Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo répétée chez des souris éveillées

8.5K vues

⸱

DOI :

10.3791/62633

⸱

22 juin 2021

 ,  , 
1Department of Neurological Sciences, University of Nebraska Medical Center

Dans cet article

Résumé

Présenté ici est un protocole pour l’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour l’imagerie longitudinale des cellules du cerveau chez des souris éveillées et retenues par la tête.

Résumé

Pour bien comprendre la physiologie cellulaire des neurones et de la glie chez les animaux qui se comportent, il est nécessaire de visualiser leur morphologie et d’enregistrer leur activité in vivo chez les souris qui se comportent. Cet article décrit une méthode d’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour permettre l’imagerie longitudinale des cellules cérébrales chez des souris éveillées et retenues par la tête. En combinaison avec des stratégies génétiques et des injections virales, il est possible de marquer des cellules et des régions d’intérêt spécifiques avec des marqueurs structurels ou physiologiques. Ce protocole montre comment combiner des injections virales pour marquer les neurones à proximité des astrocytes exprimant GCaMP6 dans le cortex pour l’imagerie simultanée des deux cellules à travers une fenêtre crânienne. L’imagerie multiphotonique des mêmes cellules peut être effectuée pendant des jours, des semaines ou des mois chez des animaux éveillés et se comportant. Cette approche fournit aux chercheurs une méthode pour visualiser la dynamique cellulaire en temps réel et peut être appliquée pour répondre à un certain nombre de questions en neurosciences.

Introduction

La capacité d’effectuer une microscopie à fluorescence multiphotonique in vivo dans le cortex de souris est primordiale pour l’étude de la signalisation cellulaire et de la structure 1,2,3,4,5,6,7,8,9, de la pathologie de la maladie 10,11 et du développement cellulaire12,13 . Avec l’implantation de fenêtres crâniennes chroniques, l’imagerie longitudinale est possible, permettant une imagerie répétée des zones corticales pendant des jours, des semaines oudes mois 13,14 chez des animaux vivants. La microscopie multiphotonique est idéale pour l’imagerie in vivo et répétée en raison de l’amélioration du sondage en profondeur et de la réduction des photodommages associés au laser infrarouge utilisé. Cela permet d’étudier la dynamique moléculaire et cellulaire de cellules spécifiques dans diverses régions corticales.

La microscopie multiphotonique a été utilisée pour l’imagerie in vivo de cellules neuronales et gliales chez des souris 15,16,17,18,19,20. Diverses stratégies peuvent être mises en œuvre pour étiqueter des types de cellules et des domaines d’intérêt particuliers. Une approche courante consiste à stimuler l’expression de protéines fluorescentes génétiquement codées d’une manière spécifique à la cellule en utilisant le système de recombinaison Cre-Lox. Cela peut être effectué avec des souris génétiquement modifiées, par exemple en croisant une souris tdTomato « floxed » (Ai14) avec une souris exprimant la Cre-recombinase sous un promoteur d’intérêt21. Alternativement, le marquage spécifique aux cellules et au site peut être réalisé avec des injections virales. Ici, un virus codant pour la Cre recombinase sous un promoteur spécifique à la cellule et un virus codant pour un gène floxé d’intérêt sont injectés dans une région définie. Les types de cellules appropriés recevant les deux vecteurs viraux exprimeront alors le(s) gène(s) souhaité(s). Ces gènes peuvent être des marqueurs structurels, tels que tdTomato, pour visualiser les changements dans la morphologie cellulaire22 ou des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), tels que GCaMP et / ou RCaMP, pour examiner la dynamiquedu calcium 23. Les méthodes de recombinaison génétique peuvent être appliquées individuellement ou en combinaison pour marquer un ou plusieurs types de cellules. Une troisième approche, ne nécessitant pas de souris transgéniques ou de constructions virales (qui ont une capacité d’emballage limitée), consiste à électroporation in utero des constructions d’ADN24. Selon le moment de l’électroporation, différents types de cellules peuvent être ciblés 25,26,27.

Lors de l’imagerie multiphotonique, les souris peuvent être imagées alors qu’elles sont éveillées ou anesthésiées. L’imagerie des souris éveillées peut être réalisée en sécurisant la souris via une plaque de tête attachée28. Cette approche est rendue moins stressante en permettant un mouvement relativement libre de l’animal à l’aide de méthodes, telles que des balles en polystyrène flottant librement et soutenues par air29, des tapis roulants flottantlibrement 1 ou un système de cage domestique soulevé par air où les souris sont fixées par une plaque de tête attachée et autorisées à se déplacer dans une chambre ouverte30. Pour chacune de ces conditions d’imagerie, il sera d’abord nécessaire d’habituer les souris à la configuration d’imagerie. Cet article décrit la procédure d’accoutumance et d’imagerie à l’aide d’un système de cage domestique soulevé par air.

Ce protocole décrit l’implantation d’une fenêtre crânienne chronique pour l’imagerie longitudinale in vivo dans le cortex. Ici, nous utiliserons des souris qui expriment conditionnellement GCaMP6f dans les astrocytes pour surveiller la dynamique de signalisation du calcium. En outre, cet article décrit la procédure pour les injections virales en utilisant tdTomato comme étiquette pour les neurones. Cela permet de déterminer les changements dans la structure synaptique neuronale et / ou la disponibilité en tant que marqueur structurel permettant l’imagerie répétée du même astrocyte. Tout au long du protocole, des étapes cruciales seront mises en évidence pour assurer la meilleure qualité possible des images obtenues à partir de la microscopie multiphotonique.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives approuvées par l’IACUC au Centre médical de l’Université du Nebraska.

1. Avant la chirurgie

  1. Préparez des pipettes pour les injections virales. Tirez les capillaires en verre borosilicate à l’aide d’un extracteur de pipette et biseautez la pipette à un angle de 20°. Stériliser les pipettes pendant la nuit.
  2. Préparez des morceaux frais de mousse de gel stérile en les coupant en petits carrés. Immergez la mousse de gel dans un tube de microfuge stérile contenant 0,5 mL de solution saline. Faire tremper la mousse de gel dans une solution saline pendant au moins 30 minutes avant utilisation.
  3. Préparez des morceaux frais de lanières d’éponge en les coupant en fines lanières.
  4. Vingt minutes avant la chirurgie, injecter par voie intrapéritonéale de 4 à 6 semaines de GLAST-CreER/GCaMP6f des souris de 0,2 mg/kg de dexaméthasone pour prévenir l’enflure du cerveau et 5 mg/kg de carprofène pour réduire l’inflammation.
    REMARQUE: Pour induire la recombinaison et l’expression de GCaMP6f dans environ 40% des astrocytes, des souris GLAST-CreER / GCaMP6f ont été injectées avec 100 mg / kg de tamoxifène à 3 semaines pendant 5 jours consécutifs.

2. Début de la chirurgie

  1. Après 20 min, anesthésier les souris avec 3% d’isoflurane avec de l’oxygène à un débit de 1 L/min pendant environ 1,5 min.
  2. Une fois anesthésiée, placez la souris sur un cadre stéréotaxique qui repose sur une couverture de recirculation d’eau pour maintenir une température corporelle de 37 ° C tout au long de la chirurgie. Fixez la souris au cadre à l’aide de la pince à museau et des barres d’oreille. Assurez-vous que la pince à museau et les barres d’oreille sont suffisamment stables pour que la tête ne bouge pas pendant la procédure, mais pas si serrées que le crâne soit endommagé.
  3. Maintenir l’anesthésie avec 1-1,5% d’isoflurane avec de l’oxygène à un débit de 1-2 L / min. Notez que certains animaux peuvent avoir besoin de plus ou moins d’isoflurane pour maintenir la sédation. Surveillez la respiration de l’animal ainsi que ses réflexes aux pincements des orteils et de la queue, et ajustez l’isoflurane de manière appropriée.
  4. Appliquez une pommade pour les yeux sur chaque œil à l’aide d’un applicateur à pointe de coton pour empêcher les yeux de se dessécher pendant la procédure.
  5. À l’aide de coupe-rongeurs, rasez les cheveux du cou jusqu’au-delà des yeux. Soyez prudent pour vous assurer que les moustaches de l’animal ne sont pas coupées accidentellement.
  6. Nettoyez la zone rasée avec un tampon de préparation à l’iode, suivi d’un tampon de préparation à l’alcool.
  7. À l’aide de pinces en tissu stérile et de ciseaux chirurgicaux, coupez et retirez la peau des sutures frontales antérieures à la bregma jusqu’au lambda.
  8. Une fois la peau enlevée, ajoutez environ 0,1 mL de xylocaïne à 1 % (lidocaïne avec épinéphrine 1:200 000) au crâne pour minimiser les saignements du crâne.
  9. À l’aide d’une lame chirurgicale stérile en acier au carbone de taille 11 attachée à un manche, grattez doucement le tissu conjonctif du crâne. Prenez des précautions supplémentaires lorsque vous retirez le tissu conjonctif près du bord du crâne, car tout tissu restant pourrait empêcher une forte adhérence du verre ou de la plaque de tête plus tard.
  10. Utilisez des pinces à tissu stérile pour enlever le tissu conjonctif lâche du crâne.
  11. À l’aide d’applicateurs de pointe en coton stériles, nettoyez toute xylocaïne restante du crâne.
  12. Une fois terminé, dégraissez soigneusement le crâne à l’aide d’un applicateur stérile à pointe de coton trempé dans de l’acétone. Utilisez de l’air comprimé pour sécher immédiatement le crâne.

3. Craniotomie

  1. À l’aide d’un marqueur de point fin et d’une règle, mesurez la taille appropriée pour l’ouverture à l’emplacement souhaité. Confirmer la taille de l’ouverture en la comparant à la taille du verre de couverture (3 ou 5 mm de diamètre); assurez-vous que l’ouverture est légèrement plus petite que la taille du verre de couverture.
  2. À l’aide d’une perceuse dentaire, tracez progressivement le contour de l’ouverture, en amincissant l’os. Percez lentement pour éviter de percer l’os et percez en cercles concentriques pour faciliter même l’amincissement de l’os.
  3. Après chaque passage concentrique, ajoutez une goutte ou deux de solution saline stérile à la zone percée. Laissez la solution saline reposer pendant au moins 10 s pour empêcher l’os de surchauffer et d’endommager la dure-mère sous-jacente.
  4. Utilisez un applicateur de pointe en coton stérile pour absorber toute solution saline restante. Soufflez de l’air comprimé sur la zone pour vous assurer que toute la solution saline restante s’est évaporée avant de reprendre le forage. Faites-le pour souffler les débris osseux qui restent.
  5. Répétez les étapes 3.2 à 3.4 jusqu’à ce que l’os soit correctement aminci pour être enlevé.
  6. Assurez-vous que l’os est correctement aminci pour être retiré en poussant doucement sur la zone centrale de l’os avec une pince fine pour vérifier que le crâne aminci bouge. La vascularisation sous-jacente doit être visible à l’endroit où le forage a eu lieu. Observez que l’os peut sembler se fissurer là où l’amincissement s’est produit.
    REMARQUE: L’entraînement à ce stade est crucial pour identifier quand l’os a été aminci de manière appropriée.
  7. Avant d’essayer de retirer l’os, vérifiez la souris pour vous assurer qu’elle est complètement sous sédation. Sinon, augmentez progressivement l’entretien de l’isoflurane pour prévenir l’enflure du cerveau lors de l’ablation de l’os.
  8. Ajouter un petit morceau de mousse de gel saturé de solution saline au crâne aminci. Ajouter une ou deux gouttes supplémentaires de solution saline au crâne aminci.
    REMARQUE: Avoir beaucoup de solution saline sur le crâne aminci aide à réduire les saignements et à protéger la dure-mère lors du retrait du lambeau osseux.
  9. À l’aide d’une lame miniature pointue à 15°, insérez soigneusement la lame dans l’os aminci et coupez-la le long de l’os aminci. Gardez la mousse de gel imbibée de solution saline, prête à arrêter les saignements qui peuvent survenir.
  10. À l’aide d’une pince, soulevez et retirez soigneusement l’os. Soyez aussi doux que possible pour éviter d’endommager les tissus et le système vasculaire sous-jacents. Prenez un soin extrême à ne pas endommager la dure-mère.
  11. Une fois le lambeau osseux retiré, ajoutez un morceau frais de mousse de gel saturé de solution saline au cortex. Ajoutez quelques gouttes de solution saline pour empêcher la mousse de gel de se dessécher, car cela endommagerait le tissu sous-jacent.

4. Injections virales

  1. Effectuer des injections virales à l’aide d’un appareil stéréotaxique.
    1. Préparez AAV1. CaMKII.0.4.Cre (titre de 3 × 1013 copies du génome (GC)/mL) à 1:5 000 par dilutions en série dans une solution saline.
    2. Préparez le mélange d’AAV1. CaMKII.0.4.Cre (1:5 000) et AAV1. CAG. FLEX.tdTomato (titre de 5 × 1012 GC/mL) sur un petit morceau de parafilm.
    3. Remplissez une pipette en verre biseauté stérile d’une taille de pointe de 20 μm avec le mélange de virus en plaçant doucement la pipette sur la solution.
    4. Abaissez la pipette de sorte qu’elle touche simplement la surface du cerveau et continuez à baisser pendant 200 à 300 μm supplémentaires pour les injections de L2/3. À l’aide d’un système de distribution de micro-injection intracellulaire (voir le tableau des matériaux), injectez sous pression 12 à 15 fois sur 2 min (20 psi, durée d’impulsion de 9 ms). Observez le ménisque dans la pipette tomber à chaque injection pour s’assurer que la pipette n’est pas bloquée.
    5. Une fois injecté, laissez la pipette dans le cerveau pendant 4 à 5 minutes pour éviter tout reflux. Rétractez lentement la pipette.
    6. Répétez les injections à 2-3 sites (à environ 500 μm d’intervalle).
    7. Jetez les pipettes en verre, le parafilm, les embouts de pipette et les tubes de microfuge utilisés pour les dilutions en série du virus Cre dans de l’eau de Javel à 10%.

5. Implantation de la fenêtre crânienne

  1. Retirez toute mousse de gel et utilisez une petite bande de bandes d’éponge pour absorber toute solution saline restante.
  2. Ajouter quelques gouttes de l’antibiotique enrofloxacine (22,7 μg/mL) à l’ouverture et laisser y rester pendant 1 min. Après 1 min, utilisez un morceau frais de bande d’éponge pour absorber l’enrofloxacine restante. Répétez ce processus deux fois de plus.
  3. Après le troisième lavage, ajoutez quelques gouttes de solution saline à l’ouverture et laissez-la y rester pendant 1 min. Après 1 min, utilisez un morceau frais de bande d’éponge pour absorber toute solution saline restante. Répétez ce processus de lavage deux fois de plus et après le troisième lavage, ajoutez une petite goutte de solution saline à l’ouverture.
  4. Placez le verre de couverture sur l’ouverture. Utilisez des pinces pour vous assurer que le verre est affleurant sur l’ouverture afin d’obtenir des images de bonne qualité.
  5. Tout en maintenant doucement le verre en place, appliquez un gel adhésif cyanoacrylate (Table des matériaux) autour du périmètre du verre pour sceller les bords de la fenêtre au crâne. Assurez-vous de ne pas laisser la colle s’infiltrer sous le verre de couverture et gardez autant de colle que possible sur la surface du verre de couverture.
  6. Appliquez une couche de super colle sur le gel adhésif. Ajouter une couche de liquide de ciment dentaire sur la colle pour lui permettre de durcir.
  7. Prenez une plaque de tête de type hélicoptère de taille appropriée et appliquez une fine couche de colle autour de l’ouverture centrale. Placez la plaque de tête sur le verre de couverture et laissez la colle sécher brièvement.
  8. Dans un tube de microfuge de 1,5 mL, ajouter de la poudre de ciment dentaire à la marque de 0,1 mL sur le tube. Ajouter 7 à 8 gouttes d’adhésif instantané à durcissement rapide et mélanger. Aspirer dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 19 G qui a été coupée pour créer une plus grande ouverture.
  9. Injecter le mélange à travers les trous latéraux de la barre de l’hélicoptère jusqu’à ce qu’il s’infiltre de chaque côté. Appliquez le mélange de ciment dentaire et d’adhésif sur le reste du crâne exposé pour fixer la plaque frontale au crâne, ce qui réduira les artefacts de mouvement pendant l’imagerie.
  10. Laisser sécher le mélange à l’air libre pendant au moins 15 min.
  11. Injecter à la souris 0,5 mL de solution saline par voie sous-cutanée pour aider à la récupération.

6. Après l’opération

  1. Retirez la souris du cadre stéréotaxique et retournez-la dans sa cage.
  2. Placez une partie de la cage sur une couverture de recirculation d’eau, des coussins chauffants en gel d’espace ou des coussinets isothermes pour aider à la récupération.
  3. Fournissez à l’animal une petite aide de granulés alimentaires et de nourriture humide, en plus de son régime alimentaire régulier, pour aider davantage à la récupération. Ajoutez de nouveaux granulés alimentaires et des aliments humides chaque jour après la chirurgie pendant toute la durée de la récupération.
  4. Le lendemain de la chirurgie, injectez une fois aux souris 5 mg / kg de carprofène et 5 mg / kg d’enrofloxacine.
  5. Aux jours 2 à 6, injecter aux souris une fois 5 mg/kg de carprofène et deux fois 5 mg/kg d’enrofloxacine, en attendant l’approbation de l’IACUC local. Séparer les injections d’enrofloxacine d’au moins 8 h.
  6. Les jours 7 à 20, injecter quotidiennement aux souris 5 mg / kg de carprofène.

7. Habituation des animaux pour l’imagerie

  1. Le jour 14 après la chirurgie, examinez la fenêtre crânienne pour la clarté optique. N’utilisez pas de souris dont les fenêtres ne sont pas claires ou autrement endommagées (c.-à-d. angiogenèse excessive).
  2. Vérifiez l’expression de tdTomato au microscope à fluorescence. Si des cellules marquées peuvent être identifiées, procédez à l’accoutumance animale.
  3. Premier jour d’accoutumance (manipulation)
    1. Tenez la souris pendant quelques minutes et retournez-la dans sa cage après l’avoir manipulée. Répétez la manipulation trois fois avec un intervalle de 15 minutes entre les séances.
    2. Après le troisième essai, habituez la souris en l’enveloppant dans un petit morceau de tissu.
    3. Tenez la souris enveloppée dans un chiffon pendant environ 1 min.
    4. Après l’essai, ramenez la souris dans sa cage. Répétez ce processus deux fois de plus, en permettant un intervalle de 15 minutes entre chaque essai.
  4. Deuxième jour d’accoutumance
    1. Pesez et enregistrez le poids de la souris.
    2. Enveloppez la souris dans un chiffon et fixez-la via sa plaque de tête au bras de fixation de la tête de la cage domestique soulevée par air.
    3. Laissez la cage de la maison exposée à la lumière.
    4. Laissez la souris rester sécurisée dans la cage du mobil-home pendant 15 min.
    5. Après l’accoutumance, retirez la souris de la cage de la maison et éteignez le flux d’air.
    6. Pesez la souris et retournez-la dans sa cage. Prenez soin de n’inclure que les souris qui ne perdent pas plus de 10% de leur poids corporel. Exclure les souris qui perdent plus de 10% de leur poids au cours de n’importe quelle journée d’accoutumance des expériences d’imagerie.
  5. Troisième jour d’accoutumance et au-delà
    1. Pesez et enregistrez le poids de la souris avant de la fixer à la cage domestique soulevée par air.
    2. Fixez la souris à la cage de la maison soulevée par air.
    3. Couvrez la cage de la maison avec quelque chose qui fournira un intérieur sombre, comme une boîte, et laissez la souris rester sécurisée pendant 30 minutes.
    4. Après 30 minutes, découvrez la cage de la maison, retirez la souris et coupez le flux d’air.
    5. Pesez et enregistrez le poids de la souris après l’accoutumance.
    6. Répétez ce processus tous les jours, en augmentant de 15 minutes la durée pendant laquelle la souris est fixée à la cage de la maison. Continuez ce processus jusqu’à ce que la souris puisse être fixée à la cage domestique pendant 1,5 h, car il s’agit de la durée approximative d’une séance d’imagerie à deux photons.
    7. Pour habituer la souris au bruit, effectuez quelques séances d’accoutumance sur le microscope pour acclimater la souris aux sons des miroirs à balayage laser. Exclure les souris qui ne s’habituent pas suffisamment (c.-à-d. vocalisations et défécation induite par le stress).

8. Imagerie multiphotonique

  1. Commencez l’imagerie 3 semaines après la chirurgie pour permettre à la fenêtre de se dégager.
  2. Effectuez des images sur un microscope multiphoton sur mesure ou disponible dans le commerce équipé d’un laser Ti:Sapphire. Acquérir des images à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’eau à grande ouverture numérique (NA).
    REMARQUE: L’imagerie à deux canaux est obtenue à l’aide d’un miroir dichroïque de 565 nm et de deux tubes photomultiplicateurs externes. Un filtre passe-bande 535/50 est utilisé pour détecter les émissions GCaMP6f, et un filtre passe-bande 610/75 est utilisé pour détecter tdTomato. Un objectif d’immersion dans l’eau 25x (1,05 NA) et des scanners résonants ont été utilisés pour acquérir les images illustrées aux figures 1 et 2. Chaque région d’intérêt consistait en une pile d’images séparées axialement par 1 μm. Chaque section optique a été collectée à 512 x 512 pixels, 0,18 μm/pixel. Les images ont été acquises à partir de la région du membre antérieur du cortex moteur primaire déterminée par les coordonnées stéréotaxiques.
  3. Réglez la longueur d’onde du laser à 920 nm (990 nm si un GECI décalé vers le rouge est utilisé).
  4. Placez la souris sur la cage de la maison mobile et fixez la plaque frontale au bras de fixation de la tête.
  5. Ajoutez quelques gouttes d’eau au centre de la fenêtre.
  6. En utilisant le mode grand champ du microscope, sélectionnez 2-3 positions de vascularisation facilement identifiable. Enregistrez les images de ces vaisseaux sanguins et enregistrez les coordonnées X et Y qui apparaissent sur le contrôleur moteur pour déplacer les dendrites marquées tdTomato pour les séances d’imagerie ultérieures. Ajustez les coordonnées X et Y à chaque fois pour les réaligner avec les images enregistrées des vaisseaux sanguins.
  7. Une fois la vascularisation imagée et les positions enregistrées, localisez les régions avec des neurones exprimant tdTomato (Figure 1). Image des structures synaptiques (dendrites et axones) des neurones et de l’activité de GCaMP6f dans les astrocytes.
    REMARQUE: Les dendrites serviront de repères pour revenir de manière fiable dans les mêmes régions et imager les mêmes dendrites et astrocytes sur des jours répétés. Aucun décalage détectable dans le plan d’imagerie n’a été observé avec une fixation stable de la tête et après accoutumance à la fixation de la tête. Le déplacement qui se produit dans les directions X et Y est corrigé du mouvement.
  8. Après l’imagerie, ramenez la souris dans sa cage.
    REMARQUE: Les souris sont généralement maintenues sur la portée pendant un maximum de 2 h. Lorsque l’imagerie dure longtemps, l’eau sous l’objectif peut sécher. De l’eau doit être ajoutée pendant les expériences. Alternativement, un gel à ultrasons peut être utilisé à la place de l’eau.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

La qualité de la fenêtre crânienne peut être évaluée par la netteté des structures neuronales. Dans une bonne fenêtre, les épines dendritiques sont clairement visibles (Figure 1). Une fois les données structurelles et de position stockées, le même animal peut être imagé à plusieurs reprises pendant des jours, des semaines ou des mois pour examiner les mêmes cellules (Figure 1). Les images de la figure 1 ont été obtenues à partir de ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

Ici, nous avons présenté un protocole pour l’implantation de fenêtres crâniennes chroniques pour l’imagerie in vivo d’astrocytes corticaux et de neurones chez des souris éveillées et retenues sur une cage domestique soulevée par air. Des exemples spécifiques ont été fournis de l’application de la fenêtre crânienne pour l’imagerie des astrocytes qui expriment les GECI et les structures synaptiques neuronales. Avec l’utilisation de la microscopie multiphotonique, la dynamique de signalisation du calcium astrocytai...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
15o Lame pointueSurgistar6500Outils chirurgicaux
19 g AiguillesBD305186Fournitures de chirurgie
AAV1-CAG-FLEX-tdTomatoAddgene28306-AAV1Vecteur viral
AAV1-CaMKII-0-4-CreAddgene105558-AAV1Vecteur viral
ActeoneFisher ScientificA16P4Réactif
Alcool Préparation TamponsFisher ScientificCovidien 5750Alimentation chirurgicale
BiseauteurNarishige
Équipement Verre borosilicatéWorld Precision InstrumentsTW100F-4Alimentation chirurgicale
Fraises carbure SSWhite Dental14717Outils chirurgicaux
Carprofène (Rimadyl), 50 mg/mLZoetis Mylan Institutional, LLC.Drug
Compressed AirFisher Scientific23-022-523Approvisionnement chirurgical
Applicateurs d’embout en cotonPuritan836-WC NO BINDERd’approvisionnement chirurgical
n° 1 épaisseur, 3 mm/5 mmWarner Instruments64-0720, 64-0700Approvisionnement chirurgical
Foret dentaireÉquipement d’aseptique
Dexaméthasone, 4 mg/mLMylan Institutional, LLC.
Microscope de dissection deNikonEquipment
Duralay Liquid  ; (ciment dentaire liquide)Patterson Dental602-8518Réactif
Duralay Poudre  ; (poudre de ciment dentaire)Patterson Dental602-7932Réactif
Enrofloxacine, 2,27 %BayerDrug
Pommade pour les yeuxDechra17033-211-38Alimentation chirurgicale
Fiber Lite Illuminateur à haute intensitéDolan-Jenner Industries
Équipement Pinces (grande)World Precision Instruments14099Outils chirurgicaux
Pinces ( Small)World Precision Instruments501764Surgery Tools
GCaMP6f B6 ; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/JThe Jackson Laboratory N° de stock : 024105Ligne de souris
GerminatorFisher ScientificEquipment
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/JThe Jackson LaboratoryN° de stock : 012586Mouse Line
Plaque de têteNeurotarModèle 1, Modèle 3Alimentation Chirurgie
Pince hémostatiqueWorld Precision Instruments501705Porte-outils chirurgicaux
pour 15o lame pointueWorld Precision Instruments 501247Porte-outils chirurgicaux
pour lames de scalpelWorld Precision Instruments500236Outils
Tampons de préparation à l’iodeAvantor15648-926Approvisionnement chirurgical
IsofluranePiramalApprovisionnement chirurgical
Système de table Isoflurane avec boîte à inductionÉquipement d’appareilHarvard
Vaporisateur d’isoflurane ÉquipementSurgiVet
Colle Krazy Dépôtde bureauKG517Réactif
Loctite 401Henkel40140adhésif instantané à durcissement rapide
Loctite 454Fisher ScientificNC9194415gel adhésif cyanoacrylate
Extracteur de micropipetted’instrumentsSutter
Équipement de microscope
AzoteMathesonNI M200
Gaz OxygèneMathesonOX M250Gas
PicospritzerParkersystème de distribution de micro-injection intracellulaire
Pointes de pipetteRainin17014340Fournitures de chirurgie
Tondeuse à poils de rongeursWahlÉquipement
Saline (chlorure de sodium à 0,9 %)Med Vet InternationalRX0.9NACL-30BACFournitures
de chirurgie Lames de scalpel, taille 11Integra4-111Outils chirurgicaux
CiseauxWorld Precision Instruments503667Outils chirurgicaux Instruments
stéréotaxiquesÉquipement de stoelting
Sugi Sponge Strips (bandes d’éponge)Kettenbach Dental31002Surgical Supply
SURGIFOAM (mousse de gel)Ethicon1972Seringue d’approvisionnement chirurgical
avec aiguille de 26 gBD309625Surgery Supply
TamoxifèneSigma AldrichT5648-1GRéactif
Ti :Sapphire Laser CoherentEquipment Pipettes
transfertFisher Scientific13-711-9AMSurgery Supply
Couverture d’eauFisher ScientificEquipment
Xylocaïne MPF avec épinéphrine (1:200 000), 10 mg/ mLFresenius Kabi États-UnisMédicament
Verre de couverture , médicaments chirurgicaux Équipement multiphotoniquede

Références

  1. Cichon, J., Gan, W. B. Branch-specific dendritic Ca2+ spikes cause persistent synaptic plasticity. Nature. 520 (7546), 180-185 (2015).
  2. Goncalves, J. T., et al. Circuit level defects in the developing neocortex of Fragile X mice. Nature Neuroscience. 16 (7), 903-909 (2013).
  3. Padmashri, R., et al. Altered structural and functional synaptic plasticity with motor skill learning in a mouse model of fragile X syndrome. Journal of Neuroscience. 33 (50), 19715-19723 (2013).
  4. Peters, A. J., Chen, S. X., Komiyama, T. Emergence of reproducible spatiotemporal activity during motor learning. Nature. 510 (7504), 263-267 (2014).
  5. Poskanzer, K. E., Yuste, R. Astrocytes regulate cortical state switching in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), 2675-2684 (2016).
  6. Srinivasan, R., et al. Ca2+ signaling in astrocytes from Ip3r2(-/-) mice in brain slices and during startle responses in vivo. Nature Neuroscience. 18 (5), 708-717 (2015).
  7. Takata, N., et al. Astrocyte calcium signaling transforms cholinergic modulation to cortical plasticity in vivo. Journal of Neuroscience. 31 (49), 18155-18165 (2011).
  8. Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
  9. Zuo, Y., et al. Development of long-term dendritic spine stability in diverse regions of cerebral cortex. Neuron. 46 (2), 181-189 (2005).
  10. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  11. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742(2014).
  12. Cruz-Martin, A., Crespo, M., Portera-Cailliau, C. Delayed stabilization of dendritic spines in fragile X mice. Journal of Neuroscience. 30 (23), 7793-7803 (2010).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  15. Agarwal, A., et al. Transient opening of the mitochondrial permeability transition pore induces microdomain calcium transients in astrocyte processes. Neuron. 93 (3), 587-605 (2017).
  16. Bindocci, E., et al. Three-dimensional Ca2+ imaging advances understanding of astrocyte biology. Science. 356 (6339), (2017).
  17. Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
  18. Han, S., Yang, W., Yuste, R. Two-color volumetric imaging of neuronal activity of cortical columns. Cell Reports. 27 (7), 2229-2240 (2019).
  19. Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science. 308 (5726), 1314-1318 (2005).
  20. Stowell, R. D., et al. Noradrenergic signaling in the wakeful state inhibits microglial surveillance and synaptic plasticity in the mouse visual cortex. Nature Neuroscience. 22 (11), 1782-1792 (2019).
  21. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
  22. Chen, S. X., et al. Subtype-specific plasticity of inhibitory circuits in motor cortex during motor learning. Nature Neuroscience. 18 (8), 1109-1115 (2015).
  23. Stobart, J. L., et al. Cortical circuit activity evokes rapid astrocyte calcium signals on a similar timescale to neurons. Neuron. 98 (4), 726-735 (2018).
  24. Matsui, A., et al. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (54), e3024(2011).
  25. Roth, R. H., et al. Cortical synaptic AMPA receptor plasticity during motor learning. Neuron. 105 (5), 895-908 (2020).
  26. Stogsdill, J. A., et al. Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis. Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).
  27. Suresh, A., Dunaevsky, A. Relationship between synaptic AMPAR and spine dynamics: impairments in the FXS mouse. Cerebral Cortex. 27 (8), 4244-4256 (2017).
  28. Yang, G., et al. Transcranial two-photon imaging of synaptic structures in the cortex of awake head-restrained mice. Methods in Molecular Biology. 1010, 35-43 (2013).
  29. Dombeck, D. A., et al. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  30. Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: a new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (88), e51869(2014).
  31. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature Protocols. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  32. Hauglund, N. L., et al. Meningeal lymphangiogenesis and enhanced glymphatic activity in mice with chronically implanted EEG electrodes. Journal of Neuroscience. 40 (11), 2371-2380 (2020).
  33. De Paola, V., et al. Cell type-specific structural plasticity of axonal branches and boutons in the adult neocortex. Neuron. 49 (6), 861-875 (2006).
  34. Cheng, A., et al. Simultaneous two-photon calcium imaging at different depths with spatiotemporal multiplexing. Nature Methods. 8 (2), 139-142 (2011).
  35. Yang, G., et al. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).
  36. Shih, A. Y., et al. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (61), e3742(2012).
  37. Helm, P. J., Ottersen, O. P., Nase, G. Analysis of optical properties of the mouse cranium--implications for in vivo multi photon laser scanning microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 178 (2), 316-322 (2009).
  38. Stobart, J. L., et al. Long-term in vivo calcium imaging of astrocytes reveals distinct cellular compartment responses to sensory stimulation. Cerebral Cortex. 28 (1), 184-198 (2018).
  39. Pryazhnikov, E., et al. Longitudinal two-photon imaging in somatosensory cortex of behaving mice reveals dendritic spine formation enhancement by subchronic administration of low-dose ketamine. Scientific Reports. 8 (1), 6464(2018).
  40. Thrane, A. S., et al. General anesthesia selectively disrupts astrocyte calcium signaling in the awake mouse cortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (46), 18974-18979 (2012).
  41. Paukert, M., et al. Norepinephrine controls astroglial responsiveness to local circuit activity. Neuron. 82 (6), 1263-1270 (2014).
  42. Delekate, A., et al. Metabotropic P2Y1 receptor signalling mediates astrocytic hyperactivity in vivo in an Alzheimer's disease mouse model. Nature Communications. 5, 5422(2014).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Implantation d'une fenêtre crânienneimagerie de souris éveilléesimagerie multiphotoniquecontention de la têteinjections viralesastrocytes GCaMP6fstructure neuronaleimagerie calciqueanalyse comportementale
Implantation d’une fenêtre crânienne pour l’imagerie in vivo répétée chez des souris éveillées
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.