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Article de méthode

Implantation d’échafaudage à matrice de collagène tridimensionnelle comme stratégie de régénération du foie

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DOI :

10.3791/62697

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29 juin 2021

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1Liver, Pancreas and Motility Laboratory; Unit of Experimental Medicine; School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de Mexico (UNAM), 2Department of Surgery, School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 3Department of Cells and Tissue Biology, School of Medicine, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), 4Department of Pathology, Hospital General de Mexico, 5Materials Research Institute, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM)

Dans cet article

Résumé

Les maladies du foie sont induites par de nombreuses causes qui favorisent la fibrose ou la cirrhose. La transplantation est la seule option pour retrouver la santé. Cependant, étant donné la rareté des organes transplantables, des alternatives doivent être explorées. Notre recherche propose l’implantation d’échafaudages de collagène dans le tissu hépatique à partir d’un modèle animal.

Résumé

Les maladies du foie sont la principale cause de décès dans le monde. Une consommation excessive d’alcool, un régime riche en graisses et une infection par le virus de l’hépatite C favorisent la fibrose, la cirrhose et / ou le carcinome hépatocellulaire. La transplantation hépatique est la procédure cliniquement recommandée pour améliorer et prolonger la durée de vie des patients à un stade avancé de la maladie. Cependant, seulement 10% des greffes sont réussies, avec la disponibilité des organes, les procédures préchirurgicales et postchirurgicales, et les coûts élevés directement corrélés avec ce résultat. Les échafaudages à matrice extracellulaire (ECM) sont apparus comme une alternative pour la restauration des tissus. La biocompatibilité et l’acceptation des greffons sont les principales caractéristiques bénéfiques de ces biomatériaux. Bien que la capacité de restaurer la taille et la fonction correcte du foie ait été évaluée dans des modèles d’hépatectomie hépatique, l’utilisation d’échafaudages ou d’une sorte de support pour remplacer le volume de la masse hépatique disparue du pays n’a pas été évaluée.

Une hépatectomie partielle a été réalisée dans un foie de rat avec la xénoimplantation d’un échafaudage à matrice de collagène (CMS) d’un condyle bovin. Le tissu du lobe hépatique gauche a été enlevé (environ 40%) et une proportion égale de CMS a été implantée chirurgicalement. Les tests de la fonction hépatique ont été évalués avant et après l’intervention chirurgicale. Après les jours 3, 14 et 21, les animaux ont été euthanasiés et des évaluations macroscopiques et histologiques ont été effectuées. Aux jours 3 et 14, du tissu adipeux a été observé autour de la CMS, sans signe clinique de rejet ou d’infection, tout comme la néoformation des vaisseaux et la réabsorption de la CMS au jour 21. Il y avait des preuves histologiques d’un processus d’inflammation insignifiant et de la migration des cellules adjacentes vers le CMS, observé avec l’hématoxyline et l’éosine (H & E) et la coloration trichrome de Masson. Il a été démontré que le CMS fonctionne bien dans le tissu hépatique et pourrait être une alternative utile pour étudier la régénération et la réparation des tissus dans les maladies hépatiques chroniques.

Introduction

Le foie est l’un des organes les plus importants impliqués dans le maintien de l’homéostasie et de la production de protéines1. Malheureusement, les maladies du foie sont la principale cause de décès dans le monde. Aux stades avancés des lésions hépatiques, qui comprennent la cirrhose et le carcinome hépatocellulaire, la transplantation hépatique est la procédure cliniquement recommandée. Cependant, en raison de la rareté des donneurs et du faible taux de greffes réussies, de nouvelles techniques en génie tissulaire (TE) et en médecine régénérative (RM) ont été développées2,3.

TE implique l’utilisation de cellules souches, d’échafaudages et de facteurs de croissance4 pour favoriser la restauration des organes et tissus enflammés, fibrotiques et hédémateux1,5,6. Les biomatériaux utilisés dans les échafaudages imitent l’ECM natif, fournissant les indices physiques, chimiques et biologiques pour le remodelage cellulaire guidé7. Le collagène est l’une des protéines les plus abondantes obtenues à partir du derme, du tendon, de l’intestin et du péricarde8,9. De plus, le collagène peut être obtenu sous forme de biopolymère pour produire des échafaudages bidimensionnels et tridimensionnels par bio-impression ou électrofilage10,11. Ce groupe est le premier à signaler l’utilisation de collagène provenant d’une source osseuse pour la régénération du tissu hépatique. Une autre étude rapporte l’utilisation d’échafaudages synthétisés à partir de collagène bovin, qui a été obtenu à partir de peau, avec des pores homogènes et étroitement situés, sans aucune communication entre eux12.

La décellularisation préserve l’ECM natif, permettant l’incorporation ultérieure de cellules à potentiel de cellules souches13,14. Cependant, cette procédure est encore en phase expérimentale dans le foie, le cœur, les reins, l’intestin grêle et la vessie de souris, de rats, de lapins, de porcs, de moutons, de bovins et de chevaux3,14. Actuellement, le volume de masse hépatique réséqué n’est remplacé dans aucun des modèles d’hépatectomie animale. Cependant, l’utilisation d’un support ou d’un réseau supplémentaire (biomatériaux) qui permet la prolifération cellulaire et l’angiogenèse pourrait être essentielle pour la restauration rapide des fonctions parenchymateuses du foie. Ainsi, les échafaudages pourraient être utilisés comme approches alternatives pour régénérer ou réparer les tissus dans les maladies hépatiques chroniques, éliminant ainsi les limitations dues au don et aux complications cliniques de la transplantation hépatique.

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Protocole

La présente recherche a été approuvée par le comité d’éthique de l’École de médecine (DI/115/2015) de l’Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et le comité d’éthique de l’Hôpital général de Mexico (CI/314/15). L’institution répond à toutes les spécifications techniques pour la production, l’entretien et l’utilisation des animaux de laboratoire et est légalement certifiée par la législation nationale (NOM-062-ZOO-1999). Des rats Wistar mâles pesant de 150 à 250 g (âgés de 6 à 8 semaines) ont été obtenus auprès de l’installation pour animaux de laboratoire de l’École de médecine de l’UNAM pour cette étude.

1. Obtention d’échafaudages à matrice de collagène à partir du fémur bovin

  1. Obtenir le condyle du fémur bovin dans un abattoir certifié par les autorités sanitaires et agricoles du Mexique.
    1. Disséquez soigneusement la graisse condyle, le muscle et le cartilage avec un instrument chirurgical. Coupez les fragments de condyle en fragments de 3 cm x 3 cm à l’aide d’un coupe-scie et nettoyez la graisse et le sang avec une serviette. Lavez les fragments de condyle avec de l’eau.
    2. Faire bouillir (92 °C) les fragments avec 1 L d’un détergent anionique (10 g/L) pendant 30 min. Lavez les fragments de condyle deux fois pour éliminer les restes du détergent anionique.
    3. Sécher les fragments de condyle pendant 3 h à l’aide de papier filtre (0,5 mm).
  2. Préparer un CMS triangulaire (1 cm x1 cm x1 cm) d’épaisseur 0,5 cm à partir des fragments mentionnés à l’étape 1.1(Figure 1A).
    1. Déminéraliser les fragments dans 100 mL de 0,5 M HCl pendant 10 min avec une agitation constante. Retirez le HCl.
      REMARQUE: Neutraliser le HCl avec de l’hydroxyde de sodium (10 M).
    2. Rincez les fragments trois fois avec 100 mL d’eau distillée, 15 min à chaque fois, avec une agitation constante. Sécher le CMS avec du papier filtre (0,5 mm) pendant 1 h.
    3. Utilisez un stéréomicroscope15 pour analyser les propriétés structurelles du CMS (taille des pores, formation des pores et interconnexion poreuse)(Figure 1B).
    4. Utilisez un microscope électronique à balayage16 pour analyser la surface rugueuse des trabécules CMS (Figure 1C).
    5. Utilisez l’instrument de dissection pour le mélange et l’étirement afin d’évaluer les changements mécaniques (plasticité et flexibilité) du CMS(Figure 1D).
    6. Emballez le CMS dans la poche de stérilisation et stérilisez-le avec du plasma de peroxyde d’hydrogène pendant 38 min. Conserver le CMS stérile dans l’emballage d’origine dans un endroit sec à 20-25 °C jusqu’à utilisation.

2. Préparation de la zone chirurgicale et manipulation et préparation du modèle animal

  1. Désinfectez la zone chirurgicale, la table de travail, le microscope de microchirurgie et le siège avec une solution de chlorhexidine à 2%. Stériliser tous les instruments chirurgicaux, l’éponge chirurgicale, les écouvillons et le drap chirurgical jetable par stérilisation thermique (121 °C/30 min/100 kPa)
  2. Assignez les rats (n = 5) en trois groupes de cinq rats par groupe: 1. simulacre, 2. hépatectomie et 3. hépatectomie plus CMS, et suivez tous les groupes les jours 3, 14 et 21 jours.
    1. Administrer de la kétamine (35 mg/kg) et de la xylazine (2,5 mg/kg) par voie intramusculaire dans le membre postérieur.
      REMARQUE: La période sédative dure généralement de 30 à 40 minutes.
    2. Raser la peau abdominale (5 cm x 2 cm) à l’aide de savon chirurgical et d’une lame à double tranchant, et désinfecter la peau à l’aide d’une solution topique de povidone-iode à 10% en trois tours17.
    3. Placer l’animal sur une plaque chaude en position dorsale décubile, avec le cou hyperétendu pour maintenir des voies respiratoires perméables (Figure 2).
    4. Évaluer la profondeur de l’anesthésie à travers le schéma respiratoire et la perte du réflexe de sevrage dans les membres.
    5. Placez un drap chirurgical jetable autour de la peau rasée et faites une incision (2,5 cm) sur la ligne albous avec un scalpel, en utilisant le processus xiphoïde comme point de référence. Évitez le vaisseau sanguin de la paroi abdominale pour prévenir les saignements.
    6. Mettez le rétracteur abdominal en place et observez la cavité abdominale. À l’aide de la pince à dissection, extraire le lobe hépatique gauche et le placer sur la plaque métallique (Figure 3A).
      REMARQUE: Dans le groupe simulé, extrayez uniquement le lobe hépatique gauche, puis retournez le foie dans la cavité abdominale. Suturez la paroi abdominale et la peau avec une suture en nylon 3-0.
    7. Dans les groupes expérimentaux avec et sans CMS, utilisez une lame de scalpel et une lame de scalpel stérile (#15) pour effectuer une hépatectomie (environ 40%) avec deux coupes. Utiliser un gabarit métallique triangulaire (1 cm x 1 cm x 1 cm) pour effectuer l’hépatectomie(Figure 3B).
    8. Pour prévenir les saignements du foie, maintenez la compression chirurgicale avec un écouvillon sur le bord du foie pendant 5 min.
    9. Hydrater le CMS dans une solution saline stérile pendant 20 minutes avant l’intervention chirurgicale. Implantez le CMS dans le site de l’hépatectomie avec quatre sutures de points de suture entre le tissu hépatique et le CMS pour éviter le déplacement du biomatériau. Utilisez 7-0 sutures en polypropylène non résorbables(Figure 3C).
      REMARQUE: Ne retirez pas les sutures lors d’une deuxième chirurgie; les sutures peuvent être utilisées comme référence pour identifier le site d’implantation de CMS.
    10. Retournez le foie dans la cavité abdominale et suturez la paroi abdominale et la peau avec une suture en nylon 3-0. Nettoyez l’incision chirurgicale avec une éponge chirurgicale imbibée d’iode en deux tours. Observez et surveillez les signes vitaux des animaux.

3. Soins postopératoires

  1. Administrer la méglumine flunixine (2,5 mg/kg) par voie intramusculaire dans le membre postérieur. Administrer les analgésiques approuvés par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement.
  2. Pour la récupération de l’anesthésie, placez les animaux dans des boîtes individuelles en polycarbonate avec litière pour animaux de laboratoire dans une zone sans bruit avec contrôle de la température (23 ° C).
  3. Observez la récupération des animaux et surveillez leur consommation d’eau et de nourriture pendant 2 h. Surveiller les animaux après l’opération, tel qu’approuvé par le comité de soins et d’utilisation des animaux de l’établissement.

4. Évaluation de la fonction hépatique dans le sérum

  1. Prélever des échantillons de sang (500 μL) dans les veines latérales de la queue des animaux anesthésiés avant l’intervention chirurgicale (valeurs de base) et aux jours d’évaluation 3, 14 et 21.
  2. Centrifuger les échantillons de sang à 850 × g/10 min à température ambiante (23 °C); séparer le sérum et le conserver à -80°C jusqu’à utilisation.
  3. Effectuer un panel de tests de la fonction hépatique : albumine sérique (ALB), phosphatase alcaline (ALP), alanine aminotransférase (ALT), aspartate aminotransférase (AST), bilirubine totale (TB) et bilirubine directe (DB)(Tableau 1).

5. Euthanasie et gestion des tissus

  1. Anesthésiez les animaux pour chaque évaluation (jours 3, 14 et 21) en suivant le protocole décrit ci-dessus.
  2. Euthanasier par des méthodes approuvées par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux.
  3. Effectuer une incision (5-6 cm) sur la ligne albous avec un scalpel pour observer les organes de la cavité abdominale et prendre des photos de la zone d’hépatectomie du simulacre et des groupes expérimentaux, avec et sans le CMS.
  4. Prélever des échantillons de foie (2 cm x 2 cm; 0,40-0,45 g) sur tous les animaux du groupe d’étude et les placer dans une solution de formaldéhyde à 4% pendant 24 h pour une évaluation histologique ultérieure.

6. Analyse histologique

  1. Préserver les tissus hépatiques dans du formaldéhyde à 4% et déshydrater les tissus en utilisant une série de concentrations d’alcool (60%, 70%, 80%, 90%, 100%); placez-les dans du xylène (1h) et incrustez-les dans de la paraffine16.
  2. Coupez les blocs de paraffine avec un microtome en sections de 4 μm d’épaisseur pour la préparation de huit lames.
  3. Effectuer la coloration trichrome de H&E et Masson16.
  4. Observez les sections colorées au microscope optique pour sélectionner les zones représentatives du foie, avec et sans CMS. Obtenez des photomicrographies à grossissement 4x, 10x et 40x et traitez les images à l’aide du logiciel approprié18 (voir la Table des matériaux).

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Résultats

La déminéralisation osseuse affecte les propriétés mécaniques du CMS sans altérer la forme d’origine ou l’interconnexion de sespores. CMS peut avoir n’importe quelle forme, et par conséquent, peut être ajusté à la taille et à la forme de l’organe ou du tissu sélectionné19. Dans le protocole actuel, nous avons utilisé un CMS triangulaire (Figure 1A-D). Un modèle de rat a été utilisé pour évaluer la capacité de régénér...

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Discussion

La transplantation d’organes est le pilier du traitement chez les patients atteints de fibrose hépatique ou de cirrhose. Quelques patients bénéficient de cette procédure, ce qui rend nécessaire de fournir des alternatives thérapeutiques aux patients sur la liste d’attente. L’ingénierie tissulaire est une stratégie prometteuse qui utilise des échafaudages et des cellules à potentiel de régénération2,4,13. L’ablation d’une partie ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents. Benjamín León-Mancilla est doctorant au Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et il a reçu une bourse DGAPA-UNAM.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l’installation pour animaux de laboratoire de l’unité de médecine expérimentale, l’infirmière Carolina Baños G. pour son soutien technique et chirurgical, Marco E. Gudiño Z. pour son soutien en microphotographies et Erick Apo pour son soutien en histologie du foie. Le Conseil national a soutenu cette recherche pour la science et la technologie(CONACyT),numéro de subvention SALUD-2016-272579 et le PAPIIT-UNAM TA200515.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Détergent anioniqueAlconoxZ273228
Cassettes de biopsieLeica
Appareil photo DMXNikonDXM1200F
CentrifugeuseEppendorf5424
Gluconate de chlorhexidine 4 %BD372412
Verres de protection 25 mm x 40 mmCorning2980-224
EosinSigma-Aldrich200-MCAS 17372-87-1
Alcool éthylique purSigma-Aldrich459836CAS 64-17-5
Méglimide de flunixineMSDQ-0273-035
Lames de verre 75 mm x 25 mmCorning101081022
HématoxylineMerckH9627CAS 571-28-2
Acide chlorhydrique 37 %Merck339253CAS 7647-01-0
KétaminePisa agropecuariaQ-7833-028
Microscope optiqueNikonMicrophoto-FXA
Microchirurgie stéréomicroscopeZeissOPMI F170
Microtainer cape jauneBeckton Dickinson365967
MicrotomeLeicaRM2125
Animal modèle : rats WistarUniversidad Nacional Autó ; noma de Mé ; xico
Nylon 3-0 (Dermalon)Covidien1750-41
Polypropylène 7-0AtramatSE867/2-60
Povidone-iodeSolution cutanée à 10 %Diafra SA de CV1.37E+86
Microscope électronique à balayageZeissDSM-950
Hydroxyde de sodium, granulés J. T. Baker3722-01CAS 1310-73-2
Logiciel ACT-1NikonVer 2.70
StéréomicroscopeLeicaEZ4Stereo 8X-35X
Sterrad 100SJohnson and Johnson99970
Surgipath paraplastLeica39601006
Synringe de 1 mL avec aiguille (27G x 13 mm)SensiMedicalLAN-078-077
Processeur de tissus ( Histokinette)LeicaTP1020
Tissue-Tek TEC 5 (Enfonceur de tissu)Sakura Finetek USA5229
Kit de coloration trichromeSigma-AldrichHT15
Unicell DxC600 AnalyzerBeckman CoulterBC 200-10
XylazinePisa agropecuariaQ-7833-099
XyleneSigma-Aldrich534056CAS 1330-20-7
3802453

Références

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