Imagerie et quantification de dendrites neuronales intactes via CLARITY Tissue Clearing

Comprendre l’organisation spatiale, les modèles de connectivité et la morphologie de structures biologiques tridimensionnelles complexes est essentiel pour délimiter les fonctions de cellules et de tissus spécifiques. Cela est particulièrement vrai en neurosciences, dans lesquelles des efforts considérables ont été consacrés à la construction de cartes neuroanatomiques à haute résolution du système nerveux central^1,2. Un examen attentif des neurones qui composent ces cartes donne des morphologies variées, avec des connexions et des emplacements qui reflètent la fonction de ces divers ensembles de neurones^3,4. De plus, l’étude des structures subcellulaires, en particulier des épines dendritiques, peut informer la maturité des synapses, reflétant ainsi les processus de développement et les états de maladie neurologique^5,6,7. Ainsi, les approches qui améliorent la résolution et le débit d’imagerie sont essentielles pour mieux comprendre le fonctionnement du cerveau à toutes les échelles.

Des progrès récents ont élargi la boîte à outils moléculaire et génétique pour marquer et manipuler les populations de neurones. Le développement de nouveaux marqueurs fluorescents, combiné à de nouvelles méthodes d’introduction de ces marqueurs dans les neurones, permet un marquage différentiel des populations de neurones en interaction au sein du même échantillon animal ou cérébral^8,9,10,11. Étant donné que la lumière est diffusée par des lipides opaques et compte tenu de la teneur élevée en lipides des tissus cérébraux, l’imagerie des populations neuronales a été principalement limitée à des sections minces ou s’est appuyée sur des techniques avancées de microscropy (par exemple, la microscopie confocale, multiphotonique et à feuille de lumière) pour imager les structures profondes. Cependant, ces efforts ont été grandement renforcés par les progrès des techniques de nettoyage des tissus. Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/immunostaining/insitu hybridization-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) est l’une de ces techniques, dans laquelle les tissus d’intérêt sont infusés avec des monomères d’hydrogel (acrylamide et bis-acrylamide) puis lavés avec des détergents¹². Les monomères d’hydrogel s’hybrident pour créer un échafaudage d’hydrogel 3D stable, optiquement transparent et perméable aux étiquettes de macromolécules. Les acides nucléiques et les protéines sont maintenus dans la matrice hybridée, tandis que les lipides sont éliminés par les lavages détergents (Figure 1). Il en résulte un tissu stable suffisamment rigide pour maintenir la forme et l’orientation d’origine des cellules et des molécules non lipidiques, tout en faisant preuve d’une transparence optique suffisante pour imager facilement des structures profondes à haute résolution. Ce maintien de la structure et de l’orientation des tissus permet l’imagerie de tranches épaisses, préservant ainsi les connexions de cellule à cellule et les relations spatiales. De plus, comme l’emplacement et la disponibilité des protéines et des acides nucléiques sont maintenus pendant le processus de nettoyage, les tissus nettoyés sont capables de contenir des marqueurs basés sur l’expression, ainsi que des étiquettes exogènes. Ainsi, CLARITY se prête comme une méthode puissante pour imager de grandes quantités de structures cérébrales profondes et les connexions entre ces structures à haute résolution.

L’utilisation de CLARITY améliore considérablement les approches d’imagerie des populations neuronales. Cette technique est particulièrement efficace pour générer de grandes quantités de données d’imagerie. CLARITY fonctionne bien avec de multiples formes de fluorescence à base de protéines. Ce protocole utilise une approche basée sur lentiviral pour étiqueter de manière éparse les cellules avec EGFP et tdTomato; cependant, des allèles rapporteurs transgéniques exprimant tdTomato ou EGFP pour étiqueter les cellules à reconstruire ont été couramment utilisés. Il est important de choisir un fluorophore qui est à la fois photo-stable et brillant (par exemple, EGFP ou tdTomato). De plus, l’utilisation d’un promoteur puissant pour exprimer le fluorophore donne un contraste et une qualité d’image supérieurs. Les inconvénients de cette technique surviennent car l’analyse correcte de cette grande quantité de données peut prendre à la fois beaucoup de travail et de temps. Les microscopes spécialisés peuvent aider à améliorer le débit et à réduire la charge de travail. Cependant, la construction, la possession et / ou l’exploitation de microscopes avancés sont souvent prohibitifs pour de nombreux laboratoires. Ce travail présente une méthode simple, à haut débit, relativement rapide et simple de visualisation de grandes quantités de tissu neural à haute résolution en utilisant le nettoyage tissulaire CLARITY de grandes sections, combiné à la microscopie confocale standard. Ce protocole décrit cette approche à travers les étapes suivantes : 1) disséquer et préparer le tissu neural, 2) nettoyer le tissu, 3) monter le tissu, 4) imager les tranches préparées et 5) traiter des images de tranches complètes à l’aide de la reconstruction et de l’analyse du logiciel de visualisation par microscopie(Figure 2). Ces efforts aboutissent à des images à haute résolution qui peuvent être utilisées pour analyser les populations de neurones, les modèles de connexion neuronale, la morphologie dendritique 3D, l’abondance et la morphologie de la colonne vertébrale dendritique et les modèles d’expression moléculaire dans les tissus cérébraux intacts.

Le protocole suivant suit toutes les directives en matière de soins aux animaux pour le Baylor College of Medicine.

1. Dissection et préparation des tissus

1. Euthanasier la souris avec un surdosage d’isoflurane en plaçant la souris dans un récipient fermé avec une serviette imbibée d’isoflurane (ou par d’autres moyens approuvés par l’IUCAC).
2. Perfuser l’animal de manière transcardique à l’aide d’une aiguille de 25 G avec 10 mL de PBS glacé, suivie de 10 mL de PFA à 4%.
3. Disséquez la région cérébrale (ou le tissu) d’intérêt.
4. Placer le tissu disséqué dans 4% pfa pendant la nuit à 4 °C. Une bonne fixation est la clé de ce protocole. Ne sautez ni ne raccourcissez cette étape.
5. Après fixation dans du PFA à 4 % pendant au moins 12 h, transférer le tissu dans un mélange d’hydrogel d’acrylamide à 4 % pendant 24 h à 4 °C.
   REMARQUE: Lors de la décongélation de l’hydrogel, assurez-vous qu’il ne s’est pas polymérisé, cela peut se produire si l’hydrogel devient trop chaud. Décongeler sur la glace pour éviter une polymérisation prématurée.

2. Nettoyage des tissus

1. Placer le tissu cérébral (encore immergé dans l’hydrogel) dans un incubateur à vide pendant 3 h à 37 °C avec un vide de -90 kPa. Laissez le dessus du tube dévissé pour permettre au vide de se former correctement.
2. Lavez le tissu avec du PBS pendant 10 min à température ambiante (25 °C) en agitant doucement.
3. Placez l’échantillon de tissu polymérisé dans la chambre d’électrophorèse, en notant l’orientation du tissu à l’intérieur de la chambre.
4. Remplissez la chambre et le réservoir avec le tampon SDS d’électrophorèse fourni.
5. Exécuter l’échantillon à 70 V, 1 A et 35 C, avec un courant constant pendant environ 2 h/mm de tissu.
   1. Vérifiez l’échantillon périodiquement; il faudra peut-être plus de temps à la Chambre pour bien nettoyer. Un bon point de départ pour la clairière est 1-2 h par mm de tissu cérébral. Un cerveau de souris entier nécessite 8 à 10 heures pour une clairance suffisante. Rappelez-vous l’orientation de l’échantillon avant de le retirer de la chambre et assurez-vous de le replacer dans la chambre dans la même orientation.
      REMARQUE: La figure 3A montre à quoi ressemblera un cerveau entièrement nettoyé. Le cerveau aura l’air opaque et pas clair à ce stade en raison de la présence de SDS dissous, mais il devrait y avoir peu ou pas de teinte de couleur de tissu jaune après l’extraction des lipides.

3. Préparation et montage du tissu nettoyé

1. Une fois que l’échantillon a fini de se nettoyer et semble suffisamment clair, laver dans du PBS pendant la nuit à température ambiante. Remplacez le PBS par du PBS frais aussi souvent que possible. Cette étape est essentielle pour éliminer les FDS résiduelles qui peuvent former des précipités dans les étapes ultérieures.
2. Après le lavage final en PBS, lavez le tissu pendant 5 min dans de l’eau désionisée à température ambiante trois fois. Le tissu deviendra opaque à cette étape et peut se dilater.
3. Incuber le tissu dans la solution correspondant à l’indice de réfraction (voir tableau 1)pendant au moins 4 h à température ambiante. La figure 3B montre un morceau de tissu nettoyé après incubation dans une solution correspondant à l’indice de réfraction.
4. Pendant l’incubation du tissu dans une solution d’appariement de l’indice de réfraction, construisez une chambre de logement appropriée pour imager l’échantillon si nécessaire.
5. Construction d’une chambre d’imagerie pour de petits échantillons/tranches de tissus
   1. À l’aide d’une glissière en verre comme base de montage, posez des entretoises en caoutchouc ou en plastique et fixez-les avec de la super colle. Si des entretoises préfabriquées ne sont pas disponibles, utilisez des anneaux en plastique fabriqués à partir de sections transversales de tubes coniques.
   2. Assurez-vous de fixer ces pièces à la glissière de verre sans trous(Figure 3C).
   3. Placez le tissu nettoyé dans la chambre de montage préremplie avec une solution d’appariement de l’indice de réfraction.
   4. Montez solidement le tissu en plaçant un couvercle en verre sur le dessus et en le scellant avec du vernis à ongles.
   5. Imagez ce tissu en ajoutant une goutte de solution de montage correspondant à l’indice de réfraction directement sur le verre.
6. Grande chambre d’imagerie tissulaire
   1. Construisez cette chambre si le tissu a une épaisseur supérieure à 5 mm (convient à des cerveaux ou des hémisphères entiers).
   2. À l’aide d’un plat en verre de 10 cm avec une paroi haute, placez un tube conique de 50 mL au centre, en vous assurant que le diamètre du conique est suffisamment grand pour accepter le barillet de l’objectif utilisé.
   3. Faire 3% d’agarose dans l’eau et verser dans l’espace entre la boîte en verre et le tube conique, laisser refroidir pendant 1 h(Figure 3D). Cela formera un anneau d’agarose solide(Figure 3E).
   4. Collez solidement le tissu au fond de la chambre à l’aide de super colle et remplissez la chambre avec une solution d’indice de réfraction correspondant. Appliquez de la colle pour coller le tissu sur une région qui ne sera pas imagée pour permettre la récupération du tissu du plat sans endommager les régions d’intérêt.
      REMARQUE: Cette préparation est sensible au temps, car le milieu à indice de réfraction peut commencer à polymériser à moins d’être conservé de l’air et stocké à 4 ° C.

4. Imagerie d’échantillons de tissus nettoyés

1. Acquérir l’image à l’aide d’un microscope confocal avec un objectif 25x/0.95 NA avec une distance de travail de 4 mm.
2. Rallumez tous les équipements d’imagerie appropriés. Placez l’échantillon sur la scène et placez une goutte de solution correspondant à l’indice de réfraction sur le dessus de la chambre de montage.
3. Approchez soigneusement les médias d’immersion avec l’objectif et formez une colonne continue de médias.
4. En utilisant l’épifluorescence, trouvez un champ d’imagerie approprié.
5. Commencez la procédure d’acquisition d’image en testant les paramètres appropriés.
   1. Commencez par définir les paramètres de résolution et de vitesse de numérisation à l’aide de la Figure 4A comme guide. Si vous imaginez à l’aide d’un microscope confocal, fermez complètement le sténopé pour obtenir la plus petite section optique et donc la meilleure résolution z.
   2. Augmentez progressivement le gain de puissance/ capteur laser jusqu’à ce qu’une image appropriée soit obtenue avec un rapport signal/bruit élevé.
   3. Si vous utilisez l’imagerie bicolore EGFP/tdTomato standard, définissez les paramètres de collecte de lumière à l’aide de la Figure 4B comme guide.
   4. Définissez les paramètres de la pile z en fonction des points de départ et d’extrémité observés du tissu. Définissez la taille du pas en fonction de la résolution z souhaitée à l’aide de la Figure 4C comme guide.
      REMARQUE: Des tailles de pas plus petites donneront une plus grande résolution z, mais introduiront également plus de temps de séjour au laser, ce qui pourrait entraîner le blanchiment des échantillons.
   5. Lorsque vous êtes satisfait des paramètres d’acquisition d’image, acquérez l’image.
   6. Assurez-vous que l’image a un rapport signal/bruit élevé et montre des limites distinctes des structures(Figure 4D).

5. Traitement d’images et quantification 3D à l’aide d’un logiciel d’analyse par microscopie

REMARQUE: Les logiciels d’analyse d’images microscopiques sont des outils puissants pour la visualisation et le traitement d’images en trois dimensions. Bon nombre de ces programmes sont parfaitement adaptés à la manipulation de grands ensembles de données générés à partir d’échantillons de tissus nettoyés par imagerie. Les étapes suivantes et les chiffres associés correspondent au flux de travail du logiciel Imaris.

1. Ouvrez la pile d’images et importez-la dans le logiciel d’analyse sélectionné.
2. Affichez l’image dans un espace tridimensionnel et apportez les modifications souhaitées aux tables de choix à l’aide de l’ajusteur d’affichage pour mieux visualiser l’image.
   REMARQUE : La figure 5A illustre la profondeur d’imagerie extrême possible accessible par microscopie à 2 photons associée à l’éclaircissement des tissus CLARITY. La figure 5B montre des processus de dendrite distincts ainsi que des morphologies de colonne vertébrale clairement visibles à partir de la pile z présentée à la figure 5A.
3. Pour filtrer tout arrière-plan cohérent, cliquez sur le bouton Traitement d’image et sélectionnez le filtre de soustraction d’arrière-plan.
   REMARQUE: La figure 5C montre l’image avec un signal d’arrière-plan brumeux cohérent avant le traitement. La figure 5D montre l’image après l’application du filtre de soustraction d’arrière-plan.
4. Observez l’image 3D et familiarisez-vous avec elle en la regardant sous plusieurs angles et niveaux de zoom.
5. Démarrez le traçage de dendrite en sélectionnant d’abord l’outil Traceur de filament.
6. Cliquez sur Modifier le filament manuellement, sauter la création automatique.
7. Réglez le mode sur chemin automatique et cochez les corrections de centrage automatique et de diamètre automatique.
8. Maj + clic droit sur le corps de la cellule pour définir un point de départ.
9. Tracer le neurone sur toute la longueur de la dendrite; cliquez avec le bouton gauche de la fin de la dendrite pour définir le point de terminaison afin de permettre au logiciel de calculer automatiquement le chemin entre les points de départ et d’extrémité.
10. Répétez cette étape pour toutes les dendrites et tracez complètement la structure cellulaire.
11. Visualisez la cellule tracée et confirmez sa précision. Effectuez des ajustements manuels au besoin.
12. Sélectionnez l’onglet Création.
13. Sélectionnez l’option Recalculer le diamètre de la dendrite.
14. Suivez l’assistant jusqu’à la fin pour obtenir une dendrite tracée plus précise.
15. Sélectionnez l’onglet Dessiner.
16. Cliquez sur la case d’option Colonne vertébrale pour commencer à dessiner des épines.
17. Définissez le diamètre approximatif de la colonne vertébrale au besoin et utilisez l’outil de mesure pour obtenir une représentation précise des diamètres de la colonne vertébrale.
18. Cliquez sur le centre des têtes de colonne vertébrale pour ajouter une nouvelle colonne vertébrale.
19. Répétez cette opération pour toutes les épines de la dendrite.
    REMARQUE: Il est important d’observer la dendrite sous tous les angles possibles lors de l’ajout manuel d’épines.
20. Vérifiez la précision des épines nouvellement ajoutées et apportez des modifications au besoin.
21. Sélectionnez l’onglet Création.
22. Sélectionnez l’option Recalculer le diamètre de la colonne vertébrale pour permettre au logiciel de déterminer les diamètres de tête et de cou appropriés, qui sont cruciaux pour l’analyse des données en aval.
23. Suivez l’assistant de création du diamètre de la colonne vertébrale jusqu’à la fin.
24. Observez le résultat du calcul et effectuez les ajustements manuels nécessaires. La figure 5E montre un neurone entièrement tracé avec des épines.
25. Pour créer une liste classifiée d’épines, sélectionnez l’onglet Outils.
    REMARQUE : L’extension MATLAB doit être installée pour que cela fonctionne.
    1. Pour installer l’extension MATLAB, ouvrez la fenêtre des préférences.
    2. Sélectionnez l’option Outils personnalisés.
    3. Ajoutez le MCR d’exécution MATLAB approprié.
26. Cliquez sur Classer les épines.
27. Modifiez les paramètres souhaités pour la classification de la colonne vertébrale.
28. Cliquez sur Classifier les épines sur l’extension MATLAB. La figure 5F montre la dendrite recouverte d’épines classées codées par couleur.
29. Sélectionnez l’onglet Statistiques.
30. Configurez les statistiques souhaitées pour quantifier les données en cliquant sur le bouton Configurer dans le coin inférieur gauche de cet onglet.
31. Une fois la méthode de représentation des statistiques choisie, exportez les données à l’aide du bouton Exporter les statistiques sur l’affichage de l’onglet vers un fichier situé en bas à droite de cette fenêtre.
32. Représenter graphiquement les statistiques à l’aide d’une méthode graphique préférée.

Après l’acquisition de l’image, la morphologie cellulaire représentative a été analysée à l’aide de statistiques intégrées et de scripts de classification dans le logiciel d’analyse. Les données recueillies(Figure 6A)reflètent que le neurone 2 a une structure dendritique plus grande avec une densité plus élevée d’épines. Dans l’ensemble, les données suggèrent que le neurone 2 a une structure dendritique plus complexe que le neurone 1. Pour étayer ce résultat, une analyse sholl standard a été effectuée, qui affirme que le neurone 2 est plus complexe dendritiquement que le neurone 1, comme en témoigne le nombre accru d’intersections sholl à 50-100 μm du soma(Figure 6B). Enfin, les épines dendritiques des deux neurones imagés ont été classées en quatre catégories principales en fonction de leur forme et de leur taille globales. Les épines qui présentent des formes plus filopodaires sont probablement des sous-types de colonne vertébrale plus immatures. Les épines à tête définie, appelées épines de champignons, contiennent probablement des synapses plus développées et matures7. L’analyse présentée ici montre que le neurone 1 contient une plus grande proportion d’épines de type filopodia par rapport au neurone 2(Figure 6C). Ainsi, sur la base de la morphologie, le neurone 2 est plus mature sur le plan du développement car il est plus grand, plus ramifié et contient une densité plus élevée d’épines matures.

Figure 1: Le protocole CLARITY rend les tissus transparents tout en maintenant la structure inhérente et les relations spatiales molécule-molécule. (A) Orientation originale du tissu neuronal et des composants intercellulaires avant le nettoyage. (B) Les monomères d’hydrogel (lignes violettes) sont infusés dans le tissu et polymérisés en un maillage d’hydrogel. Le tissu et le maillage d’hydrogel sont réticulés par fixation au formaldéhyde. (C) Le tissu est ensuite lavé avec des solutions de détergent ionique lorsqu’il est exposé à des champs électriques. Au cours de ce processus, les micelles détergentes éliminent les molécules lipidiques du tissu, laissant derrière elles un réseau réticulé d’hydrogel transparent et de biomolécules. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Organigramme du protocole, schématant la préparation des tissus, le nettoyage, le montage, l’imagerie et le traitement d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3: Construction de chambres de montage pour des échantillons de tissus nettoyés. (A) Nettoyage du cerveau entier dans le PBS avant immersion dans une solution d’appariement de l’indice de réfraction. (B) Tranche de cerveau dans une solution d’appariement d’indice de réfraction. ( C )Chambred’imagerie pour les grands et petits échantillons de tissus nettoyés. Les chambres peuvent être fabriquées en utilisant une variété de matériaux, y compris, mais sans s’y limiter, des plastiques imprimés en 3D et des tubes coniques coupés. (D) Chambre d’imagerie pour l’imagerie de l’ensemble du cerveau ou de l’hémisphère, en utilisant un tube conique de 50 mL comme soulagement avant de verser de l’agarose. (E) Chambre d’imagerie du cerveau entier ou de l’hémisphère avec agarose entièrement réglée; cette configuration est optimale pour les objectifs d’immersion de gros barils. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Acquérir de grands ensembles de données de haute qualité à partir d’échantillons de tissus nettoyés. ( A )Paramètresd’acquisition d’images utilisés pour l’imagerie haute résolution de cellules entières. Le sténopé a été entièrement fermé pour permettre de fines sections optiques. La vitesse de numérisation a été déterminée empiriquement en fonction des temps de séjour optimaux des pixels. (B) Réglages du trajet de la lumière: ceux-ci dépendront du fluorophore et de l’équipement utilisé. ( C )Paramètresde la pile Z; un pas z fin a été utilisé pour capturer autant d’informations que possible dans la direction z. D) Projection maximale représentative; La barre d’échelle représente 25 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Analyse 3D des dendrites dans le logiciel d’analyse. (A) Vue latérale d’une pile z de 600 μm acquise à partir d’un tissu de 1 mm d’épaisseur exprimant tdTomato; la barre d’échelle représente 100 μm. (B) Vue de dessus de la même pile z acquise dans le panneau A; la barre d’échelle représente 100μm. (C) Image confocale acquise de tissu exprimant l’EGFP. Les fichiers image peuvent être directement importés dans le logiciel d’analyse et pré-traités pour une meilleure qualité d’image; La barre d’échelle représente 25 μm. (D) La soustraction de seuil est utilisée pour supprimer le signal de fond cohérent présent dans C. (E) Traçage du filament et identification de la colonne vertébrale: ce processus est meilleur lorsqu’il est effectué semi-automatique avec la fonction de profondeur automatique vérifiée. Les épines ont ensuite été étiquetées à la main après une reconstruction complète de la dendrite; La barre d’échelle représente 25 μm. (F) Classification de la colonne vertébrale à l’aide d’une extension MATLAB intégrée. Les épines ont été codées par couleur en fonction de leur morphologie; les épines trapues sont rouges; les épines de champignons sont vertes; les longues épines minces sont bleues; les filopodes sont violets; La barre d’échelle représente 25 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 6: Résultats représentatifs. (A) Tableau des mesures morphologiques communes générées automatiquement par le programme d’analyse sélectionné. (B) Nombre d’intersections sholl générées par les statistiques du programme. ( C )Diagrammecirculaire représentant la distribution des morphologies de la colonne vertébrale dendritique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Recettes de solution d’appariement d’images réfractives et de solution d’hydrogel. La composition de la solution d’appariement de l’indice de réfraction et de l’hydrogel est répertoriée.

Les auteurs n’ont rien à divulguer pour le moment.