont visualisées dans une pré-porte (éléments de type plaquettaire), déterminée sur les paramètres de dispersion avant (FSC) et de dispersion latérale (SSC) des plaquettes natives(Figure 4Bii). Le nombre de plaquettes est ensuite déterminé en fonction de leur positivité CD41/CD42a (Figure 4Biii). Le comptage des cellules est arrêté dans ce protocole à 5 000 perles, mais un autre nombre fixe peut être utilisé en fonction de la recommandation du fournisseur. D’après les données acquises, le nombre de plaquettes comptées pour 5 000 perles est systématiquement à une moyenne de 24,01 ± 92 (n = 15)(Figure 4C). Connaissant le volume aspiré par le cytomètre en flux pour compter 5 000 billes (à calculer pour chaque cytomètre) et le volume total de culture, il est possible d’obtenir une approximation du nombre total de plaquettes cultivées libérées.

Figure 4: Libération de plaquettes cultivées au jour 13. (A) Image représentative en microscopie optique des proplaquettaires émettant du MK à D13. (B) Stratégie de quantification de la libération de plaquettes en culture. (i) Les perles sont fermées sur la fenêtre CD41-Alexa-fluor 488/PErcP-Cy5 (en rouge). (ii) Les éléments de type plaquettaire sont visualisés dans une porte déterminée sur les paramètres FSC/SSC des plaquettes natives (points gris). (iii) Les plaquettes cultivées sont déterminées sur leur positivité CD41/CD42 (violet). (C) Le nombre de plaquettes comptées pour 5 000 perles peut être obtenu, en moyenne de 24 011 ± 919 (n = 15). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La procédure en un coup d’œil
Pour mieux résumer la méthode et comprendre chaque étape, une affiche résumant le protocole étape par étape est présentée à la figure 5. Cette fiche récapitulative peut être affichée dans la salle de culture et servir de mémo. Il est à noter que le succès des expériences n’est garanti qu’avec les références de produits indiquées dans le tableau fourni.

Figure 5: Isolement du CD34+. Affiche résumant le protocole étape par étape. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.