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Article de méthode

Coloration du Ca2+ cytoplasmique avec Fluo-4/AM dans la pulpe de pomme

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DOI :

10.3791/62526

⸱

6 novembre 2021

 ,  ,  , 
1College of Horticulture, Qingdao Agricultural University

Dans cet article

Résumé

Des protoplastes isolés de cellules de pulpe de pomme ont été chargés d’un réactif fluorescent de calcium pour détecter la concentration cytoplasmique de Ca2+.

Résumé

Le Ca2+ cytosolique joue un rôle clé dans le développement des plantes. L’imagerie calcique est la méthode la plus polyvalente pour détecter les changements dynamiques dans le Ca2+ dans le cytoplasme. Dans cette étude, nous avons obtenu des protoplastes viables de cellules pulpaires par hydrolyse enzymatique. Des protoplastes isolés ont été incubés avec le réactif fluorescent à petites molécules (Fluo-4/AM) pendant 30 min à 37 °C. Les sondes fluorescentes ont réussi à coloré le Ca2+ cytosolique mais ne se sont pas accumulées dans les vacuoles. La3+,un bloqueur de canaux Ca2+, a diminué l’intensité de la fluorescence cytoplasmique. Ces résultats suggèrent que Fluo-4/AM peut être utilisé pour détecter les changements dans le Ca2+ cytosolique dans la chair du fruit. En résumé, nous présentons une méthode pour isoler efficacement les protoplastes des cellules de chair du fruit et détecter le Ca2+ en chargeant un réactif fluorescent de calcium à petites molécules dans le cytoplasme des cellules pulpaires.

Introduction

Ca2+ joue un rôle important dans la transduction du signal végétal et le métabolisme1,2. En outre, il régule les caractéristiques de qualité des fruits3,4, y compris la dureté, la teneur en sucre et la susceptibilité aux troubles physiologiques pendant le stockage5,6. Le Ca2+ cytoplasmique joue un rôle important dans la transduction du signal et régule la croissance et le développement des plantes7. La perturbation de l’homéostasie cellulaire du calcium peut induire une fosse amère dans les pommes8, la maladie des taches brunes dans les poires9et la pourriture ombilicale dans les tomates10, affectant la qualité des fruits et causant de graves pertes économiques3,11. L’imagerie calcique a une résolution spatiale et temporelle suffisante et est une méthode importante pour observer la dynamique du Ca2+ dans les cellules vivantes12,13.

À l’heure actuelle, il existe deux méthodes principales pour l’imagerie calcique intracellulaire dans les cellules vivantes: l’une utilise des sondes fluorescentes chimiques à petites molécules14, et l’autre est le capteur de codage génique (GECI)15,16. Compte tenu de la difficulté d’établir un système transgénique stable dans les arbres fruitiers et du développement plus long des fruits, GECIS ne convient pas à l’imagerie par fluorescence ca2+ des fruits.

Les sondes fluorescentes à petites molécules telles que Fluo-4/AM présentent un avantage particulier : leur forme d’ester AM (dérivé d’ester acétoxyméthyléfiable aux cellules) peut être facilement chargée en vrac dans des cellules vivantes sans avoir besoin de transfection, ce qui la rend flexible, rapide et non cytotoxique17. Fluo-4 / AM pourrait être chargé avec succès dans le tube pollinique de Pyrus pyrifolia18 et Petunia,19 ainsi que dans les cellules de garde20 et les poils racinaires d’Arabidopsis 21.

À l’heure actuelle, il existe peu de rapports sur la coloration par fluorescence de calcium des cellules de la pulpe22. En tant qu’élément minéral important, le calcium joue un rôle clé dans la croissance et le contrôle de la qualité des fruits des arbres tels que les pommes. Les pommiers sont mondialement reconnus comme une espèce économique importante, et les pommes sont considérées comme un aliment sain23. Dans cette étude, nous avons obtenu des protoplastes viables à partir de pulpe de fruit de pomme par hydrolyse enzymatique, puis chargé des réactifs fluorescents à petites molécules dans le cytoplasme pour détecter ca2+.

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Protocole

1. Extraction de protoplastes

  1. Préparer la solution de base : 20 mM deCaCl2,5 mM d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique et 0,4 M de D-sorbitol.
    REMARQUE: Le pH de la solution de base a été ajusté à 5,8 avec un tampon Tris de 0,1 M, filtré à travers des filtres solubles dans l’eau de 0,22 μm et stocké à 4 °C.
  2. Préparer la solution enzymatique : Mélanger 0,3 % (p/v) de Macerozyme R-10 et 0,5 % (p/v) de cellulase R-10 avec la solution de base.
  3. Ajouter 0,5 mL de solution enzymatique dans un tube centrifuge de 1,5 mL. Choisissez une pomme saine et mûre. Ensuite, coupez la pâte en 10 x 5 x 1 mm3 (Figure 1A-1C).
  4. Placer les morceaux de pulpe de pomme dans un tube centrifuge de 1,5 mL contenant une solution enzymatique, puis fermer le tube (Figure 1D).
  5. Incuber le tube à 28 °C pendant 1 h, en agitant à 70 tr/min dans un shaker dans l’obscurité.
  6. Lavez les morceaux de pulpe. Aspirer toute la solution enzymatique, puis ajouter 0,5 mL de la solution de base.
  7. Centrifuger à 300 x g pendant 2 min à température ambiante.
  8. Pour obtenir une suspension de protoplaste, aspirer la solution par le fond du tube de centrifugation (Figure 1E).

2. Coloration par fluorescence des ions calcium à petites molécules

  1. Préparer la solution de chargement Fluo-4/AM avec 2 mM de Fluo-4/AM, 20 % de F-127 et 10x solution saline tamponnée au phosphate (PBS:80 mM Na2HPO4,1,36 M NaCI, 20 mM KH2PO4et 26 mM KCI) dans un rapport de 1:1:2.
  2. Ajouter 1 μL de solution de charge Fluo-4/AM à 99 μL de la suspension de protoplaste présente dans les tubes centrifuges de 1,5 mL. Assurez-vous que la concentration finale du colorant fluorescent est de 5 μM. Mélangez la solution, puis fermez le tube.
  3. Traitement La3+ : Préparer une solution de La3+ de 100 μM avec 98 μL de suspension de protoplaste, 1 μL de 10 mM De La3+et 1 μL de solution de charge Fluo-4/AM. Mélanger la solution et fermer le tube.
  4. Incuber pendant 30 min à 37 °C dans l’obscurité.
  5. Laver les protoplastes par centrifugation à 300 x g pendant 2 min à température ambiante. Aspirer 70 μL de la solution et ajouter 70 μL de la solution de base.
  6. Incuber la suspension de protoplaste à 37 °C pendant 30 min pour se désestérifier complètement.
  7. Aspirer 15 μL de la suspension de protoplaste et égoutter sur une lame.
  8. Observer au microscope à fluorescence(figure supplémentaire S1).
    REMARQUE: Utilisez un appareil photo couleur avec une sensibilité élevée, c’est-à-dire un capteur CMOS de 3,2 MP (2048 x 1536) avec une résolution de pixels de 3,45 μm.
  9. Sélectionnez le canal GFP pour l’imagerie (20x). Réglez la luminosité sur 0,5.
    REMARQUE: L’éclairage est des cubes de lumière LED à intensité réglable avec un ensemble de filtres à revêtement dur intégré. La longueur d’onde d’excitation de Fluo-4/AM est de 490 nm.

3. Test de viabilité du protoplaste

  1. Préparer la solution diacétate de fluorescéine (FDA) : Dissoudre la FDA dans l’acétone jusqu’à ce que la concentration finale soit de 1 mg/mL.
  2. Préparer la solution de travail FDA avec 1 μL de la solution stock et 99 μL d’acétone.
  3. Ajouter 1 μL de solution de travail FDA à 99 μL de suspension de protoplaste. Mélanger la solution en pipetant de haut en bas, puis fermer le tube.
    REMARQUE: La concentration finale de la FDA est de 100 μg / L.
  4. Tache à température ambiante pendant 5 min dans l’obscurité.
  5. Préparez les lames et observez-les au microscope à fluorescence.
  6. Sélectionnez le canal GFP pour l’imagerie (Figure 1F).

4. Analyse d’images

  1. Analysez les images acquises à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images et de tableur (p. ex., Image-Pro Plus et Excel 2010).
  2. Sélectionnez deux diamètres verticaux parmi les protoplastes pour calculer l’intensité de fluorescence (Figure supplémentaire S2). Mesurer l’intensité de fluorescence de tous les protoplastes sous différents traitements a été mesurée. Pour le traitement final, utilisez un logiciel de retouche photo.

5. Analyse statistique

  1. Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un logiciel statistique (Figure supplémentaire S3). Les données sont présentées dans moyenne ± SD. Le test tde l’étudiant a été utilisé pour analyser les différences entre les groupes expérimentaux.

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Résultats

Suivant le protocole décrit ci-dessus, nous avons utilisé la méthode enzymatique pour obtenir des protoplastes viables à partir de la pulpe (Figure 1). Certains protoplastes avaient des vacuoles, tandis que d’autres n’en avaient pas. Alors que les protoplastes ne présentaient aucune fluorescence lorsque l’indicateur fluorescent Ca2+ n’y était pas chargé. Lorsque Fluo-4/AM a été chargé dans les protoplastes, le cytoplasme, mais pas la vacuole, est devenu fluorescent (

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Discussion

Dans cette étude, des protoplastes viables ont été obtenus par hydrolyse enzymatique. Notez que cette méthode nécessite des pommes fraîches. Le présent protocole permet l’isolement rapide d’un grand nombre de protoplastes de la pulpe de fruit pour une utilisation dans des études de recherche. L’applicabilité de cette méthode ne se limite pas à « Fuji »; les protoplastes de la pulpe de pomme de 'Dounan' et 'Honey Crisp' peuvent également être extraits par le même protocole(Figure supplémentaire S4). La so...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts avec le contenu de cet article.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le projet d’amélioration des variétés agricoles de la province du Shandong (2019LZGC007) et l’équipe d’innovation des arbres fruitiers du système technologique moderne de l’industrie agricole du Shandong (SDAIT-06-05).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
10× ; solution saline tamponnée au phosphateSolarbioP1022PBS (solution tamponnée au phosphate) est une solution tampon de phosphate, qui peut fournir un environnement ionique relativement stable et une capacité tampon de pH. Il s’agit d’une solution saline tampon souvent utilisée en biologie pour le clonage moléculaire et la culture cellulaire. Le pH est de 7,4.
Acide 2-(N-morpholino)éthanesulfoniqueSolarbioM8010Tampon biologique
CaCl2· ; Le chlorure de calcium 2H2OSolarbioC8370est un produit chimique blanc ou gris, principalement sous forme granulaire.
Cellulase R-10Yakult HonshaMX7352Dégrade les parois cellulaires végétales.
D-sorbitolSolarbioS8090Il a de bonnes propriétés hydratantes, prévient le dessèchement et empêche le sucre, le sel, etc. de cristalliser.
F-127Thermo Fisher ScientificP6867Pluronic F-127 est un polyol tensioactif non ionique (poids moléculaire d’environ 12500 Daltons), qui s’est avéré bénéfique pour favoriser la dissolution des colorants insolubles dans l’eau et d’autres matériaux dans les milieux physiologiques.
FDAThermo Fisher ScientificF1303FDA est un substrat d’estérase perméable aux cellules qui peut servir de sonde de viabilité qui mesure à la fois l’activité enzymatique, qui est nécessaire pour activer sa fluorescence, et l’intégrité de la membrane cellulaire, qui est nécessaire à la rétention intracellulaire de leur produit fluorescent
Fluo-4/AMThermo Fisher ScientificF14201L’indicateur de calcium fluorescent vert Fluo-4/AM est une version améliorée de l’indicateur de calcium Fluo-3/AM. Le Fluo-4/AM se charge plus rapidement et est plus lumineux à la même concentration. Il peut être bien excité avec un laser ionique argon de 488 nm.
Microscope à fluorescenceThermo FisherEVOS Auto 2Observez l’image de fluorescence.
Macerozyme R-10Yakult HonshaMX7351Dégrader les tissus végétaux pour séparer les cellules individuelles.
TrisSolarbioT8060Il est largement utilisé dans la préparation de tampons dans les expériences de biochimie et de biologie moléculaire.
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Références

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