Article de méthode

Une méthode efficace pour l’induction de cellules dirigées de type hépatocytes à partir de cellules souches embryonnaires humaines

DOI :

10.3791/62654

⸱

6 mai 2021

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1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en cellules fonctionnelles de type hépatocytes (CHN) en complétant continuellement l’activine A et le CHIR99021 pendant la différenciation du CSEh en endoderme définitif (DE).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les fonctions potentielles des cellules de type hépatocytes (CHN) dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont très prometteuses pour les applications de modélisation des maladies et de dépistage des médicaments. Il est fourni ici une méthode efficace et reproductible pour différencier les CSEh en CSH fonctionnels. L’établissement d’une lignée endodermique est une étape clé dans la différenciation aux HLCs. Par notre méthode, nous régulons les voies de signalisation clés en complétant continuellement l’Activine A et le CHIR99021 lors de la différenciation hESC en endoderme définitif (DE), suivie de la génération de cellules progénitrices hépatiques, et enfin des CHN avec une morphologie hépatocytes typique dans une méthode par étapes avec des réactifs complètement définis. Les HNC dérivés du hESC produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques au stade (y compris l’albumine, le récepteur nucléaire HNF4α et le polypeptide de cotransport du taurocholate de sodium (NTCP)), et présentent des caractéristiques particulières liées aux hépatocytes matures et fonctionnels (y compris la coloration verte à l’indocyanine, le stockage du glycogène, la coloration à l’hématoxyline-éosine et l’activité CYP3), et peuvent fournir une plate-forme pour le développement d’applications à base de HLC dans l’étude des maladies du foie.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le foie est un organe hautement métabolique qui joue plusieurs rôles, notamment la désoxydation, le stockage du glycogène, la sécrétion et la synthèse des protéines1. Divers agents pathogènes, médicaments et hérédité peuvent provoquer des changements pathologiques dans le foie et affecter ses fonctions2,3. Les hépatocytes, en tant que principale unité fonctionnelle du foie, jouent un rôle important dans les systèmes artificiels de soutien du foie et l’élimination de la toxicité des médicaments. Cependant, la ressource en hépatocytes humains primaires est limitée dans la thérapie cellulaire, ainsi que dans la recherche sur les maladies du foie. Par conséquent, le développement de nouvelles sources d’hépatocytes humains fonctionnels est une direction de recherche importante dans le domaine de la médecine régénérative. Depuis 1998, date à laquelle les CSEh ont étéétablies, 4, les CSEh ont été largement prises en compte par les chercheurs en raison de leur potentiel de différenciation supérieur (ils peuvent se différencier en divers tissus dans un environnement approprié) et de leur haut degré d’autorenouvrabilité, et fournissent ainsi des cellules sources idéales pour les foies bioartificiels, la transplantation d’hépatocytes et même l’ingénierie tissulaire hépatique5.

Actuellement, l’efficacité de la différenciation hépatique peut être considérablement augmentée en enrichissant l’endoderme6. Dans la différenciation de la lignée des cellules souches en endoderme, les niveaux de la signalisation du facteur de croissance transformant β (TGF-β) et des voies de signalisation WNT sont les facteurs clés dans le nœud de l’étape de formation de l’endoderme. L’activation d’un haut niveau de signalisation TGF-β et WNT peut favoriser le développement de l’endoderme7,8. L’activine A est une cytokine appartenant à la superfamille TGF-β. Par conséquent, l’activine A est largement utilisée dans l’induction endodermique de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSCs) et decsh 9,10. GSK3 est une protéine kinase sérine-thréonine. Les chercheurs ont constaté que CHIR99021, un inhibiteur spécifique de GSK3β, peut stimuler les signaux WNT typiques, et peut promouvoir la différenciation des cellules souches dans certaines conditions, ce qui suggère que CHIR99021 a le potentiel d’induire la différenciation des cellules souches dans l’endoderme 11,12,13.

Ici nous rapportons une méthode efficace et reproductible pour induire efficacement la différenciation des cseh en HLCs fonctionnels. L’addition séquentielle de l’Activine A et du CHIR99021 a produit environ 89,7±0,8 % de cellules SOX17 (marqueur DE) positives. Après avoir été encore maturées in vitro,ces cellules ont exprimé des marqueurs spécifiques hépatiques et exercé hépatocytes-comme la morphologie (basée sur la souillure d’hématoxyline-éosine (H &E)) et les fonctions, telles que l’absorption du vert d’indocyanine (ICG), le stockage de glycogène et l’activité CYP3. Les résultats montrent que les CSEh peuvent être différenciés avec succès en CSH fonctionnels matures par cette méthode et peuvent fournir une base pour la recherche liée aux maladies du foie et le dépistage in vitro des médicaments.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Maintien des cellules souches

REMARQUE: Le protocole de maintenance cellulaire décrit ci-dessous s’applique à la lignée cellulaire hES03 maintenue dans une monocouche adhérente. Pour tous les protocoles suivants dans ce manuscrit, les cellules doivent être manipulées sous une armoire de sécurité biologique.

  1. Préparer 1x mTesR de milieu de culture de cellules souches en diluant 5x milieu supplémentaire au milieu de base mTesR.
  2. Préparer 30x milieu Matrigel qualifié hESC en diluant 5 mL de Matrigel qualifié hESC avec 5 mL de DMEM/F12 sur la glace. Conserver à -20 °C.
  3. Préparer 1x milieu Matrigel qualifié hESC en diluant 33,3 μL de Matrigel qualifié hESC 30x avec 1 mL de DMEM/F12.
  4. Enrobez 6 puits stériles, des plaques traitées par culture tissulaire avec 1 mL de 1x Matrigel qualifié hESC dans chaque puits à l’avance et conservez à 4 °C pendant la nuit. Laisser à température ambiante (RT) pendant au moins 30 min avant utilisation.
  5. Décongeler les CSEh cryoconservés dans un bain-marie à 37 °C pendant 3 min sans trembler. Ensuite, transférez immédiatement les cellules par pipetage dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 4 mL de milieu pré-retourné à 37 °C mTesR, pipetez doucement de haut en bas 2 fois.
  6. Centrifuger les CSEh à 200 x g pendant 2 min à TA.
  7. Aspirer le surnageant et ressusciter doucement les cellules dans 1 mL de milieu mTesR.
  8. Aspirer le milieu DMEM/F12 de la plaque et ensemencer les cellules dans un puits de plaque de 6 puits à une densité de 1 x 105 cellules dans 2 mL de mTesR.
  9. Incuber dans un incubateur à 5% deCO2 et maintenir les cellules en les remplaçant quotidiennement par un milieu mTesR préchauffé. Faites passer les cellules à environ 70-80% de confluence ou lorsque les colonies cellulaires commencent à entrer en contact.

2. Passage et différenciation des cellules souches

  1. Pour les cellules passaging, aspirer le milieu et incuber les cellules avec 1 mL par puits de solution enzymatique (p. ex. Accutase pendant 5 min à 37 °C. Ensuite, transférez les cellules par pipetage dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 4 mL de DMEM / F12 pré-pré-contrecarré à 37 ° C.
  2. Centrifuger les cellules à 200 x g à RT pendant 2 min.
  3. Aspirer le milieu et ressusciter doucement le culot cellulaire dans 1 mL de milieu mTesR.
  4. Préparez à l’avance des plaques de 24 puits en enduisant 250 μL de milieu Matrigel qualifié pour 1x hESC. Semez les CSEh décrits ci-dessus à une densité de 1 à 1,5 x10 5 cellules par puits dans 500 μL de milieu mTesR.
  5. Laisser les cellules incuber pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur au CO2.

3. Formation de DE

  1. Préparer des solutions d’origine de 100 μg/mL d’Activine A avec du DPBS contenant 0,2 % de BSA et 3 mM de CHIR99021 avec du DMSO.
  2. Préparer le milieu de base de différenciation de l’étape I en complétant le milieu RPMI avec 1x B27.
  3. Ajouter l’activine A à une concentration finale de 100 ng/mL et CHIR99021 à une concentration finale de 3 μM dans un volume approprié de milieu de base de différenciation préchauffé de stade I.
  4. Aspirer le milieu mTesR des cellules et le remplacer par un milieu de différenciation de stade I contenant des facteurs de différenciation supplémentaires (p. ex., 0,5 mL par puits d’une plaque de 24 puits).
  5. Laisser les cellules incuber pendant 3 jours à 37 °C dans un incubateur à CO2, en remplaçant quotidiennement les milieux de stade I par des facteurs de différenciation fraîchement ajoutés (Jours 0-2).
    REMARQUE: Après 3 jours de différenciation, les cellules différenciées doivent exprimer des marqueurs de cellules DE, telles que FOXA2, SOX17, GATA4, CRCR4 et FOXA1 (minimum 80% de SOX17 nécessaire pour continuer).

4. Différenciation des cellules progénitrices hépatiques

  1. Préparer les milieux de base de différenciation de stade II en dissolvant le remplacement du sérum knockout (KOSR) à une concentration finale de 20% dans le DMEM Knock Out.
  2. Préparer un milieu de différenciation de stade II contenant 1 % de DMSO, 1x GlutaMAX, 1x solution d’acides aminés non essentiels (NEAA), 100 μM de 2-mercaptoéthanol et 1x de pénicilline/streptomycine (P/S) au volume approprié de KOSR/KNOCKOUT DMEM.
  3. Le jour 3 de la différenciation, aspirer le milieu et le remplacer par le milieu de stade II (p. ex., 0,5 mL par puits d’une plaque de 24 puits). Puis incuber pendant 24 h.
  4. Le jour 4 de la différenciation, aspirer le milieu et le remplacer par le milieu de stade II (p. ex., 1 mL par puits d’une plaque de 24 puits).
  5. Changez le support tous les deux jours (remplacez medium le jour 6).
    REMARQUE: Après 8 jours de différenciation, les cellules différenciées doivent exprimer des marqueurs appropriés des cellules progénitrices hépatiques, telles que HNF4α, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA (minimum 80% de HNF4α nécessaire pour procéder).

5. Différenciation des hépatocytes

  1. Préparer des solutions d’origine d’oncostatine (OSM) de 10 μg/mL avec du DBPS (contenant 0,2 % de BSA) et filtrer avec une membrane filtrante de 0,22 μm.
  2. Préparer le milieu de base de différenciation de stade III (milieu HepatoZYME-SFM (HZM) complété par 10 μM d’hydrocortisone-21-hémisuccinate et 1x P/S).
  3. Ajouter HGF à une concentration finale de 10 ng/mL et OSM à une concentration finale de 20 ng/mL au volume approprié de milieu de différenciation préchauffé de stade III.
  4. Le jour 8 de la différenciation, aspirer le milieu de stade II à partir des cellules et le remplacer par le milieu de stade III (p. ex., 1 mL par puits d’une plaque de 24 puits).
  5. Laisser les cellules incuber pendant 10 jours à 37 °C dans un incubateur de CO2, en changeant de milieu de stade III tous les deux jours avec des facteurs de différenciation fraîchement ajoutés (jours 8-18).
    REMARQUE: Après 18 jours de différenciation, les cellules différenciées doivent exprimer des marqueurs caractéristiques des hépatocytes, tels que AAT, ALB, TTR, HNF4α, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Le pourcentage de cellules albumines positives est généralement supérieur à 90%.

6. Isolement de l’ARN, synthèse de l’ADNc et analyse rt-qPCR

  1. Aspirer le milieu à partir des cellules et ajouter la quantité appropriée de réactif RNAiso Plus (p. ex., 0,3 mL par puits d’une plaque de 24 puits). Recueillir le surnageant dans un tube de 1,5 mL et laisser reposer à RT pendant 5 min.
  2. Ajouter 60 μL de réactif chloroforme et le laisser à TA pendant 5 min. Centrifuger ensuite à 12 000 x g pendant 15 min.
  3. Prélever le surnageant de 125 μL et le transférer dans un autre tube de centrifugation. Ajouter 160 μL d’isopropanol, bien mélanger et rester à TA pendant 10 min.
  4. Centrifuger à 12 000 x g pendant 10 min.
  5. Retirer le surnageant, ajouter 75 % d’éthanol au précipité et centrifuger à 7 500 x g pendant 5 min.
  6. Après séchage à TA, ajouter 40 μL d’eau traitée au DEPC pour dissoudre. Pour le qPCR, transcrivez 2 μg d’ARN total avec un kit de transcription inverse selon le protocole du fabricant.
  7. Effectuez rt-qPCR à l’aide d’un kit commercial selon le protocole du fabricant.
  8. Normaliser l’expression génique par rapport aux cellules souches non induites et déterminer la variation du pli après la normalisation à GAPDH.

7. Validation de la différenciation par immunofluorescence

  1. Préparez 1x tampon de lavage PBST en ajoutant 0,1 % de Tween-20 au PBS.
  2. Aspirer le milieu à partir de cellules adhérentes et laver brièvement avec du PBS à TA sur un agitateur.
  3. Aspirer le PBS et incuber les cellules avec 500 μL de méthanol glacé par puits d’une plaque de 24 puits pour fixer les cellules à -20 °C pendant la nuit.
  4. Retirer le méthanol et laver les cellules 3 fois avec du PBS sur un agitateur pendant 10 min à chaque fois à TA.
  5. Cellules de bloc avec 500 μL de BSA à 5% préparées dans du PBS pendant 1-2 h à RT sur un agitateur.
  6. Diluer l’anticorps primaire à 1: 200 dans la même solution utilisée pour le blocage.
  7. Incuber les cellules fixes dans une solution d’anticorps primaires de 300 μL pendant la nuit à 4 °C sur un agitateur.
  8. Après une incubation nocturne, laver les cellules 3 fois avec du PBST pendant 10 min à chaque fois à TA sur un shaker.
  9. Préparer une solution d’anticorps secondaires dans une solution bloquante à 1:1000.
  10. Incuber dans 300 μL de solution d’anticorps secondaires protégée de la lumière pendant 1 h à TA sur un agitateur.
  11. Aspirer la solution d’anticorps secondaires et laver les cellules 3 fois avec pbst pendant 10 min à chaque fois à TA sur un shaker.
  12. Incuber des cellules avec 300 μL de 1 μg/mL de DAPI pendant 3 à 5 min, puis laver deux fois avec du PBST.
  13. Après avoir aspiré le PBST, ajoutez une quantité appropriée de PBS pour prendre des photos sous un microscope à fluorescence.

8. Analyse par transfert western

  1. Préparez 1x tampon de lavage TBST en ajoutant 0,1 % de Tween-20 à la solution saline tris tamponnée (TBS).
  2. Préparez le tampon d’électrophorèse SDS-PAGE et le tampon de transfert occidental à l’aide d’une trousse commerciale selon le protocole du fabricant.
  3. Résoudre la protéine cellulaire totale (40 μg) sur un gel de polyacrylamide de dodécyl sulfate de sodium à 10 % et fonctionner dans un tampon d’électrophorèse SDS-PAGE à un courant constant de 15 mA pendant environ 2 h.
  4. Transférer le gel dans une membrane de difluorure de polyvinylidène (PVDF) à courant constant de 300 mA pendant 2 h à basse température.
    REMARQUE: Le temps de fonctionnement et le temps de transfert peuvent varier en fonction de l’équipement utilisé et du type et du pourcentage du gel.
  5. Bloquer la membrane avec 3% de BSA préparé dans TBST pendant 1 h à RT sur un shaker.
  6. Incuber dans une solution d’anticorps primaires (dilution 1:1000) pendant une nuit à 4 °C sur un agitateur.
  7. Après incubation de nuit, laver la membrane buvarde 3 fois avec TBST pendant 15 min par temps à RT sur un shaker.
  8. Incuber dans une solution d’anticorps secondaires (dilution 1:2000) pendant 2 h à TA sur un agitateur.
  9. Jeter la solution d’anticorps secondaires et laver la membrane 3 fois avec TBST, pendant 15 min à chaque fois, à TA sur un shaker.
  10. Visualiser les bandes immunoréactives à l’aide d’un réactif de chimiluminescence suivi d’une autoradiographie. Utilisez β-actine comme contrôle de chargement.

9. Absorption verte de l’indocyanine

  1. Préparer une solution mère verte d’indocyanine à 200 mg/mL dans du DMSO.
  2. Préparer une solution de travail en complétant le milieu de différenciation de stade III avec une solution verte d’indocyanine jusqu’à une concentration finale de 1 mg/mL.
  3. Incuber dans un incubateur à 37 °C, 5% deCO2 pendant 1-2 h.
  4. Aspirer le milieu et laver les cellules 3 fois avec du PBS.
  5. Photographier au microscope.

10. Coloration périodique d’Acide-Schiff (PAS) et coloration d’hématoxyline-éosine (H&E)

  1. Aspirer le milieu à partir des cellules adhérentes et laver brièvement deux fois avec du PBS.
  2. Pour la fixation cellulaire, aspirer le PBS et incuber les cellules avec du méthanol glacé à -20 °C pendant la nuit.
  3. Visualisez le stockage du glycogène par coloration PAS et observez les cellules binucleated par coloration H &E à l’aide d’un kit suivant les instructions du fabricant.
  4. Prenez des images avec un microscope à fluorescence.

11. Analyse de l’activité CYP

  1. Mesurer l’activité du CYP450 à l’aide de tests cellulaires disponibles dans le commerce (tests P450-Glo) conformément aux instructions du fabricant.
  2. Utilisez trois répétitions indépendantes pour les tests. Les données sont représentées sous la forme de la moyenne ± et.

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Résultats

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Le diagramme schématique de l’induction HLC à partir des CSEh et des images représentatives en champ lumineux de chaque étape de différenciation sont illustrés à la figure 1. Au stade I, l’activine A et le CHIR99021 ont été ajoutés pendant 3 jours pour inciter les cellules souches à former des cellules endodermiques. Au stade II, les cellules endodermiques se sont différenciées en cellules progénitrices hépatiques après avoir été traitées avec un milieu de différenciation pendant 5 jours. Au...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous présentons une méthode par étapes qui induit des CHN à partir de CSEh en trois étapes. Dans la première étape, Activin A et CHIR99021 ont été utilisés pour différencier les CSEh en DE. Dans la deuxième étape, KO-DMEM et DMSO ont été utilisés pour différencier DE en cellules progénitrices hépatiques. Au cours de la troisième étape, le HZM plus HGF, l’OSM et le sel de sodium de l’hydrocortisone 21-hemisuccinate ont été utilisés pour continuer à différencier les cellules progénitrices hépatiques en CHN.

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81870432 et 81570567 à X.L.Z.), (n° 81571994 à P.N.S.); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2020A1515010054 to P.N.S.), The Li Ka Shing Shantou University Foundation (No. L1111 2008 à P.N.S.). Nous tenons à remercier le professeur Stanley Lin du Shantou University Medical College pour ses conseils utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-MercaptoethanolSigmaM7522Pour la différenciation des progéniteurs hépatiques
488 marqué chèvre contre souris IgGZSGB-BIOZF-0512Pour IF, deuxième anticorps
488 marqué chèvre contre Lapin IgGZSGB-BIOZF-0516Pour IF, deuxième anticorps
AccutaseStem Cell Technologies7920Pour le passage cellulaire
Activine ApeproTech120-14EPour la formation définitive de l’endoderme
Anti - Albumine (ALB)Sigma-AldrichA6684Pour IF et WB, anticorps primaire
Anti - Humain Oct4AbcamAb19587Pour IF, anticorps primaire
Anti - &alpha ;-Fetoprotéine (AFP)Sigma-AldrichA8452Pour IF et WB, anticorps primaire
Anti -SOX17Abcamab224637Pour IF, anticorps primaire
Anti-Hépatocyte Facteur nucléaire 4 alpha (HNF4&alpha ;)Sigma-AldrichSAB1412164Pour la FI, Supplément d’anticorps
primaires B-27Gibco17504-044Pour la formation définitive de l’endoderme
BSABeyotimeST023-200gPour le blocage cellulaire
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046Pour la formation définitive de l’endoderme
DAPIBeyotimeC1006Pour la
DEPC-waterBeyotimeR0021Pour la dissolution de l’ARN
DM3189MCEHY-12071Pour la formation définitive de l’endoderme
DMEM/F12Gibco11320-033Pour la culture cellulaire
DMSOSigma-AldrichD5879Pour la différenciation des progéniteurs hépatiques
DPBSGibco14190-144Pour la culture cellulaire
GlutaMAXGibco35050-061Pour la différenciation des progéniteurs hépatiques
H& Kit de coloration EBeyotimeC0105SPour H& E coloration Facteur
croissance hépatocytaire (HGF)peproTech100-39Pour la différenciation hépatocytaire
HepatoZYME-SFM (HZM)gibco17705-021Pour la différenciation hépatocytaire
Hydrocortisone-21-hemisuccinateSigma-AldrichH4881Pour la différenciation hépatocytaire
IndocyanineSangon BiotechA606326Pour coloration à l’indocyanine
Knock Out DMEMGibco10829-018Pour la différenciation des progéniteurs hépatiques
Knock Out SR Multi-SpeciesGibcoA31815-02Pour la différenciation des progéniteurs hépatiques
Matrigel HESCCorning354277Pour la culture cellulaire
MEM NeAAGibco 11140-050Pour la différenciation des progéniteurs
hépatiques mTesR 5X SupplémentStem Cell Technologies85852Pour la culture cellulaire
mTesR Basal MediumStem Cell Technologies85851Pour la culture cellulaire
Oncostatine (OSM)peproTech300-10Pour la différenciation des hépatocytes
P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)PromegaV8901Pour l’activité CYP450
Kit de coloration PASSolarbioG1281Pour la coloration PAS
Pen/StrepGibco15140-122Pour la différenciation cellulaire
Chèvre conjuguée à la peroxydase anti-Souris IgGZSGB-BIOZB-2305Pour WB, deuxième anticorps
Tampon de dilution d’anticorps primaire pour  ; Western BlotBeyotimeP0256Pour la dilution primaire des anticorps
ReverTraAce qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101Pour la synthèse de l’ADNc
RNAiso PlusTaKaRa9109Pour l’isolement de l’ARN
RPMI 1640Gibco11875093Pour la formation définitive de l’endoderme
Lait écrémé SangonBiotechA600669Pour la préparation d’un deuxième anticorps
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742Pour l’analyse RT-PCR
Torin2MCEHY-13002Pour la formation définitive de l’endoderme
TweenSigma-AldrichWXBB7485VPour la préparation du tampon de lavage
coloration nucléaire de

Références

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Hepatocyte Like CellsHuman Embryonic Stem CellsDirected DifferentiationDefinitive EndodermHepatic Progenitor CellsActivin ACHIR99021Stagewise DifferentiationCYP3A4 ActivityDisease Modeling

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