Article de méthode

Une méthode efficace pour l’induction de cellules dirigées de type hépatocytes à partir de cellules souches embryonnaires humaines

DOI :

10.3791/62654

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6 mai 2021

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1Stem Cell Research Center, Shantou University Medical College, 2The Center for Reproductive Medicine, Shantou University Medical College, 3Guangdong Provincial Key Laboratory of Infectious Diseases and Molecular Immunopathology, Shantou University Medical College

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en cellules fonctionnelles de type hépatocytes (CHN) en complétant continuellement l’activine A et le CHIR99021 pendant la différenciation du CSEh en endoderme définitif (DE).

Résumé

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Les fonctions potentielles des cellules de type hépatocytes (CHN) dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont très prometteuses pour les applications de modélisation des maladies et de dépistage des médicaments. Il est fourni ici une méthode efficace et reproductible pour différencier les CSEh en CSH fonctionnels. L’établissement d’une lignée endodermique est une étape clé dans la différenciation aux HLCs. Par notre méthode, nous régulons les voies de signalisation clés en complétant continuellement l’Activine A et le CHIR99021 lors de la différenciation hESC en endoderme définitif (DE), suivie de la génération de cellules progénitrices hépatiques, et enfin des CHN avec une morphologie hépatocytes typique dans une méthode par étapes avec des réactifs complètement définis. Les HNC dérivés du hESC produits par cette méthode expriment des marqueurs spécifiques au stade (y compris l’albumine, le récepteur nucléaire HNF4α et le polypeptide de cotransport du taurocholate de sodium (NTCP)), et présentent des caractéristiques particulières liées aux hépatocytes matures et fonctionnels (y compris la coloration verte à l’indocyanine, le stockage du glycogène, la coloration à l’hématoxyline-éosine et l’activité CYP3), et peuvent fournir une plate-forme pour le développement d’applications à base de HLC dans l’étude des maladies du foie.

Introduction

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Le foie est un organe hautement métabolique qui joue plusieurs rôles, notamment la désoxydation, le stockage du glycogène, la sécrétion et la synthèse des protéines1. Divers agents pathogènes, médicaments et hérédité peuvent provoquer des changements pathologiques dans le foie et affecter ses fonctions2,3. Les hépatocytes, en tant que principale unité fonctionnelle du foie, jouent un rôle important dans les systèmes artificiels de soutien du foie et l’élimination de la toxicité des médicaments. Cependant, la ressource en hépatocytes humains primaires est limitée dans la thérapie cellula....

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Protocole

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1. Maintien des cellules souches

REMARQUE: Le protocole de maintenance cellulaire décrit ci-dessous s’applique à la lignée cellulaire hES03 maintenue dans une monocouche adhérente. Pour tous les protocoles suivants dans ce manuscrit, les cellules doivent être manipulées sous une armoire de sécurité biologique.

  1. Préparer 1x mTesR de milieu de culture de cellules souches en diluant 5x milieu supplémentaire au milieu de base mTesR.
  2. Préparer 30x milieu Matrigel qualifié hESC en diluant 5 mL de Matrigel qualifié hESC avec 5 mL de DMEM/F12 sur la glace. Conserver à -20 °C.
  3. Préparer 1x milieu Matrigel qualifié hESC en ....

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Résultats

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Le diagramme schématique de l’induction HLC à partir des CSEh et des images représentatives en champ lumineux de chaque étape de différenciation sont illustrés à la figure 1. Au stade I, l’activine A et le CHIR99021 ont été ajoutés pendant 3 jours pour inciter les cellules souches à former des cellules endodermiques. Au stade II, les cellules endodermiques se sont différenciées en cellules progénitrices hépatiques après avoir été traitées avec un milieu de différenciation pendant 5 jours. Au.......

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Discussion

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Ici, nous présentons une méthode par étapes qui induit des CHN à partir de CSEh en trois étapes. Dans la première étape, Activin A et CHIR99021 ont été utilisés pour différencier les CSEh en DE. Dans la deuxième étape, KO-DMEM et DMSO ont été utilisés pour différencier DE en cellules progénitrices hépatiques. Au cours de la troisième étape, le HZM plus HGF, l’OSM et le sel de sodium de l’hydrocortisone 21-hemisuccinate ont été utilisés pour continuer à différencier les cellules progénitrices hépatiques en CHN.

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81870432 et 81570567 à X.L.Z.), (n° 81571994 à P.N.S.); the Natural Science Foundation of Guangdong Province, China (No. 2020A1515010054 to P.N.S.), The Li Ka Shing Shantou University Foundation (No. L1111 2008 à P.N.S.). Nous tenons à remercier le professeur Stanley Lin du Shantou University Medical College pour ses conseils utiles.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-MercaptoethanolSigmaM7522Pour la différenciation des progéniteurs hépatiques
488 marqué chèvre contre souris IgGZSGB-BIOZF-0512Pour IF, deuxième anticorps
488 marqué chèvre contre Lapin IgGZSGB-BIOZF-0516Pour IF, deuxième anticorps
AccutaseStem Cell Technologies7920Pour le passage cellulaire
Activine ApeproTech120-14EPour la formation définitive de l’endoderme
Anti - Albumine (ALB)Sigma-AldrichA6684Pour IF et WB, anticorps primaire
Anti - Humain Oct4AbcamAb19587Pour IF, anticorps primaire
Anti - &alpha ;-Fetoprotéine (AFP)Sigma-AldrichA8452Pour IF et WB, anticorps primaire
Anti -SOX17Abcamab224637Pour IF, anticorps primaire
Anti-Hépatocyte Facteur nucléaire 4 alpha (HNF4&alpha ;)Sigma-AldrichSAB1412164Pour la FI, Supplément d’anticorps
primaires B-27Gibco17504-044Pour la formation définitive de l’endoderme
BSABeyotimeST023-200gPour le blocage cellulaire
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046Pour la formation définitive de l’endoderme
DAPIBeyotimeC1006Pour la
DEPC-waterBeyotimeR0021Pour la dissolution de l’ARN
DM3189MCEHY-12071Pour la formation définitive de l’endoderme
DMEM/F12Gibco11320-033Pour la culture cellulaire
DMSOSigma-AldrichD5879Pour la différenciation des progéniteurs hépatiques
DPBSGibco14190-144Pour la culture cellulaire
GlutaMAXGibco35050-061Pour la différenciation des progéniteurs hépatiques
H& Kit de coloration EBeyotimeC0105SPour H& E coloration Facteur
croissance hépatocytaire (HGF)peproTech100-39Pour la différenciation hépatocytaire
HepatoZYME-SFM (HZM)gibco17705-021Pour la différenciation hépatocytaire
Hydrocortisone-21-hemisuccinateSigma-AldrichH4881Pour la différenciation hépatocytaire
IndocyanineSangon BiotechA606326Pour coloration à l’indocyanine
Knock Out DMEMGibco10829-018Pour la différenciation des progéniteurs hépatiques
Knock Out SR Multi-SpeciesGibcoA31815-02Pour la différenciation des progéniteurs hépatiques
Matrigel HESCCorning354277Pour la culture cellulaire
MEM NeAAGibco 11140-050Pour la différenciation des progéniteurs
hépatiques mTesR 5X SupplémentStem Cell Technologies85852Pour la culture cellulaire
mTesR Basal MediumStem Cell Technologies85851Pour la culture cellulaire
Oncostatine (OSM)peproTech300-10Pour la différenciation des hépatocytes
P450 - CYP3A4 (Luciferin - PFBE)PromegaV8901Pour l’activité CYP450
Kit de coloration PASSolarbioG1281Pour la coloration PAS
Pen/StrepGibco15140-122Pour la différenciation cellulaire
Chèvre conjuguée à la peroxydase anti-Souris IgGZSGB-BIOZB-2305Pour WB, deuxième anticorps
Tampon de dilution d’anticorps primaire pour  ; Western BlotBeyotimeP0256Pour la dilution primaire des anticorps
ReverTraAce qPCR RT KitTOYOBOFSQ-101Pour la synthèse de l’ADNc
RNAiso PlusTaKaRa9109Pour l’isolement de l’ARN
RPMI 1640Gibco11875093Pour la formation définitive de l’endoderme
Lait écrémé SangonBiotechA600669Pour la préparation d’un deuxième anticorps
SYBR Green Master MixThermo Fisher ScientificA25742Pour l’analyse RT-PCR
Torin2MCEHY-13002Pour la formation définitive de l’endoderme
TweenSigma-AldrichWXBB7485VPour la préparation du tampon de lavage
coloration nucléaire de

Références

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  1. Hou, Y., Hu, S., Li, X., He, W., Wu, G. Amino Acid Metabolism in the Liver: Nutritional and Physiological Significance. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1265, 21-37 (2020).
  2. Huang, C., Li, Q., Xu, W., Chen, L. Molecular....

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Mots-clés

Hepatocyte Like CellsHuman Embryonic Stem CellsDirected DifferentiationDefinitive EndodermHepatic Progenitor CellsActivin ACHIR99021Stagewise DifferentiationCYP3A4 ActivityDisease Modeling

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