Méthode de micro-injection pour les embryons d’anophèles gambiens

Résumé

Les techniques de micro-injection sont essentielles pour introduire des gènes exogènes dans les génomes des moustiques. Ce protocole explique une méthode utilisée par le laboratoire James pour microinjecter des constructions d’ADN dans des embryons d’Anophèles gambiens afin de générer des moustiques transformés.

Résumé

Les techniques de micro-injection embryonnaire sont essentielles pour de nombreuses études moléculaires et génétiques d’espèces d’insectes. Ils fournissent un moyen d’introduire des fragments d’ADN exogènes codant pour des gènes d’intérêt ainsi que des traits favorables dans la lignée germinale de l’insecte de manière stable et héréditaire. Les souches transgéniques résultantes peuvent être étudiées pour les changements phénotypiques résultant de l’expression de l’ADN intégré pour répondre à des questions de base ou utilisées dans des applications pratiques. Bien que la technologie soit simple, elle exige de l’enquêteur de la patience et de la pratique pour atteindre un niveau de compétence qui maximise l’efficacité. On voit ici une méthode de micro-injection d’embryons du moustique africain du paludisme, Anopheles gambiae. L’objectif est de délivrer par microinjection de l’ADN exogène à l’embryon afin qu’il puisse être absorbé dans les cellules germinales (pôles) en développement. L’expression à partir de l’ADN injecté de transposases, d’intégrases, de recombinases ou d’autres nucléases (par exemple les protéines associées à CRISPR, Cas) peut déclencher des événements qui conduisent à son insertion covalente dans les chromosomes. L’An. gambiae transgénique généré à partir de ces technologies a été utilisé pour des études de base des composants du système immunitaire, des gènes impliqués dans l’alimentation sanguine et des éléments du système olfactif. En outre, ces techniques ont été utilisées pour produire des souches d’An. gambiae avec des caractéristiques qui peuvent aider à contrôler la transmission des parasites du paludisme.

Introduction

Les techniques de micro-injection sont utilisées pour manipuler expérimentalement des organismes depuis le début des années 1900^1. La microinjection a été utilisée pour étudier à la fois les fonctions biologiques de base et / ou introduire des changements importants dans la biologie d’un organisme désiré. La technique de micro-injection a été d’un intérêt particulier pour les biologistes vecteurs et a été largement utilisée pour manipuler les génomes vectoriels^2-11. Les expériences de transgénèse chez les vecteurs arthropodes visent souvent à rendre les vecteurs moins efficaces pour transmettre le....

Protocole

1. Préparation des moustiques à la micro-injection

1. Ensemencez une cage¹³ (~5000 cm³⁾avec ~100 moustiques mâles et 200-300 femelles adultes de 1-2 jours après l’éclosion et laissez-les s’accoupler pendant 2 jours.
2. Après la période d’accouplement, fournir aux moustiques un repas de sang en utilisant soit 2 mL de sang avec un dispositif d’alimentation artificielle, soit des animaux anesthésiés vivants selon les pratiques insectaires¹⁴. Le lendemain, fournissez aux moustiques un deuxième repas de sang pour s’assurer que toutes les femelles accouplées ont eu l’occasion de se nourrir et que les m....

Résultats

Un exemple représentatif de l’application du protocole de microinjection décrit peut être trouvé dans Carballar-Lejarazú et al⁵. L’intention ici était d’insérer un système de forçage génétique autonome dans la lignée germinale d’une souche de laboratoire, G3, d’An. gambiae. Le système a été conçu pour cibler le locus orthologue cardinal (Agcd)sur le troisième chromosome de cette espèce, qui code une peroxydase hémique qui catalyse la conversion de la 3-hydroxykynurénine .......

Discussion

Grâce à la disponibilité accrue de technologies de génie génétique précises et flexibles telles que CRISPR/Cas9, les organismes transgéniques peuvent être développés de manière plus simple et plus stable qu’auparavant. Ces outils ont permis aux chercheurs de créer des souches transgéniques de moustiques vecteurs qui sont très proches d’atteindre les propriétés souhaitées de réfractaire aux agents pathogènes (modification de la population) ou de stérilité héréditaire (suppression de la population). Cependant, pour dévelop.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10x tampon de micro-injection	-	-	1 mM NaHPO4 tampon, pH 6,8, 50 mM KCl
Membrane buvard (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blottion)	Bio-Rad		Soigneusement et directement coupé en morceaux de 2x1 cm
Tubes coniques 50 ml (tube à centrifuger jetable, polypropylène)	Fisher Brand		Extrémités coupées
Eau désionisée ou doublement distillée (ddH20)  ;	Mili-Q		Dans une bouteille de lavage  ;
Microscope de dissection  ;	Leica  ;	Leica MZ12	Pour l’alignement de l’embryon
Forceps  ;			N° 5 taille  ;
Récipient en verre  ;	Pyrex	n° 3140	125 x 65
Diapositive en verre  ;	Fisher Brand	No. 12-549-3	75x26 mm
Incubateur	Barnsted Lab-line	Modèle n° 150	28 ° ; C
KCl			50 mM
Film dentaire latex  ;	Crosstex International	n° 19302
Microinjecteur	Sutter Instrument		XenoWorks Digital Microinjector
Microloader Pointes de pipette  ;	Eppendorf  ;		20 et micro ; L microchargeur epT.I.P.S.
Micromanipulateur	Sutter Instrument		Micromanipulateur XenoWorks
Micropipette  ;	Pluie  ;		20 et micro ; L
Extracteur de micropipettes  ;	Sutter Instrument	Sutter P-2000 extracteur
Microscope  ;	Leica	DM 1000 LED ou M165 FC	Pour la micro-injection
Papier filtre à fibres minimales  ;	Fisher Brand	n° 05-714-4	Papier de chromatographie, épais
Moustiques  ;	MR4, BEI Resources		Anopheles gambiae, femelles adultes accouplées, nourries de sang 4 à 5 jours après l’éclosion
NaHPO4 tampon  ;			1 mM, ph 6,8
Maille
Pinceau	Blick	n° 05831-7040	Fin, taille 4/0
Boîte de Pétri			Plastique, (60x15 mm, 90x15 mm)
Acétate			de sodium  ; Capillaires en
verre de quartz 3M  ;	Sutter N° d’instrument	QF100-70-10	Avec filament, 1 mm de diamètre extérieur, ID 0,7 10 cm de longueur
Eau PCR  ;	Roche	n° 03315843001

de micropipettesde nylon