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Article de méthode

Dissection planaire de l’ovaire pour l’analyse ultrastructurale et la coloration des anticorps

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DOI :

10.3791/62713

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10 septembre 2021

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1Stowers Institute for Medical Research, 2Howard Hughes Medical Institute, 3Department of Human Genetics, University of California Los Angeles

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente les étapes prises pour disséquer les ovaires chez les planaires d’eau douce, Schmidtea mediterranea. Les ovaires disséqués sont compatibles pour l’immunocoloration par anticorps et l’analyse ultrastructurale avec microscopie électronique à transmission pour étudier la biologie cellulaire des ovocytes et des cellules somatiques, offrant une profondeur et une qualité d’imagerie qui étaient auparavant inaccessibles.

Résumé

L’accessibilité aux cellules germinales permet d’étudier le développement, la méiose et la recombinaison des cellules germinales. Le biotype sexué du planaire d’eau douce, Schmidtea mediterranea, est un puissant modèle d’invertébré pour étudier la spécification épigénétique des cellules germinales. Contrairement au grand nombre de testicules et de cellules germinales mâles, les ovocytes planaires sont relativement difficiles à localiser et à examiner, car il n’y a que deux ovaires, chacun avec 5 à 20 ovocytes. Une localisation plus profonde dans le corps planaire et l’absence de tissus épithéliales protecteurs rendent également difficile la dissection directe des ovaires planaires.

Ce protocole utilise une brève étape de fixation pour faciliter la localisation et la dissection des ovaires planaires pour une analyse en aval afin de surmonter ces difficultés. L’ovaire disséqué est compatible pour l’examen ultrastructurel par microscopie électronique à transmission (MET) et l’immunocoloration par anticorps. La technique de dissection décrite dans ce protocole permet également des expériences de perturbation génique, dans lesquelles les ovaires sont examinés dans différentes conditions d’interférence ARN (ARNi). L’accès direct aux cellules germinales intactes de l’ovaire obtenu par ce protocole améliorera considérablement la profondeur et la qualité de l’imagerie et permettra l’interrogation cellulaire et subcellulaire de la biologie des ovocytes.

Introduction

L’anatomie planaire a été examinée en utilisant la MET dans de nombreux tissus 1,2,3,4,5,6. Cependant, peu d’attention a été accordée aux ovaires ou aux ovocytes. La rareté de la littérature sur les ovocytes est en partie due à la difficulté d’accès à ces cellules, laissant la biologie des ovocytes planaires largement inexplorée. Des outils moléculaires ont découvert de nombreux mécanismes de régulation du développement des ovaires chez les planaires à l’aide de la microscopie optique ou à fluorescence 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 . Toutes ces expériences ont été réalisées sur des vers entiers ou des coupes histologiques de vers entiers. Les protocoles de coloration des anticorps et d’hybridation in situ sur des vers entiers impliquent des étapes approfondies de blanchiment, de lavage et de nettoyage des tissus, qui prennent du temps et prennent plusieurs jours.

L’objectif général de la méthode décrite ici est de fournir l’accessibilité à des ovaires et des ovocytes planaires intacts et disséqués, ce qui éliminera la nécessité d’un blanchiment ou d’une coupe histologique et réduira le temps de lavage et d’élimination des tissus dans la coloration des anticorps et l’hybridation in situ. Les ovaires disséqués amélioreront également la pénétration de la sonde ou de l’anticorps et augmenteront la profondeur et la qualité de l’imagerie pour les microscopes optiques et électroniques. L’accessibilité aux ovaires et aux ovocytes disséqués permet la recherche en biologie cellulaire à la résolution cellulaire et subcellulaire avec des ovocytes entiers intacts. Une étude récente sur des ovaires planaires disséqués a caractérisé pour la première fois la méiose planaire de l’ovocyte avec la MET et la microscopie confocale21. Les travaux ont fourni une description complète d’un nouveau phénomène au cours de la méiose appelé vésiculation de l’enveloppe nucléaire.

Nous présentons ici les procédures détaillées de dissection des ovaires planaires. Une étape de fixation était suffisante pour préserver la structure des cellules ovariennes pour la dissection et la manipulation en aval (c’est-à-dire le traitement pour l’analyse TEM et au microscope optique). Étant donné leur similitude dans les plans corporels et l’architecture des tissus, ce protocole devrait également être largement informatif pour l’étude des ovocytes et de leurs noyaux chez plusieurs autres espèces de Plathelminthes (par exemple, le genre Dugesia ou Polycelis). Ce protocole n’est probablement pas pertinent pour Macrostomum lignano en raison de leur petite taille et de leur architecture corporelle presque transparente, qui permettront une observation directe de l’ovaire et des ovocytes 22,23,24. La zone corporelle contenant les ovaires est plus distincte optiquement (par exemple, pigmentée plus foncée ou pigmentée plus claire) chez certaines espèces (par exemple, Dugesia ryukyuensis 9,25) que S. mediterranea. Les études chez ces espèces peuvent moins s’appuyer sur les lignes directrices pour localiser les ovaires chez S. mediterranea présentées ici, mais tirer parti des conditions de fixation et de dissection.

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Protocole

1. Préparation

  1. Préparez les vers : nourrissez les planaires sexuels deux fois par semaine avec de la pâte de foie biologique pour atteindre la maturité sexuelle.
    REMARQUE : Généralement, ces vers mesurent plus de 1 cm de long et ont un gonopore postérieur à l’ouverture du pharynx.
  2. Préparez des solutions.
    1. Préparez les réactifs suivants : 16 % de paraformaldéhyde (PFA) ; solution aqueuse de glutaraldéhyde (GA) à 50 % ; N-acétyl-L-cystéine (NAC) ; 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) : 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 et 2 mM KH2PO4.
    2. Diluer 50 % de GA et 16 % de PFA avec du PBS pour obtenir un mélange final de 2,5 % de GA et 2 % de PFA. Diluer 16 % de PFA avec du PBS jusqu’à une concentration finale de 4 % de PFA.
    3. Dissoudre 5 g de NAC dans 100 mL de PBS pour obtenir une solution d’action à 5 %.

2. Collecte des ovaires

  1. Traitez les vers sexuellement matures avec 5 % de NAC dans un plat à température ambiante pendant 5 min.
    REMARQUE : Les gros vers peuvent se recroqueviller. Des brosses ou des pointes de pipette peuvent être utilisées pour aplatir les vers. La quantité de 5 % de NAC utilisée est minime, suffisante pour couvrir la surface de la boîte de Pétri.
  2. Remplacer la NAC par 10 mL de paraformaldéhyde à 4 % fraîchement préparé et fixer les vers pendant 1 h à température ambiante en les secouant de temps en temps. Commencer la dissection 10 min après l’ajout de 4% de PFA, et effectuer la dissection à 4% de PFA au fur et à mesure que les vers sont fixés.
  3. Observez la pigmentation épithéliale pour localiser les cordons nerveux ventraux, qui apparaissent comme deux lignes avec une pigmentation plus claire allant des ganglions céphaliques antérieurs vers la queue.
  4. Localisez les ovaires.
    REMARQUE : L’ovaire est situé juste à côté du cordon nerveux du côté médial (Figure 1A). Comptez sur la pigmentation de l’épithélium pour localiser la position de l’ovaire dans la direction antéro-postérieure. Idéalement, la pigmentation de l’épithélium ventral dans la région ovarienne est plus claire que dans les régions environnantes. Chez certains vers, la pigmentation de l’épithélium ventral ne donne pas assez de confiance. Ces vers peuvent être jetés car certains peuvent ne pas avoir d’ovaires bien développés.
  5. Valider les positions des ovaires une fois que les ovaires présumés sont localisés par pigmentation.
    REMARQUE : Tout d’abord, les ovaires sont postérieurs aux ganglions céphaliques. Deuxièmement, les testicules de couleur foncée sont latéraux à la surface dorsale au-dessus de l’ovaire. Les ovaires se trouvent devant le testicule le plus antérieur (Figure 1B). Parfois, les lobes des testicules sont positionnés au niveau ou légèrement en avant des ovaires.
  6. Utilisez deux couteaux chirurgicaux pour couper l’arrière et l’avant des deux ovaires (Figure 1C) afin d’enlever complètement les fragments de vers antérieurs et postérieurs. Utilisez un couteau pour ancrer la vis sans fin et nettoyez l’autre couteau utilisé pour faire les coupes.
  7. Coupez la ligne médiane du fragment d’ovaire pour séparer les deux ovaires. Retournez le fragment pour avoir le côté ventral vers le bas.
  8. Décollez le tissu dorsal pour exposer l’intestin (figure 1D) à l’aide de deux paires de pinces à épiler pointues (type 5-SA).
    REMARQUE : L’ovaire en forme de dôme est situé sous les branches de l’intestin.
  9. Retirez délicatement les branches intestinales situées au-dessus des tissus ventraux à l’aide de la pointe de la pince à épiler ou d’une brosse douce pour exposer l’ovaire (Figure 1E).
  10. Retirez les tissus environnants pour retirer l’ovaire (Figure 1F,G).
  11. Retirez les ovaires et transférez-les dans un tube de 1,5 ml pour les laver avec 1 ml de PBS.

3. Fixation pour TEM

  1. Lavez les ovaires dans du PBS pendant 10 minutes en les secouant doucement. Gardez les trompes droites et laissez les ovaires couler au fond par gravité. Répétez le lavage une fois.
    REMARQUE : Si les ovaires ne s’enfoncent pas, appliquez une rotation douce pendant 15 s avec une mini-centrifugeuse de paillasse (vitesse maximale 2000 × g).
  2. Remplacez le PBS par 2 % de PFA/2,5 % de GA/PBS.
  3. Fixez les échantillons à température ambiante pendant 1 h sur un agitateur à 40 tr/min.
  4. Conservez les échantillons dans un fixateur à 4 °C pendant la nuit sur un agitateur à 40 tr/min.

4. Traitement des échantillons pour la GDT

  1. Lavez les ovaires dans du PBS 3 fois pendant 10 minutes chacun.
  2. Lavez les ovaires dans de l’eau doublement distillée (jjH2O) 3 fois pendant 10 min chacune.
  3. Fixer les ovaires dans de l’OsO4 aqueux à 2 % pendant 1 à 2 h à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
    REMARQUE : Les récipients d’échantillons doivent être scellés avec du parafilm au cours de cette étape. Préparez 2% d’OsO4 avec de l’eau traitée par osmose inverse (voir le tableau des matériaux).
  4. Rincer les échantillons avec du ddH2O 3 fois, 10 min chacune.
  5. Pré-colorer les ovaires dans de l’acétate d’uranyle aqueux à 2 % pendant la nuit à 4 °C.
    REMARQUE : La solution UA doit être filtrée avant utilisation ; Évitez la lumière pendant la coloration en bloc . Préparez 2% d’OsO4 avec de l’eau traitée par osmose inverse (voir le tableau des matériaux).
  6. Rincer les échantillons en jdH2O 4 fois en agitant doucement, 10 min chacune.
  7. Déshydratez les ovaires dans une série graduée d’éthanol (30 %, 50 %, 70 %, 95 % et deux fois 100 %, 10 min chaque solution), puis équilibrez-les en deux incubations (10 min) dans de l’oxyde de propylène.
  8. Pour l’infiltration avec de la résine, incuber les échantillons dans un mélange 50 % d’oxyde de propylène et 50 % de résine époxy liquide pendant une nuit à 4 °C. Infiltrer les échantillons avec de la résine époxy à 100% en 3 changements (1 h par changement) avec une agitation douce.
  9. Enrobez les ovaires dans de la résine époxy à 100 % et polymérisez la résine à 60 °C pendant 48 h.

5. Ultramicrotomie

  1. Découpage de blocs et contrôle d’échantillons au microscope optique
    1. Coupez les blocs d’échantillons en forme de pyramide avec une lame de rasoir.
    2. Coupez des sections de 1 à 2 μm d’épaisseur avec un couteau en verre ou en diamant.
    3. Transférez les sections sur une diapositive avec une goutte d’eau, puis chauffez la diapositive sur une plaque chauffante jusqu’à ce que les sections s’aplatissent et adhèrent à la surface de la lame pendant l’évaporation de l’eau.
    4. Recouvrez les sections d’une goutte de bleu de toluidine O à 1 % et chauffez-les sur une plaque chauffante pendant ~10 s. Rincez la lame à l’eau courante, puis laissez-la sécher. Vérifiez les coupes à l’aide d’un microscope optique régulier.
  2. Découpe de sections ultra-minces, collecte et post-coloration.
    1. Coupez des sections ultraminces de 50 à 70 nm d’épaisseur avec un couteau diamanté. Transférez les sections du bateau à eau à couteau sur des grilles en maille ou en cuivre à fente unique.
    2. Teindre les sections à 2% d’UA pendant 8 min. Lavez les grilles en courant ddH2O pendant 30 s.
    3. Teindre les sections avec une solution de plomb à 1 % pendant 6 min. Lavez les sections en courant ddH2O pendant 1 min et séchez-les à l’air.

6. Collecte et analyse des données

  1. Recueillir les données de GDT à l’aide d’un logiciel approprié, p. ex. micrographie numérique (voir la Table des matériaux pour plus de détails).
  2. Faites fonctionner l’oscilloscope à 80 kV. Insérez la grille d’échantillonnage dans l’oscilloscope lorsque l’aspirateur est prêt.
  3. Allumez le faisceau en cliquant sur Lumière dans le menu. Tournez le bouton d’intensité sur la touche de commande gauche jusqu’à ce que le temps d’exposition automatique soit ~1 s. Cliquez sur Démarrer l’acquisition pour obtenir l’image finale.
  4. Construisez des modèles EM tridimensionnels à l’aide du package IMOD (Image Processing, Modeling, and Display) open source.

7. Coloration des anticorps

  1. Lavez les ovaires disséqués (étape 2.16) dans un tube microfuge de 1,5 mL avec 1 mL de 1x PBS complété par 0,5% de Triton X-100 (PBST). Placez les tubes sur un agitateur à 40 tr/min pendant 10 min. Laissez les tubes reposer dans un rack et les ovaires coulent par gravité. Remplacez le lavage par du PBST frais et répétez deux fois.
  2. Digérer les tissus avec 2 μg/mL de protéinase K et 0,1 % de dodécylsulfate de sodium pendant 10 min à température ambiante dans du PBST.
  3. Lavez les ovaires digérés avec du PBST trois fois pendant 10 minutes à chaque lavage.
  4. Incuber les ovaires avec 10% de sérum de cheval dans du PBST pendant 1 h à température ambiante.
  5. Diluer les anticorps primaires 1 à 100 dans la solution bloquante (10 % de sérum de cheval dans du PBS avec 0,5 % de Triton X-100). Incuber les ovaires avec des anticorps primaires pendant la nuit à 4 °C en secouant doucement.
  6. Lavez les ovaires avec du PBST trois fois pendant 10 minutes à chaque lavage.
  7. Incuber les ovaires avec des anticorps secondaires pendant la nuit à 4 °C en les secouant doucement. Diluer tous les anticorps secondaires à l’échelle 1:300 dans la solution bloquante.
  8. Lavez les ovaires avec du PBST trois fois, en veillant à ce que le premier et le troisième lavages durent 10 minutes. Teindre les noyaux ovariens avec Hoechst 33342 à 1:300 dilution dans PBST pendant 30 min à température ambiante lors du deuxième lavage.
  9. Montez les ovaires sur des lames.
    REMARQUE : Un support anti-décoloration peut être utilisé pour prolonger les signaux de fluorescence.

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Résultats

La méthode présentée ici a été décrite par Guo et al.21. La clé d’une dissection réussie est d’identifier correctement la pigmentation de l’ovaire et les guides de position. La stratégie de la méthode consiste à se déplacer de positions larges à un endroit spécifique. Tout d’abord, pour y parvenir, appuyez-vous sur les motifs de pigmentation dorsale et ventrale (Figure 1A,B). La pigmentation ventrale, où résident les ovaires, deviendra blanche après u...

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Discussion

Ces procédures basées sur la fixation pour la dissection des ovaires planaires faciliteront la compréhension de la méiose des ovocytes ainsi que le développement et la régénération des ovaires. La taille des ovocytes et de leurs cellules somatiques de soutien peut varier de 20 à 50 m. Les méthodes basées sur la dissection permettront d’accéder à des cellules ovariennes uniques intactes que les méthodes de sectionnement ou de montage entier ne peuvent pas réaliser. Ce protocole facilitera...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les travaux ont été soutenus par le Howard Hughes Medical Institute (LK et ASA) et la Fondation Helen Hay Whitney (LHG).

Les données originales sous-jacentes à ce manuscrit peuvent être consultées à partir du Stowers Original Data Repository à l’adresse http://www.stowers.org/research/publications/libpb-1628

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
16 % de paraformaldéhydeMicroscopie électronique Sciences15710grade EM
2 % aqueux OsO4Microscopie électronique Sciences19152
50 % glutaraldéhydeMicroscopie électronique Sciences16320Micrographie numérique de grade EM
Gatan Inc.Version 2.33.97.1, collecte de données TEM
Résine EponMicroscopie électronique Sciences14120Embed 812 Kit, liquide, résine époxy
ÉthanolTed Pella19207Dénaturé
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570
Sérum de chevalSigmaH1138
Acétate de plombMicroscopie électronique Sciences
MilliQ eautraitée par osmose inverse
N-Acétyl-L-cystéineSigmaA7250
ParafilmsigmaP7793
Prolong Diamond Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36965
Oxyde de propylèneMicroscopie électronique Sciences75569Grade EM
  ; Protéinase KThermo Fisher Scientific25530049
Bleu de toluidine OMicroscopie électronique Sciences92319
Microscope électronique à transmissionFEITecnai G2 Spirit BioTWIN
Acétate d’uranyleMicroscopieSciences 541093
6080564 électronique

Références

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Biologie de l ovocyteMicroscopie lectronique transmissionInterf rence ARND veloppement des cellules germinalesMarquage par immunofluorescenceSchmidtea mediterraneaLocalisation des cellules germinales
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