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Article de méthode

Cultures de coupes organotypiques en tant que modèles précliniques du microenvironnement tumoral dans le cancer du pancréas primitif et les métastases

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DOI :

10.3791/62541

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22 juin 2021

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1Department of Surgery, University Medical Center Schleswig-Holstein, 2Institute of Medical and Marine Biotechnology, University of Lübeck, 3Fraunhofer Research and Development Center for Marine and Cellular Biotechnology, 4Institute for Surgical Pathology, Medical Center - University of Freiburg, Faculty of Medicine, University of Freiburg, 5Tumorbank Comprehensive Cancer Center Freiburg, Medical Center - University of Freiburg, 6Core Facility Histopathology and Digital Pathology Freiburg, Medical Center - University of Freiburg

Auteurs correspondants : Rüdiger Braun <ruediger.braun@uksh.de>, Matthias Brandenburger <matthias.brandenburger@emb.fraunhofer.de>

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la préparation de cultures en tranches organotypiques (OTSC). Cette technique facilite la culture ex vivo de tissus multicellulaires intacts. Les OTSC peuvent être utilisés immédiatement pour tester leur réponse respective aux médicaments dans un environnement multicellulaire.

Résumé

Des modèles précliniques réalistes du cancer primitif du pancréas et des métastases sont nécessaires de toute urgence pour tester la réponse thérapeutique ex vivo et faciliter le traitement personnalisé des patients. Cependant, l’absence de microenvironnement spécifique à la tumeur dans les modèles actuellement utilisés, par exemple les lignées cellulaires dérivées de patients et les xénogreffes, ne permet que des informations prédictives limitées. Les cultures en tranches organotypiques (OTSC) comprennent du tissu multicellulaire intact, qui peut être rapidement utilisé pour les tests de réponse aux médicaments à résolution spatiale.

Ce protocole décrit la génération et la culture de tranches tumorales viables du cancer du pancréas et de ses métastases. Brièvement, le tissu est coulé dans de l’agarose à bas point de fusion et stocké dans un tampon isotonique froid. Ensuite, des tranches de tissu de 300 μm d’épaisseur sont générées à l’aide d’un vibratome. Après préparation, les tranches sont cultivées à une interface air-liquide à l’aide d’inserts de culture cellulaire et d’un milieu de culture approprié. Pendant la culture, les changements dans la différenciation et la viabilité des cellules peuvent être surveillés. De plus, cette technique permet d’appliquer le traitement à des tissus tumoraux humains viables ex vivo et à des analyses ultérieures en aval, telles que le profilage du transcriptome et du protéome.

Les OTSC offrent une occasion unique de tester la réponse individuelle au traitement ex vivo et d’identifier les profils transcriptomiques et protéomiques individuels associés à la réponse respective de tranches distinctes d’une tumeur. Les CSOTS peuvent être explorés davantage afin d’identifier des stratégies thérapeutiques permettant de personnaliser le traitement du cancer du pancréas primitif et des métastases.

Introduction

Les modèles précliniques existants de l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) et des métastases respectives sont de mauvais prédicteurs de la réponse au traitement chez les patients, ce qui constitue un inconvénient majeur dans le développement de médicaments et l’identification de biomarqueurs prédictifs1. Bien que les modèles tels que les organoïdes et les xénogreffes dérivés de patients soient prometteurs, leur utilisation reste limitée2. Les principales limites de ces modèles in vitro sont l’absence de microenvironnement tumoral et la xénogreffe chez les espèces immunodéprimées non humaines. En particulier dans le PDAC et ses métastases, le microenvironnement tumoral a considérablement gagné en intérêt au cours des dernières années en raison de ses fonctions cruciales dans la biologie tumorale. Il comprend des composants cellulaires et acellulaires, tels que des (myo-)fibroblastes, des cellules stellaires pancréatiques, des cellules immunitaires, des vaisseaux sanguins, une matrice extracellulaire, des cytokines et des facteurs de croissance3. Ce microenvironnement n’est pas un composant tumoral non fonctionnel, mais induit la progression tumorale et les métastases et semble contribuer de manière substantielle à la résistance aux radiothérapies et à la chimiothérapie4. Le microenvironnement PDAC compromet non seulement mécaniquement l’administration des médicaments, mais possède également une activité immunitaire et de piégeage des médicaments 5,6,7. Ainsi, des modèles précliniques qui reflètent l’interaction complexe des cellules tumorales et du microenvironnement tumoral sont nécessaires de toute urgence pour tester de manière adéquate la réponse au traitement des patients ex vivo et guider le traitement clinique individualisé.

Les cultures ex vivo d’échantillons tumoraux frais représentent une approximation proche de la tumeur in situ. Les cultures en tranches organotypiques (OTSC) ont été récemment développées et étudiées pour plusieurs tumeurs, telles que les cancers de la tête, du cou, du sein, de la prostate, du poumon, du côlon et du pancréas 8,9,10,11,12. Il a été démontré que les cellules souches exotiques conservent leur morphologie de base, leur activité proliférative et leur microenvironnement pendant la culture pendant une période définie et dépendante des tissus 11,12,13. Les CSOT des PDACs ont maintenu leur viabilité, leur morphologie et la plupart des composants de leur microenvironnement tumoral pendant 4 à 9 jours dans plusieurs études in vitro 5,12,14. D’un point de vue prospectif, cette technique permet une application immédiate du traitement à des tissus tumoraux humains viables ex vivo et des analyses ultérieures en aval, telles que le profilage du transcriptome et du protéome.

La mise en place d’OTSC offre une occasion unique de tester la réponse au traitement ex vivo rapidement après la chirurgie. Ainsi, les OTSC permettront d’identifier prospectivement des stratégies thérapeutiques pour personnaliser le traitement de la maladie métastatique. Ce protocole décrit la génération et la culture de CSTO viables du cancer du pancréas.

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Protocole

Les échantillons de tissus ont été collectés et traités après approbation par le comité d’éthique local de l’Université de Lübeck (# 16-281).

1. Prélèvement et manipulation de tissus frais

REMARQUE : Chaque échantillon de tissu humain non fixé doit être manipulé avec prudence afin de prévenir le risque d’infection par des agents pathogènes transmissibles par le sang. Tous les patients doivent être testés négatifs pour le VIH, le VHB et le VHC avant le traitement des tissus. Portez un manteau protecteur et manipulez les échantillons de tissus humains avec des gants.

  1. Prélever un échantillon de tissu PDAC frais, non fixé et non congelé d’une taille minimale de 0,4 x 0,4 cm immédiatement après la chirurgie et transporter l’échantillon au laboratoire dans une solution de stockage de tissus.
  2. Si possible, traitez immédiatement le tissu frais.
  3. Vous pouvez également entreposer les mouchoirs dans une solution de stockage de mouchoirs sur de la glace humide à 4 °C pendant la nuit. Cependant, le stockage des tissus peut entraîner une altération de la viabilité et doit généralement être évité.

2. Préparation

  1. Préparation à base d’agarose à faible point de fusion
    1. Préparez 100 ml d’agarose à bas point de fusion (8 %) en dissolvant 8 g d’agarose dans 100 ml de solution de Ringer préchauffée et conservez-la à 4 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
    2. À l’annonce de la résection de la tumeur, faites fondre l’agarose au micro-ondes.
    3. Placez l’agarose dans un bain-marie préchauffé (37 °C) lui permettant de refroidir à des températures physiologiques avant la préparation.
  2. Configuration du vibratome
    1. Placez une lame de rasoir dans le support du vibratome et effectuez un réglage automatique de l’angle selon les instructions du fabricant, le cas échéant.
    2. Refroidissez l’enveloppe de la chambre de coupe à l’aide d’une unité de refroidissement ou de glace humide.
    3. Remplissez la chambre de coupe avec environ 100 ml d’une solution de coupe physiologique (p. ex., solution de Ringer).
    4. Placez la lame de rasoir montée dans la solution de coupe pré-refroidie, en laissant la lame de rasoir refroidir.

3. Enrobage tissulaire dans l’agarose à bas point de fusion

  1. Lavez l’échantillon de tissu avec du PBS refroidi (4 °C) et placez le tissu dans du PBS sur une grande boîte de Pétri (~14 cm) sur de la glace.
  2. Retirez l’excès de tissu conjonctif macroscopiquement visible sur la glace à l’aide d’un scalpel, car cela pourrait entraver l’efficacité de la coupe.
  3. Placez le mouchoir dans une petite boîte de Pétri (~3 cm).
  4. Ajustez l’orientation du tissu de sorte que le tissu conjonctif restant visible macroscopiquement ait la même orientation que le plan du fond de la boîte de Pétri. Le fond de la boîte de Pétri a la même orientation que le plan de coupe.
  5. Versez l’agarose à faible point de fusion préparée dans la petite boîte de Pétri.
  6. Réajustez l’orientation du tissu, si nécessaire, à l’aide d’une pince.
  7. Placez la boîte de Pétri sur de la glace humide pour un durcissement plus rapide de l’agarose.
  8. Coupez soigneusement le tissu à l’aide d’un scalpel, en laissant au moins 5 mm d’agarose autour de chaque côté du tissu.
  9. Transférez soigneusement le tissu incrusté et collez-le sur le porte-échantillon à l’aide de super colle.
  10. Après quelques secondes, placez le porte-échantillon dans la chambre de coupe.
  11. Ajustez l’orientation du tissu vers la lame du rasoir, si nécessaire.

4. Tranchage du tissu incrusté d’agarose à l’aide d’un vibratome

  1. Définissez les limites extérieures de la plage de coupe (axe y) en fonction de la taille de l’échantillon de tissu.
  2. Ajustez la lame vers le haut du bloc de tissu.
  3. Réglez la vitesse de coupe sur 0,04 mm/s, l’amplitude de coupe sur 1 mm et l’épaisseur de la tranche sur 300 μm.
  4. Coupez soigneusement les premières tranches et transférez-les dans un récipient séparé avec une solution de coupe pré-réfrigérée (4 °C) sur de la glace humide.

5. Culture de cultures en tranches organotypiques

  1. Préparez une plaque de 6 puits avec 1 mL du milieu de culture approprié par puits.
    1. Moyen A : DMEM/F12 avancé, 10 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine.
    2. Moyen B : RPMI 1640, 10 % FBS, 1 % pénicilline/streptomycine, 4 μg/mL d’insuline, 8 μg/mL d’EGF, 0,3 μg/mL d’hydrocortisone.
      REMARQUE : Le milieu pour des conditions de culture optimales peut varier en fonction du tissu et du patient. Deux milieux de culture tissulaire distincts ont été comparés, l’un basé sur le DMEM/F12 (milieu A), le second basé sur le RPMI (milieu B). Aucune différence substantielle n’a été détectée entre ces milieux. Pour toutes les expériences présentées dans ce protocole, le milieu A a été utilisé.
  2. Placez la plaque à 6 puits avec le milieu dans un incubateur, en laissant la température et le pH s’ajuster avant la culture.
  3. Placez les tranches sur des inserts de culture cellulaire (par exemple, des inserts en PTFE hydrophile avec des pores de 0,4 μm) à l’aide d’un filtre de regard.
  4. Retirez tout excès de solution de coupe en plaçant le filtre chargé sur un chiffon stérile.
  5. Placez le filtre chargé dans la plaque à 6 puits préparée. N’ajoutez pas de support supplémentaire à l’insert.
  6. Placez la plaque à 6 puits dans un incubateur (37 °C, 5 % de CO2).
  7. Changez le milieu tous les 2 jours en répétant les étapes 5.1, 5.2 et 5.5 avec une nouvelle plaque à 6 puits.
    REMARQUE : Les cultures en tranches organotypiques peuvent être cultivées pendant différentes périodes en fonction de la question de recherche individuelle.

6. Essai de viabilité de la résazurine

REMARQUE : Le test de viabilité de la résazurine mesure l’activité métabolique générale des cultures de tranches organotypiques en fonction de la réduction de la résazurine bleue non fluorescente en résorifine fluorescente rouge dans les cellules vivantes15. Le test n’a pas d’effets toxiques sur les cellules et peut être appliqué aux cultures à plusieurs reprises en fonction de la question de recherche individuelle. La viabilité a été mesurée à l’aide du test de la résazurine tous les 2 à 3 jours.

  1. Préparation de la solution mère de resazurin
    1. Éteignez la lumière de la hotte stérile, car la solution mère de resazurin est sensible à la lumière.
    2. Préparez une solution mère avec 10 mg/mL de sel de sodium de résazurine dans 1x PBS.
    3. Conservez la solution mère dans des aliquotes protégées contre la lumière à 4 °C au réfrigérateur jusqu’à utilisation.
  2. Évaluation de la viabilité globale des tranches
    1. Éteignez la lumière de la hotte stérile, car la solution mère de resazurin est sensible à la lumière.
    2. Diluer la solution mère de résazurine 1:250 avec un milieu approprié.
      REMARQUE : Le milieu utilisé pour la dilution doit être le même que celui utilisé pour la culture (milieu A ou milieu B).
    3. Préparer 1 mL de la solution mère de résazurine finale par tranche et ajouter 1 mL supplémentaire pour le témoin à blanc, p. ex., pour 6 tranches, diluer 28 μL de solution mère de résazurine dans 7 mL de milieu.
    4. Distribuer la solution de résazurine dans des plaques à 6 puits, avec 1 mL de solution de résazurine diluée par puits.
    5. Transférez les filtres de culture avec les tranches dans les puits avec la solution de résine. Un puits avec la solution resazurin est maintenu vide en tant que contrôle à blanc.
      REMARQUE : Pour simplifier la procédure expérimentale, cette étape peut être combinée avec le changement de fluide (étape 5.7). Cependant, si des mesures de viabilité supplémentaires sont nécessaires, le test peut être effectué à tout moment pendant la culture des cultures en tranches.
    6. Placez les tranches de tissu dans un incubateur pendant 1 h à 37 °C et 5% de CO2.
    7. Préparez de nouvelles plaques à 6 puits avec le milieu de culture si la culture en tranches est poursuivie (voir les étapes 5.1 et 5.2).
    8. Retirez les filtres de culture avec les tranches de la solution de résazurine et retirez l’excès de solution en plaçant le filtre chargé sur un chiffon stérile.
    9. Transférez les filtres de culture avec les tranches sur la plaque de culture préalablement préparée.
    10. De chaque 6 puits, prélever 100 μL de solution de résazurine et les transférer sur une plaque à 96 puits. À partir du contrôle à blanc, placez trois échantillons (3 x 100 μL) dans des puits séparés de la plaque à 96 puits.
    11. Quantifiez l’extinction à l’aide d’un photomètre à plaque selon les instructions du fabricant. La longueur d’onde d’excitation est réglée sur 545 nm et la longueur d’onde d’émission est réglée sur 600 nm.

7. Fixation du formol et incorporation de paraffine dans les cellules à ciel ouvert

  1. Transférez avec précaution les tranches de tissu cultivées dans une cassette d’enrobage en plastique. Pour ce faire, suivez les étapes ci-dessous.
    1. Placez le filtre de culture avec la tranche montée sur une boîte de Pétri.
    2. À l’aide d’un scalpel, découpez soigneusement la membrane filtrante avec la tranche de tissu montée.
    3. Transférez soigneusement la membrane filtrante avec la tranche montée dans un sac en nylon de biopsie et placez-la dans une cassette d’enrobage.
    4. Transférez ensuite les cassettes d’enrobage de plastique dans un récipient contenant du formol pré-réfrigéré (4 °C) à 4,5 %. Les tranches peuvent être conservées dans une solution de formol à 4 °C jusqu’à nouvel ordre, mais doivent être incubées pendant au moins 24 h.
      REMARQUE : Les OTSC doivent être transférés avec une grande prudence car ils se déchirent facilement.
  2. Rincez avec précaution la culture en tranches fixées au formol avec de l’eau courante du robinet pendant 1,5 h.
  3. Déshydrater la tranche de tissu fixée au formol par incubation dans de l’éthanol à 70 % (2 fois pendant 3 h), de l’éthanol à 95 % (1 fois pendant la nuit, 1 fois pendant 3 heures), suivi de l’éthanol absolu (1 fois pendant 3 heures, 1 fois pendant la nuit).
  4. Nettoyer la tranche de tissu fixée au formol par 3 h d’incubation dans du xylène deux fois.
  5. Immergez le mouchoir avec de la paraffine à 60 °C (1x pour la nuit, 1x pour 2 h). Intégrez le tissu dans un bloc de paraffine dans un moule d’enrobage de tissu.
  6. Sectionner le bloc de tissu incrusté de paraffine à 4 μm d’épaisseur à l’aide d’un microtome et le faire flotter dans un bain d’eau à 40 °C contenant de l’eau distillée. Transférez les sections sur des lames de verre.
  7. Incuber des sections de paraffine pendant 1 h à 60 °C pour lier le tissu au verre. Incuber les lames pendant la nuit à 37 °C.

8. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)

  1. Déparaffiniser les sections de l’étape 7.7 par incubation dans du xylène (3x pendant 5 min).
  2. Réhydratez-vous par incubation dans de l’alcool absolu (2x pendant 5 min), de l’alcool à 95% (2x pendant 5 min) et de l’alcool à 70% (1x pendant 5 min). Rincer brièvement à l’eau distillée.
  3. Colorer la solution d’hématoxyline de Mayer pendant 5 min. Rincer à l’eau courante du robinet pendant 10 min.
  4. Contre-coloration dans une solution d’éosine à 0,5 % pendant 40 s. Rincer à l’eau distillée.
  5. Déshydrater par incubation dans de l’alcool à 70 % (maximum 1 min), de l’éthanol à 95 % (2 fois pendant 3 min) et de l’alcool absolu (2 fois pendant 3 min), respectivement.
  6. Effacer en trois changements de xylène (quelques secondes chacun). Placez une goutte de support de montage et couvrez les diapositives avec une lamelle.

9. Immunohistochimie des OTSC

  1. Déparaffiniser les sections par incubation dans du xylène 2x pendant 10 min, suivi d’un éthanol/xylol 1:1 pendant 10 min.
  2. Transférez les lames à 100 % d’éthanol (2 fois pendant 3 min), 96 % d’éthanol (2 fois pendant 3 min), 70 % d’éthanol (1 fois pendant 3 min), puis à 50 % d’éthanol (1 fois pendant 3 min).
  3. Effectuer la récupération de l’antigène pour démasquer l’épitope antigénique. Chauffez les lames au micro-ondes dans un tampon de citrate pendant 5 min à 900 W, puis 2x pendant 8 min à 600 W. Laissez les lames refroidir à température ambiante pendant 20 min.
  4. Laver au PBS 3x pendant 3 min sur un shaker.
  5. Effectuer la perméabilisation des membranes cellulaires par incubation dans 0,1% de Triton X-100 dans du PBS (200 μL par lame) dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 10 min.
  6. Laver au PBS pendant trois changements, 3 min chacun sur l’agitateur.
  7. Incuber des sections avec une solution à 3 % de H2O2 dans du méthanol (200 μL par lame) dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 10 min pour bloquer l’activité endogène de la peroxydase.
  8. Laver au PBS 3x pendant 3 min sur un shaker.
  9. Ajouter 200 μL de tampon bloquant (1:50 de sérum de cheval dans du PBS) et incuber dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 25 min.
  10. Videz le tampon de blocage des lames en inclinant la lame sur un mouchoir en papier.
  11. Appliquer 200 μL d’anticorps primaires correctement dilués dans un diluant d’anticorps sur les lames et incuber dans une chambre humidifiée à 4 °C pendant la nuit. En tant que témoin négatif, utilisez l’isoforme appropriée d’immunoglobulines de souris à la même dilution que l’anticorps primaire.
  12. Laver 3 fois pendant 3 min dans du PBS sur un shaker.
  13. Appliquer 200 μL d’anticorps secondaires biotinylés (solution 1:50 dans du PBS) sur les lames et incuber dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 30 min.
  14. Laver 3 fois pendant 3 min dans du PBS sur un shaker.
  15. Préparez le complexe de peroxydase à base d’avidine et de biotine selon les instructions du fabricant avant l’application. Appliquer 200 μL de complexe avidine-biotine-peroxydase sur les lames et incuber dans une chambre humidifiée à température ambiante pendant 30 min.
  16. Laver 3 fois pendant 3 min dans du PBS sur un shaker.
  17. Appliquer 200 μL de solution de substrat DAB (fraîchement préparée directement avant utilisation : 1 goutte de DAB dans 1 mL de substrat), 200 μL par lame. Laisser le développement de la couleur 1 à 3 min jusqu’à ce que l’intensité de couleur souhaitée soit atteinte.
  18. Rincer à l’eau courante du robinet pendant 10 min.
  19. Contre-colorez les lames en immergeant les côtés dans de l’hématoxyline pendant 5 min.
  20. Rincer à l’eau courante du robinet pendant 10 min.
  21. Couvrez les lames à l’aide d’un support de montage aqueux et de lamelles. Les lames montées peuvent être stockées durablement à température ambiante.

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Résultats

La figure 1 donne un aperçu du flux de travail pour cultiver des OTSC à partir de tissus tumoraux frais et non congelés. Des échantillons de CADP primaires et de métastases ont été prélevés directement après la résection chirurgicale et conservés toute la nuit sur de la glace humide à 4 °C dans la solution de stockage tissulaire. Les échantillons ont été traités et les tranches ont été cultivées comme décrit dans le protocole. La morphologie macroscopique de chaque OTSC n’a pas beaucoup chan...

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Discussion

Les OTSC d’échantillons tumoraux frais sont une approximation proche de la tumeur in situ. Ils maintiennent leur morphologie de base, leur activité proliférative et leur microenvironnement pendant la culture pendant une période définie et dépendante des tissus 11,12,13. Cette technique permet l’application immédiate du traitement au tissu tumoral humain viable ex vivo et les analyses ultérieures en aval, telles...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont révélé aucun conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

R. Braun a été soutenu par la Clinician Scientist School Lübeck (DFG #413535489) et le Junior Funding Program de l’Université de Lübeck.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Advanced DMEM/F-12 MediumGibco12634028
Agarose Low MeltRoth6351.28 % dans une solution Ringer
Diluant d’anticorps, Fond RéducteurDakoS3022
AquaTexMerck108562
Bioéthanol (99 %, dénaturé)CHEMSolute2,21,19,010
Acide citrique monohydrateSigma AldrichC7129
Caspase-3 clivée (Asp175) (5A1E) Rabbit mAbCell Signalling Technology9664Dilution 1:400
Derby Extra Double Edge Safety Razor BladesDerby Tokai
Cassettes d’enrobageRothH579.1
Eosin Y-solution 0,5 % aqueuseMerck10,98,44,100
Eukitt Durcissement rapideSigma-Aldrich3989
Sérum fœtal bovinGibco10270106
Solution de formaldéhyde 4,5 %,tamponnée Bü ; fa ChemikalienB211101000
Hem alun solution acide selon MayerRothT865
Humain EGFMilteniy Biotec130-097-794
HydrocortisoneSigma Aldrich (Merck)H0888
Peroxyde d’hydrogène 30 %Merck1,08,59,71,000
Insuline humaineSigma Aldrich (Merck)12643
Substrat liquide DAB+ Chromogen SystemDakoK3468
MACS Solution de stockage de tissusMilteniy Biotech130-100-008
MéthanolMerck10.600.092.500
Lames de microscope Superfrost Plus ThermoScientificJ1800AMNZ
Insert de culture cellulaire Millicell, 30 mm, PTFE hydrophile, 0,4 & micro ; mMillipore (Merck)PICM0RG50
souris monoclonale anti-humaine Cytokératine 7 (Clone OV-TL 12/30)DakoM7018Dilution 1:200
Souris monoclonale Anti-humaine Ki67 Clone MIB-1DakoM7240Dilution 1:200
Souris monoclonale Anti-vimentine (Clone V9)DakoM0725Dilution 1:200
Souris témoin négatif IgG2aDakoX0943Dilution 1:200
Souris témoin négatif IgG1DakoX093101-21:200 dilution
Paraffine (température de fusion 56° ;- 58° ;)Merck10,73,37,100
Pénicilline-Streptomycine (10.000 U/ml)Gibco15140122
PBS pH 7,4 (1x) Cytométrie en flux GradeGibcoA12860301
Sel de résazurine sodique ; 10 mg/ml dans PBSSigma AldrichR7017dilution 1:250
Solution de RingerFresenius Kabi2610813
RPMI-1640 MediumSigma Aldrich (Merck)R8758
Plaque d’essai de culture tissulaire 6TPP92006
Triton X-100Sigma Aldrich9002-93-1
VECTASTAIN Elite ABC-Peroxydase KitVector LaboratoriesPK-6200
Xylène (extra pur)J.T.Baker8,11,85,000
/fort>
ClarioStar Lecteur de microplaquesBMG Labtech
Centre d’enrobage de paraffine E61110Leica
Microtome rotatif Microm HM355SThermo Scientific
Section Système de transfert Microm STSThermo Scientific
VT 1200S VibratomLeica

Références

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