Préparation de membrane plasmique à petite échelle pour l’analyse de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Golnoush Madani; Erwin Lamping; Hee Ji Lee; Masakazu Niimi; Alok K. Mitra; Richard D. Cannon

doi:10.3791/62592

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Article de méthode

Préparation de membrane plasmique à petite échelle pour l’analyse de Candida albicans Cdr1-mGFPHis

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DOI :

10.3791/62592

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13 juin 2021

Golnoush Madani^*¹ , Erwin Lamping^*¹ , Hee Ji Lee¹ , Masakazu Niimi¹^,² , Alok K. Mitra³ , Richard D. Cannon¹

¹Sir John Walsh Research Institute, Faculty of Dentistry, University of Otago, ²Department of Microbiology, Faculty of Medicine, Chulalongkorn University, ³School of Biological Sciences, University of Auckland

^* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cet article présente un protocole d’isolement de la membrane plasmique à petite échelle pour la caractérisation de la protéine Cdr1 Cdr1 de Candida albicans ABC (ATP-binding cassette), surexprimée dans Saccharomyces cerevisiae. Une double étiquette mGFPHis clivable C-terminale avec un linker de 16 résidus entre Cdr1 et l’étiquette a été conçue pour faciliter la purification et le criblage détergent de Cdr1.

Résumé

Le succès de la caractérisation biochimique et biophysique des transporteurs ABC dépend fortement du choix du système d’expression hétérologue. Au cours des deux dernières décennies, nous avons développé une plateforme d’expression des protéines membranaires de levure qui a été utilisée pour étudier de nombreuses protéines membranaires fongiques importantes. L’expression hôte Saccharomyces cerevisiae ADΔΔ est supprimée dans sept principaux transporteurs ABC endogènes et contient le facteur de transcription Pdr1-3 avec une mutation de gain de fonction qui permet la surexpression constitutive de gènes protéiques membranaires hétérologues intégrés de manière stable sous forme de copies uniques au locus génomique PDR5. La création de vecteurs plasmidiques polyvalents et l’optimisation de stratégies de clonage en une seule étape permettent le clonage, la mutagénèse et l’expression rapides et précis de transporteurs ABC hétérologues. Ici, nous décrivons le développement et l’utilisation d’une nouvelle double étiquette mGFPHis clivée par la protéase (c’est-à-dire la protéine fluorescente verte améliorée par levure monomère yEGFP3 fusionnée à une étiquette de purification d’affinité à six histidines) qui a été conçue pour éviter toute interférence possible de la balise avec la protéine d’intérêt et pour augmenter l’efficacité de liaison de la balise His aux résines d’affinité nickel. La fusion de mGFPHis à la protéine membranaire ORF (cadre de lecture ouvert) permet une quantification facile de la protéine par inspection de gels de polyacrylamide et détection de produits de dégradation conservant la balise mGFPHis. Nous démontrons comment cette caractéristique facilite le criblage des détergents pour la solubilisation des protéines membranaires. Un protocole pour l’isolation efficace, rapide et fiable des préparations de membrane plasmique à petite échelle du transporteur d’efflux multimédicament Candida albicans Cdr1 surexprimant dans S. cerevisiae ADΔΔ, marqué en C-terminal, est présenté. Ce protocole d’isolation des membranes plasmiques à petite échelle génère des membranes plasmiques de haute qualité en une seule journée de travail. Les préparations de membrane plasmique peuvent être utilisées pour déterminer les activités enzymatiques des variantes mutantes Cdr1 et Cdr1.

Introduction

L’extraction des protéines membranaires intégrales de leur environnement lipidique natif peut affecter considérablement leur structure et leur fonction¹^,²^,³^,⁴. La composition lipidique complexe des membranes biologiques⁵ garantit que des interactions protéine-lipide d’importance critique peuvent se produire⁶. Les lipides maintiennent l’intégrité structurelle des protéines membranaires, leur permettant ainsi de fonctionner correctement dans leur(s) compartiment(s) membranaire(s) destination(s)