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Article de méthode

Suivi longitudinal des infections des voies urinaires et leur traitement chez la souris à l’aide de l’imagerie par bioluminescence

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DOI :

10.3791/62614

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14 juin 2021

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1Laboratory of Ion Channel Research (LICR), VIB-KU Leuven Center for Brain & Disease Research, Leuven, Belgium & Department of Cellular and Molecular Medicine, KU Leuven, 2Biomedical MRI, Department of Imaging & Pathology, KU Leuven, 3Belgium & KU Leuven Centre of Microbial and Plant Genetics, VIB-KU Leuven Center for Microbiology, Leuven, 4Laboratory of Experimental Urology, Department of Development and Regeneration, KU Leuven

Dans cet article

Résumé

Ce manuscrit décrit l’administration intravésicale de bactéries uropathogènes avec un opéron lux pour induire une infection des voies urinaires chez la souris et l’analyse longitudinale in vivo ultérieure de la charge bactérienne à l’aide de l’imagerie par bioluminescence.

Résumé

Les infections des voies urinaires (IVU) se classent parmi les infections bactériennes les plus courantes chez l’homme et sont systématiquement traitées avec des antibiotiques empiriques. Cependant, en raison de l’augmentation de la résistance microbienne, l’efficacité des antibiotiques les plus utilisés a diminué. Pour trouver d’autres options de traitement, il est très nécessaire de mieux comprendre la pathogenèse des infections urinaires et les mécanismes qui déterminent la susceptibilité aux infections urinaires. Afin d’étudier cela dans un modèle animal, un test reproductible et non invasif pour étudier l’évolution de l’infection urinaire est indispensable.

Pendant des années, l’étalon-or pour le dénombrement de la charge bactérienne a été la détermination des unités formant des colonies (UFC) pour un volume d’échantillon particulier. Cette technique nécessite des homogénats d’organes post-mortem et des dilutions en série, ce qui limite la production de données et la reproductibilité. Comme alternative, l’imagerie par bioluminescence (BLI) gagne en popularité pour déterminer la charge bactérienne. Le marquage des agents pathogènes à l’aide d’un opéron lux permet la détection et la quantification sensibles de manière non invasive, permettant ainsi un suivi longitudinal. Jusqu’à présent, l’adoption de l’BLI dans la recherche sur les infections urinaires reste limitée.

Ce manuscrit décrit la mise en œuvre pratique de BLI dans un modèle d’infection des voies urinaires chez la souris. Ici, un guide étape par étape pour la culture des bactéries, l’instillation intravésicale et l’imagerie est fourni. La corrélation in vivo avec l’UFC est examinée et une preuve de concept est fournie en comparant la charge bactérienne d’animaux infectés non traités avec des animaux traités aux antibiotiques. En outre, les avantages, les limites et les considérations spécifiques à la mise en œuvre de BLI dans un modèle d’infection urinaire in vivo sont discutés. La mise en œuvre de l’BLI dans le domaine de la recherche sur les infections urinaires facilitera grandement la recherche sur la pathogenèse des infections urinaires et la découverte de nouvelles façons de prévenir et de traiter les infections urinaires.

Introduction

Les infections des voies urinaires (IVU) sont parmi les infections bactériennes les plus courantes chez l’homme. Près de la moitié des femmes connaîtront une infection urinaire symptomatique au cours de leur vie1. Les infections limitées à la vessie peuvent donner lieu à des symptômes urinaires tels qu’une augmentation de la fréquence urinaire, l’urgence, l’hématurie, l’incontinence et la douleur. Lorsque l’infection monte dans les voies urinaires supérieures, les patients développent une pyélonéphrite, avec malaise, fièvre, frissons et maux de dos. En outre, jusqu’à 20% des patients atteints d’infections urinaires souffrent d’infections récurrentes entraînant une diminution spectaculaire de la sensibilité aux antibiotiques2,3,4. Au cours des dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour les nouvelles thérapies pour le traitement et la prévention des infections urinaires récurrentes. Malgré une meilleure compréhension de l’immunité innée et adaptative des voies urinaires inférieures et des facteurs de virulence bactérienne nécessaires à l’invasion et à la colonisation, aucun changement radical dans le régime de traitement n’a été traduit dans la pratique urologique quotidienne2. Afin d’étudier la pathogenèse et la susceptibilité aux infections urinaires in vivo,un test reproductible et non invasif est indispensable.

Plusieurs modèles d’infection urinaire animale ont été décrits allant des nématodes aux primates, mais le modèle murin est principalement utilisé5,6. Ce modèle consiste en un cathétérisme transurétral de souris (femelles) et l’instillation ultérieure d’une suspension bactérienne, le plus souvent escherichia coli uropathogène (UPEC), directement dans la lumière de la vessie7. Après l’inoculation, la charge bactérienne a traditionnellement été quantifiée en déterminant les unités formant des colonies (UFC). Cette technique nécessite de sacrifier des animaux pour obtenir des homogénats d’organes post-mortem et des dilutions en série, ce qui limite la production de données et la reproductibilité. De plus, le suivi longitudinal de la charge bactérienne chez les animaux individuels n’est pas possible en utilisant cette technique.

En 1995, Contag et al. ont suggérél’utilisation d’agents pathogènes marqués au bioluminescent pour surveiller les processus pathologiques chez les animaux vivants8,9. Depuis lors, l’imagerie par bioluminescence (BLI) a été appliquée à de nombreux modèles d’infection tels que la méningite, l’endocardite, l’ostéomyélite, les infections de la peau et des tissus mous, etc.10,11,12. Dans le modèle UTI murin, une souche UPEC avec l’opéron lux complet(luxCDABE)de Photorhabdus luminescens peut être utilisée13. Une réaction enzymatique est catalysée par la luciférase bactérienne qui dépend de l’oxydation des aldéhydes à longue chaîne réagissant avec le mononucléotide de flavine réduit en présence d’oxygène, donnant la flavine oxydée, un acide gras à longue chaîne et la lumière12. L’opéron lux code pour la luciférase et d’autres enzymes nécessaires à la synthèse des substrats. Par conséquent, toutes les bactéries métaboliquement actives émettront continuellement de la lumière bleu-vert (490 nm) sans avoir besoin de l’injection d’un substrat exogène12. Les photons émis par les bactéries marquées luxpeuvent être capturés à l’aide de caméras CCD (Charge-Coupled Device) refroidies très sensibles.

L’utilisation de bactéries bioluminescentes dans un modèle d’infection urinaire permet la quantification longitudinale et non invasive de la charge bactérienne, en omettant la nécessité de sacrifier des animaux à des moments fixes pendant le suivi de la détermination de l’UFC. Malgré le large éventail de possibilités, l’accumulation de preuves de la robustesse de cette technique BLI dans d’autres domaines et de ses avantages par rapport aux modèles classiques d’infection urinaire, elle n’a pas été largement mise en œuvre dans la recherche sur les infections urinaires. Le protocole présenté ici fournit un guide détaillé étape par étape et met en évidence les avantages de BLI pour toutes les futures recherches sur les infections urinaires.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices du Conseil communautaire de l’Union européenne et ont été approuvées par le comité d’éthique animale de la KU Leuven (P158/2018).

1. Cultiver des bactéries (adaptées de7,13,14)

  1. Préparation
    1. Choisissez une variété UPEC luminescente qui correspond le mieux aux besoins expérimentaux.
      NOTE: Ici, l’isolat clinique de cystite, UTI89 (E. coli), a été sélectionné en raison de sa capacité uropathogène chez les humains et les rongeurs, et de son utilisation courante dans les modèles d’infection urinaire murine5,7,15. La souche isogénique bioluminescente portant l’opéron lux complet (luxCDABE) est en outre appelée UTI89-lux. Cet opéron porte également des gènes de résistance au sulfate de kanamycine (Km). Par conséquent, Km peut être utilisé pour sélectionner des colonies bioluminescentes13.
    2. Faire une courbe de corrélation pour l’UFC et la densité optique à 600 nanomètres (OD 600 nm) pour la souche bactérienne choisie7.
      1. Pour ce faire, cultivez des bactéries (en utilisant le protocole ci-dessous) et faites 8 dilutions différentes dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Mesurer la DO à 600 nm pour toutes ces dilutions et les plaquer sur des plaques de Luria-Bertani (LB) pour déterminer l’UFC.
      2. Tracez les valeurs OD 600 nm et les valeurs CFU pour déterminer la corrélation et obtenir une courbe standard.
        REMARQUE: Pour les expériences futures, mesurez la DO à 600 nm et utilisez cette courbe standard pour obtenir une estimation instantanée de l’UFC dans une solution bactérienne.
        ATTENTION: Les UPEC sont des bactéries pathogènes, assurez-vous que les pièces sont correctement équipées et utilisez un équipement de protection individuelle.
  2. Trois jours avant l’instillation
    1. Obtenir des colonies uniques en striant le stock de glycérol des bactéries, à l’aide d’une boucle d’inoculation, sur des plaques LB complétées par 50 μg/mL Km et en les cultivant pendant la nuit à 37 °C. Scellez ces plaques avec un film de paraffine pour conserver à 4 °C jusqu’à 1 semaine.
  3. Deux jours avant l’instillation
    1. Remplissez un tube de fond rond stérile en polystyrène de 14 mL avec des capuchons à double position avec 5 mL de bouillon LB complété par 50 μg / mL Km. Choisissez une seule colonie bactérienne avec une boucle d’inoculation et ajoutez-la au bouillon LB. Vortex pendant 10 s pour assurer un bon mélange.
    2. Culture statique avec le capuchon encliquetable en position ouverte à 37 °C pendant la nuit.
      REMARQUE: La croissance statique d’E. coli favorise l’expression du type 1-pili, qui sont essentiels à l’adhésion et à l’invasion des cellules épithéliales urinaires.
    3. Préparez un Erlenmeyer stérile ou une fiole de culture.
  4. Un jour avant l’instillation
    1. Après l’incubation, vortex le tube pendant 10 s pour assurer une homogénéisation correcte de la culture bactérienne. Faire une sous-culture dans l’Erlenmeyer en ajoutant 25 μL de la suspension bactérienne à 25 mL de milieu LB frais sans antibiotiques.
    2. Fermer l’Erlenmeyer et cultiver statiquement à 37 °C pendant la nuit.
  5. Le jour de l’instillation
    1. Vortex l’Erlenmeyer pendant 10 s pour assurer un bon mélange.
    2. Verser la culture de l’Erlenmeyer dans un tube de culture de 50 mL et centrifuger à 3 000 x g et 4 °C pendant 5 min. Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille bactérienne dans 10 mL de PBS stérile et vortex à nouveau pendant 10 s.
    3. Choisissez la concentration expérimentale de l’inoculum (UFC) et utilisez la courbe standard obtenue à l’étape 1.1.2 pour déterminer la DO 600 nm correspondante.
    4. Ajouter 1 mL de la culture bactérienne remise en suspension dans 9 mL de PBS stérile et vérifier la DO à 600 nm. Ajuster davantage en ajoutant soit du PBS stérile, soit une solution bactérienne concentrée, jusqu’à ce que la DO souhaitée de 600 nm soit atteinteà 7.
      REMARQUE: Par exemple, pour UTI89-lux, ajustez la culture en ajoutant PBS jusqu’à ce que le DO 600 nm atteigne 0,45, correspondant à 2 x10 7 UFC / 50 μL. Pour vérifier le nombre d’UFC viables, faites des dilutions en série 10 fois et plaquez 50 μL des cinquième et sixième dilutions 10 fois sur des plaques LB en triple exemplaire pour obtenir moins de 300 colonies. Compter les colonies obtenues le lendemain après l’incubation nocturne à 37 °C. OD 600 nm donne une lecture instantanée mais utiliser l’UFC comme contrôle de qualité.

2. Inoculation des animaux (adapté de7,16)

  1. Préparation des animaux
    1. Choisissez la ou les souches de souris souhaitées en fonction de la question de recherche et de la disponibilité des lignes knock-out, des détails expérimentaux et des différences de sensibilité aux infections urinaires5,17. Gardez à l’esprit que le cathétérisme transurétral est plus facile chez les souris femelles. N’utilisez pas d’animaux de moins de 8 semaines, car ils sont immunologiquement immatures. Ici, des souris femelles C57Bl/6J âgées de 12 semaines ont été utilisées.
    2. Commandez les animaux bien à l’avance et laissez-les s’acclimater, idéalement pendant 7 jours. Regroupez les animaux dans des cages ventilées individuellement, dans des conditions standard de 12 h de lumière et d’obscurité.
    3. Raser la région abdominale des animaux pour limiter la perte de signal. N’utilisez pas de crème dépilatoire, car elle peut brûler rapidement la peau des animaux. Retenez l’animal en tenant fermement le frottement et les membres postérieurs avec la main non dominante tout en se rasant avec la main dominante. Alternativement, rasez-vous sous anesthésie à l’isoflurane.
      REMARQUE: Les animaux ont été rasés 2 jours avant l’imagerie, étant donné que les animaux toiletteront encore plus la zone rasée.
    4. Fournissez de l’eau et de la nourriture standard ad libitum tout au long de l’expérience. Cependant, privez les animaux d’eau 2 h avant l’instillation pour minimiser le volume de la vessie pendant l’instillation.
    5. Montez une pointe d’angiocathéter stérile de 24 G sur une seringue de 100 μL et remplissez la seringue avec la solution bactérienne préparée à l’étape 1.5.3.
      REMARQUE: Pour déterminer la luminescence d’arrière-plan, obtenez une image de référence avant l’instillation (voir l’étape 3 ci-dessous).
  2. Instillation des animaux
    1. Placer les animaux dans une chambre d’induction et les anesthésier par inhalation d’isoflurane avec de l’oxygène pur comme gaz porteur (induction à 3% et entretien à 1,5%).
    2. Placez un animal sur une surface de travail en position couchée et maintenez une anesthésie stable à l’isoflurane à l’aide d’un cône nasal pendant l’instillation. Appliquez la pommade pour les yeux.
    3. Expulser l’urine résiduelle en appliquant une compression douce et en effectuant des mouvements circulaires sur la région suprapubienne. Nettoyez le bas-ventre avec de l’éthanol à 70% avant l’instillation.
    4. Lubrifiez l’extrémité du cathéter avec une solution saline normale. Placez l’index de la main non dominante sur l’abdomen et poussez-le doucement vers le haut. Commencez le cathétérisme de l’urètre dans un angle de 90° (verticalement) et une fois la résistance rencontrée, inclinez-le horizontalement avant de l’insérer davantage (0,5 cm).
      REMARQUE: Ne poussez jamais le cathéter avec force, car cela causerait des dommages à l’urètre. Des mouvements de rotation doux peuvent être utiles dans l’insertion du cathéter. D’autre part, un manque de résistance indique généralement une insertion erronée dans le vagin.
    5. Effectuer une instillation lente (5 μL/s) de 50 μL de l’inoculum bactérien (2 x 107 UFC).
      REMARQUE: Des volumes plus élevés ou une instillation plus rapide peuvent provoquer un reflux dans les reins. Pendant la pratique de la technique, l’encre bleue peut être utilisée pour évaluer le reflux.
    6. Après l’instillation, maintenez la seringue et le cathéter en place pendant quelques secondes de plus, puis rétractez-vous lentement pour éviter les fuites. Enregistrez toute irrégularité telle qu’une grande quantité de fuite ou un méat sanglant et excluez les animaux, si nécessaire.
    7. Placer l’animal en position couchée au niveau du cône nasal de la chambre d’imagerie et répéter les étapes précédentes 2.1.1-2.1.6 pour tous les animaux restants. Utilisez un cathéter par groupe expérimental. Assurez-vous que l’anesthésie se poursuit et minimisez le temps entre le premier et le dernier animal.
    8. Si nécessaire, administrer des antibiotiques ou des médicaments expérimentaux, avant ou après l’imagerie (étape 3). Par exemple, pour administrer l’enrofloxacine, ajouter 40 μL de la solution d’enrofloxacine (100 mg/mL) à 3,96 mL de solution saline physiologique pour obtenir une dilution de 1/100. Injecter 100 μL/10 g par voie sous-cutanée à 9 h et 17 h pour administrer 10 mg/kg d’enrofloxacine deux fois par jour pendant 3 jours.

3. Imagerie par bioluminescence

  1. Préparation et sélection des paramètres d’imagerie
    1. Ouvrez le logiciel d’acquisition BLI (voir Table des matériaux)et cliquez sur Initialiser dans le dispositif d’imagerie (voir Tableau des matériaux)pour tester la caméra et le système de contrôleur de scène et refroidir la caméra CCD à -90 °C.
      REMARQUE: Au cours de ce processus, la porte est verrouillée et la progression de l’initialisation peut être suivie sur le panneau de commande. Un voyant vert indique que la température de -90 °C est atteinte. Un avertissement s’affiche si une tentative d’imagerie est effectuée avant la fin de l’initialisation.
    2. Assurez-vous que les données sont enregistrées automatiquement: Cliquez sur acquisition Enregistrement automatique dans et sélectionnez le bon dossier.
    3. Sélectionnez Luminescence et Photographie. Vérifiez les paramètres de luminescence par défaut : Réglez le filtre d’excitation sur Bloquer et le filtre d’émission sur Ouvrir.
    4. Réglez le temps d’exposition sur Auto lors de la prise de la première image, en particulier lorsque vous attendez un signal faible pour assurer un nombre adéquat de photons. Pour les mesures in vivo et les signaux lumineux, réglez le temps d’exposition sur ~30 s. Si l’image est saturée, un avertissement s’affiche. Si cela se produit, réduisez le temps d’exposition.
    5. Sélectionnez le support Binning, F/stop 1 et choisissez le bon champ de vision(FOV)(D pour 5 animaux).
    6. Réglez la hauteur du sujet sur 1 cm lors de l’imagerie de souris.
    7. Cliquez sur Ajouter trois fois dans le Panneau de configuration d’acquisition pour obtenir une séquence de trois images, en tant que répliques techniques.
  2. Imagerie
    1. Placez les souris dans la chambre d’imagerie en position couchée et utilisez le cône de nez collecteur pour maintenir l’anesthésie (isoflurane 1,5%) tout au long de l’expérience. Imagez jusqu’à 5 souris simultanément et séparez les animaux à l’aide du déflecteur de lumière pour empêcher la réflexion.
    2. Fermez la porte et cliquez sur Acquérir pour démarrer la séquence d’imagerie.
    3. Remplissez des informations détaillées sur l’expérience (types sauvages et animaux knock-out, traitements, jour d’imagerie, etc.). Les paramètres d’imagerie, tels que le temps d’exposition, sont enregistrés automatiquement.
    4. Retirez les souris de la chambre d’imagerie et retournez-les dans leur cage. Vérifiez la récupération complète après l’anesthésie. En quelques minutes, les animaux devraient être complètement éveillés et explorateurs. Ne fournissez pas d’analgésie car cela pourrait interférer avec le cours d’infection urinaire18.
    5. Retournez les cages dans les racks ventilés jusqu’au prochain cycle d’imagerie. Une fois l’expérience terminée, euthanasier les animaux par asphyxie au CO2 ou luxation cervicale. Faites-le avant la récupération de l’anesthésie à l’isoflurane pour minimiser la détresse.
  3. Analyse des images
    1. Démarrez le logiciel d’imagerie et chargez le fichier expérimental en cliquant sur Parcourir.
    2. Utilisez la palette d’outils pour ajuster l’échelle de couleurs de l’image. Standardisez l’aspect visuel des résultats en utilisant les mêmes réglages pour toutes les images, c’est-à-dire utiliser une échelle logarithmique avec un minimum de 104 à un maximum de 107 photons. Ces ajustements n’affectent pas les données brutes mais uniquement la présentation graphique.
    3. Utilisez les outils de retour sur investissement pour dessiner une région d’intérêt (ROI) sur l’image. Assurez-vous que le retour sur investissement est suffisamment important pour couvrir toute la zone et utilisez les mêmes dimensions pour toutes les images. Ici, un ROI carré de 3,5 cm x 4,5 cm a été placé sur le bas-ventre.
    4. Cliquez sur mesure du ROI pour quantifier l’intensité lumineuse (nombre ou flux total de photons). Exportez ces données et utilisez la moyenne des répliques techniques.
      REMARQUE: Les comptages représentent le nombre de photons détectés par la caméra et ne doivent être utilisés que pour le contrôle de la qualité de l’image. Pour générer des données, utilisez le flux total de photons. Le flux total de photons est plus pertinent physiologiquement car il représente la lumière émise par la surface et il s’agit d’une unité calibrée, qui est corrigée pour le temps d’exposition (par seconde).

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Résultats

In vivo BLI est en corrélation avec l’UFC de l’inoculum au moment de l’instillation.
Pour évaluer la limite de détection de BLI in vivo et la corrélation avec l’UFC de l’inoculum, des souris ont été infectées par différentes concentrations d’UTI89-lux et de PBS comme témoin négatif. Avant l’instillation, les animaux non infectés ont été scannés pour déterminer la luminescence de fond. Les images suivantes ont été obtenues immédiatement après l’instillation ...

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Discussion

Avantages de BLI par rapport au nombre d’UFC
Données longitudinales
Un inconvénient majeur de la méthode traditionnelle de comptage de l’UFC pour quantifier la charge microbienne est l’exigence d’homogénats d’organes post-mortem, ne fournissant qu’un seul point de données transversale par animal. Inversement, BLI permet un suivi longitudinal non invasif des animaux infectés. Les animaux peuvent être photographiés 2 à 3 fois par jour, fournissant un aperçu détaillé de la cinétique de l’infe...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation pour la recherche - Flandre (FWO Vlaanderen; G0A6113N), le Conseil de recherche de la KU Leuven (C1-TRPLe; T.V. et W.E.) et le VIB (à la télévision). W.E. est chercheur clinique senior de la Research Foundation - Flanders (FWO Vlaanderen). La souche UTI89-lux était un don généreux du laboratoire du professeur Seed13.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaque en polystyrène noir à fond plat 96 puitsCorning3925pour l’imagerie in vitro
Tondeuse à cheveux Aesculap ISISAesculapGT421, avec capuchon GT608
Vaporisateur d’anesthésieHarvard apparatus limitedN/Ahttps://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mLBayerN/AEnrofloxacine
BD Insyte Autoguard 24 GABD382912Angiocathéter jaune, utiliser un embout en plastique stérile pour l’instillation
souris C57Bl/6J JanvierN/A
Centrifuge 5804REppendorfEP022628146
Dropsense 16Unchained LabsTrineanpour mesurer OD 600nm
Phosphate de Dulbecco tamponné Solution saline, GibcoThermoFisher ScientificREF 14040-083
Éthanol 70 % dénaturé 5LVWR international85825360
Falcon 14ml Tube en polystyrène à fond rond, Snap-CapCorning352057
Falcon 50mlcellstart Greiner227285
Hamilton Seringue GASTIGHT, PTFE luer lock, 100 µ ; LSigma-Aldrich26203pour assurer une instillation bactérienne lente de 50 & micro ; L
Boucle d’inoculationRoth6174.1support : Art. N° 6189.1
Iso-Vet 1000mg/gDechra Produits vétérinairesN/AIsoflurane
IVIS Spectrum Système d’imagerie in vivoPerkinElmerREF 124262dispositif d’imagerie
Kanamycine solution 50 mg/mLSigma-AldrichCAS 25389-94-0
Logiciel d’imagerie vivantePerkinElmerN/ALogiciel d’acquisition BLI, version 4.7.3
Luria Bouillon BertaniSigma-AldrichREF L3022peut également être préparé
Bouillon Luria Bertani avec géloseSigma-AldrichREF L2897peut également être préparé Boîte
Pétri Sterilin 90mmThermoFisher Scientific101VR20à remplir avec LB Gélose complétée par Km
Pyrex Flacon de culture 250 mLSigma-AldrichSLW1141/08-20EA
Diapositive 200 TrineanUnchained Labs701-2007pour mesurer OD 600nm
UTI89-luxN/AN/ADON GÉNÉREUX DU Prof.
Seed VortexVWR international444-1372
de

Références

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