Migration nucléaire dans l’ovocyte de la drosophile

Résumé

Chez la drosophile,le noyau de l’ovocyte subit une migration dépendante des microtubules au cours de l’oogenèse. Ici, nous décrivons un protocole qui a été développé pour suivre la migration en effectuant une imagerie en direct sur des chambres d’œufs ex-vivo. Notre procédure maintient les chambres à œufs en vie pendant 12 h pour acquérir des films time-lapse 3D multi-positions en utilisant la microscopie confocale à disque rotatif.

Résumé

L’imagerie des cellules vivantes est particulièrement nécessaire pour comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent les mouvements des organites, les réarrangements du cytosquelette ou les modèles de polarité dans les cellules. Lors de l’étude du positionnement du noyau ovocytaire, les techniques d’imagerie en direct sont essentielles pour capturer les événements dynamiques de ce processus. La chambre à œufs de la drosophile est une structure multicellulaire et un excellent système modèle pour étudier ce phénomène en raison de sa grande taille et de la disponibilité de nombreux outils génétiques. Au cours de la mi-oogenèse de la drosophile, le noyau migre d’une position centrale dans l’ovocyte pour adopter une position asymétrique médiée par des forces générées par des microtubules. Cette migration et ce positionnement du noyau sont nécessaires pour déterminer les axes de polarité de l’embryon et de la mouche adulte suivante. L’une des caractéristiques de cette migration est qu’elle se produit en trois dimensions (3D), ce qui crée une nécessité pour l’imagerie en direct. Ainsi, pour étudier les mécanismes qui régulent la migration nucléaire, nous avons développé un protocole pour mettre en culture les chambres à œufs disséquées et effectuer une imagerie en direct pendant 12 h par acquisitions time-lapse à l’aide de la microscopie confocale à disque rotatif. Dans l’ensemble, nos conditions nous permettent de préserver les chambres à œufs de la drosophile vivante pendant une longue période, permettant ainsi de visualiser l’achèvement de la migration nucléaire dans un grand nombre d’échantillons en 3D.

Introduction

Depuis plusieurs années, l’ovocyte de la drosophile est devenu un système modèle pour étudier la migration nucléaire. L’ovocyte de la drosophile se développe dans une structure multicellulaire appelée chambre à œufs. Les chambres à ovules englobent 16 cellules germinales (15 cellules nourricières et l’ovocyte) entourées d’une couche épithéliale de cellules somatiques folliculaires. Le développement de la chambre à ovules a été subdivisé en 14 étapes(Figure 1A),au cours desquelles l’ovocyte se développera et accumulera les réserves nécessaires au développement précoce de l’embryon. Au cours du développement, lors de la ré....

Protocole

1. Préparation du milieu d’imagerie

1. Préparez des supports frais le jour de l’utilisation. Pipette 200 μL de milieu Schneider (contenant de la L-Glutamine et 0,40 g/L de NaHCO₃ complétée par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur, 100 U/mL de pénicilline et 100 mg/mL de streptomycine).
2. Compléter avec 30 μL d’insuline 10 mg/mL.
3. Ajouter 4 μL de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur.

2. Préparation de la chambre d’observation

1. À l’éventreur d’une pipette, appliquez une petite quantité de graisse de silicone tout autour du trou sur la face inférieure de la glissière perfo....

Résultats

Avant la migration, le noyau est dynamique et oscille autour d’une position centrale pendant une période définie comme pré-migration. Ces petits mouvements reflètent un équilibre de forces de poussée et de traction qui maintiennent l’équilibre au milieu de l’ovocyte. En quantifiant les trajectoires des noyaux, nous avons montré que les trajectoires APM et LPM avaient des proportions similaires. On définit la nature de la trajectoire par le premier contact entre le noyau et la membrane^{plasmique 6}. .......

Discussion

D’autres protocoles décrivent comment préparer et mettre en culture des chambres d’œufs de drosophile ex vivo pour un essai d’imagerie vivante^12,13. La nouveauté de ce protocole est l’utilisation d’une chambre d’imagerie construite à l’aide d’une lame en aluminium évidée, d’un couvercle et d’une membrane perméable_O2 / CO_2. Le principal avantage de cette configuration est de limiter le mouvement en Z sans exercer de pression sur l’éc.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tampon d’anesthésie CO2	Dutscher	789060	Anesthésie des mouches
Coverslip (24x50 mm)	Knittel Glass	VD12450Y100A	Préparation de la chambre d’observation
Pince Dumont #5	Carl Roth	K342.1	Dissection
Aiguilles en acier inoxydable	Entosphinx	20	Dissection
Sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur	SIGMA-ALDRICH	F7524	Milieu d’imagerie
Solution d’insuline pancréas bovin	SIGMA-ALDRICH	10516 - 5ml	Milieu d’imagerie
Solution de péniciline/streptomycine	SIGMA-ALDRICH	P0781	Milieu d’imagerie
Membrane perméable	Leica	11521746	Préparation de la chambre d’observation
Schneider Medium	Pan Biotech	P04-91500	Médium d’imagerie
Graisse de silicone	BECKMAN COULTER	335148	chambre d’observation
Disque rotatif confocal	Zeiss	CSU-X1	Observation de la migration nucléaire
Huile Voltalef 10S	VWR	24627 - 188	Préparation de la chambre d’observation

Préparation de la