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Prélèvement de tissus et extraction d’ARN de l’articulation ostéoarthritique humaine du genou

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DOI :

10.3791/62718

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22 juillet 2021

 ,  ,  , 
1Bone and Joint Center, Henry Ford Health System, 2Department of Orthopedic Surgery, Henry Ford Health System, 3Center for Molecular Medicine and Genetics, Wayne State University

Dans cet article

Résumé

Les tissus primaires obtenus chez les patients après une arthroplastie totale du genou fournissent un modèle expérimental pour la recherche sur l’arthrose avec une translatabilité clinique maximale. Ce protocole décrit comment identifier, traiter et isoler l’ARN de sept tissus uniques du genou pour soutenir la recherche mécaniste dans l’arthrose humaine.

Résumé

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire chronique et dégénérative qui affecte le plus souvent le genou. Comme il n’existe actuellement aucun remède, l’arthroplastie totale du genou (ATK) est une intervention chirurgicale courante. Des expériences utilisant des tissus d’arthrose humaine primaires obtenus à partir de TKA fournissent la capacité d’étudier les mécanismes de la maladie ex vivo. Alors que l’arthrose était auparavant considérée comme ayant un impact principalement sur le cartilage, on sait maintenant qu’elle affecte plusieurs tissus de l’articulation. Ce protocole décrit la sélection des patients, le traitement des échantillons, l’homogénéisation des tissus, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité (basé sur la pureté, l’intégrité et le rendement de l’ARN) de chacun des sept tissus uniques pour soutenir l’investigation du mécanisme de la maladie dans l’articulation du genou. Avec le consentement éclairé, des échantillons ont été prélevés sur des patients souffrant d’ATK pour l’arthrose. Les tissus ont été disséqués, lavés et stockés dans les 4 heures qui ont suivi la chirurgie par congélation éclair pour la fixation de l’ARN ou du form formel pour l’histologie. Les tissus prélevés comprenaient le cartilage articulaire, l’os sous-chondral, le ménisque, le coussinet adipeux infrapacellaire, le ligament croisé antérieur, la synoviale et le muscle oblique vastus medialis. Des protocoles d’extraction d’ARN ont été testés pour chaque type de tissu. La modification la plus importante concernait la méthode de désintégration utilisée pour les tissus durs à cellules basses et à matrice élevée (considérés comme cartilage, os et ménisque) par rapport aux tissus mous à cellules relativement hautes et à matrice basse (considérés comme coussinet adipeux, ligament, synoviale et muscle). Il a été constaté que la pulvérisation était appropriée pour les tissus durs et que l’homogénéisation était appropriée pour les tissus mous. Une propension de certains sujets à produire des valeurs de nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) plus élevées que d’autres sujets de manière cohérente dans plusieurs tissus a été observée, suggérant que des facteurs sous-jacents tels que la gravité de la maladie peuvent avoir un impact sur la qualité de l’ARN. La capacité d’isoler de l’ARN de haute qualité à partir de tissus humains primaires d’arthrose fournit un modèle physiologiquement pertinent pour des expériences sophistiquées d’expression génique, y compris le séquençage, qui peuvent conduire à des connaissances cliniques qui sont plus facilement traduites pour les patients.

Introduction

Le genou est la plus grande articulation synoviale du corps humain, comprenant l’articulation tibofemorale entre le tibia et le fémur et l’articulation fémoro-patellaire entre la rotule et le fémur1. Les os du genou sont tapissés de cartilage articulaire et soutenus par divers tissus conjonctifs, y compris les méniques, la graisse, les ligaments et les muscles, et une membrane synoviale encapsule toute l’articulation pour créer une cavité remplie de liquide synovial1,2,3 ( Figure1). Un genou sain fonctionne comme une articulation de charnière mobile qui permet un mouvement sans friction dans le plan frontal1,3. Dans des conditions pathologiques, les mouvements peuvent devenir restreints et douloureux. La maladie dégénérative de l’articulation du genou la plus courante est l’arthrose (OA)4. Une variété de facteurs de risque sont connus pour prédisposer au développement de l’arthrose, y compris l’âge avancé, l’obésité, le sexe féminin, les traumatismes articulaires et la génétique, entre autres5,6. On estime actuellement à 14 millions le nombre de personnes atteintes d’arthrose symptomatique du genou aux États-Unis, la prévalence augmentant en raison de l’augmentation de l’âge de la population et des taux d’obésité7,8. Initialement considérée comme une maladie du cartilage, l’arthrose est maintenant comprise comme une maladie de l’ensemble de l’articulation9. Les changements pathologiques couramment observés dans l’arthrose comprennent l’érosion du cartilage articulaire, la formation d’ostéophytes, l’épaississement osseux sous-chondral et l’inflammation de la synoviale9,10. Comme il n’existe pas de remède connu pour l’arthrose, les traitements se concentrent principalement sur la gestion des symptômes (par exemple, la douleur)11,12, et une fois que l’arthrose a progressé au stade final, la chirurgie de remplacement articulaire est souvent indiquée13.

Les chirurgies de remplacement articulaire peuvent être des arthroplasties partielles ou totales du genou, avec une arthroplastie totale du genou (TKA), y compris le remplacement de toute l’articulation tibofémorale et de l’articulation fémoro-patellaire. En 2020, environ 1 million de TKA sont effectuées aux États-Unis chaque année14. Au cours de l’ATK, un chirurgien orthopédiste réséque la partie supérieure du plateau tibial et les condyles fémoraux inférieurs(Figure 2A,2B)à équiper d’implants prothétiques. Parfois mal interprété par les patients, dans un TKA, seulement 8-10 mm sont réséqués à partir de l’extrémité de chaque os, qui est ensuite coiffé ou resurfacé, avec du métal. Une doublure en polyéthylène interposée forme la surface de roulement (c.-à-d. le rembourrage) entre les deux implants métalliques. En outre, plusieurs composants des tissus mous de l’articulation sont entièrement ou partiellement excisés pour atteindre un bon équilibre articulaire. Parmi ces tissus figurent les ménesques médiaux et latéraux(Figure 2C),le coussinet adipeux infrapellaire(Figure 2D),le ligament croisé antérieur (LCA; Figure 2E), synoviale (Figure 2F) et muscle oblique vastus medialis (VMO; Figure 2G) 15. Bien que les ENTK réussissent généralement pour le traitement de l’arthrose, environ 20% des patients signalent une réapparition de la douleur après la chirurgie16. En plus du coût élevé et du caractère relativement invasif de la procédure, ces limites soulignent la nécessité de recherches supplémentaires pour identifier d’autres traitements afin d’atténuer la progression de l’arthrose.

Pour explorer les mécanismes pathologiques de l’arthrose qui peuvent présenter de nouvelles voies d’intervention thérapeutique, des systèmes expérimentaux, y compris des cellules, des explants tissulaires et des modèles animaux, peuvent être utilisés. Les cellules sont généralement cultivées en monocouche et sont dérivées de tissus humains ou animaux primaires (par exemple, des chondrocytes isolés du cartilage) ou de cellules immortalisées (par exemple, ATDC517 et CHON-00118). Bien que les cellules puissent être utiles pour manipuler des variables expérimentales dans un environnement de culture contrôlée, elles ne capturent pas les conditions de l’articulation naturelle qui sont connues pour avoir un impact sur les phénotypes cellulaires19. Pour mieux récapituler la cascade complexe de communication chimique, mécanique et cellulaire à cellule sous-jacente à l’arthrose, une alternative est trouvée dans les échantillons de tissus humains ou animaux primaires, qu’ils soient utilisés frais ou cultivés ex vivo comme explants, pour préserver la structure tissulaire et le microenvironnement cellulaire20. Afin d’étudier l’articulation in vivo,de petits modèles animaux (p. ex., souris21) et grands (p. ex., cheval22)pour l’arthrose (p. ex., induction chirurgicale, altération génétique ou vieillissement) sont également utiles. Cependant, la traduction de ces modèles à la maladie humaine peut être limitée par des différences anatomiques, physiologiques et métaboliques, entre autres23. Compte tenu des avantages et des inconvénients des systèmes expérimentaux, les principaux atouts d’être spécifiques à l’espèce et de maintenir la niche extracellulaire offerte par les principaux tissus humains d’arthrose maximisent le potentiel translationnel des résultats de la recherche.

Les tissus humains primaires d’arthrose peuvent être facilement obtenus après l’ATK, ce qui fait de la fréquence élevée des ATK une ressource précieuse pour la recherche. Parmi les applications expérimentales potentielles figurent l’expression génique et les analyses histologiques. Pour réaliser le potentiel des tissus humains primaires d’arthrose pour ces approches de recherche et d’autres, les considérations clés suivantes sont décrites. Premièrement, l’utilisation d’échantillons de patients est assujettie à une réglementation éthique, et les protocoles doivent être conformes aux approbations de la Commission d’examen institutionnel(CISR) 24. Deuxièmement, l’hétérogénéité inhérente des tissus humains primaires malades et l’influence de variables telles que l’âge et le sexe, entre autres, créent la nécessité d’une sélection minutieuse des patients (c.-à-d. l’application de critères d’admissibilité) et d’une interprétation des données. Troisièmement, les propriétés biologiques uniques de différents tissus de l’articulation (p. ex., faible cellularité du cartilage et du ménisque25)peuvent présenter des défis lors d’expériences (p. ex., isoler une qualité et une quantité élevées d’ARN). Le présent rapport aborde ces considérations et présente un protocole pour la sélection des patients, le traitement des échantillons, l’homogénéisation des tissus, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité (c.-à-d. évaluation de la pureté et de l’intégrité de l’ARN; Graphique 3) encourager l’utilisation de tissus humains primaires d’arthrose dans le milieu de la recherche.

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Protocole

Ce protocole d’étude a été approuvé et a suivi les lignes directrices institutionnelles établies par le Henry Ford Health System Institutional Review Board (CISR no 13995).

1. Sélection des patients

  1. Identifiez les patients parmi ceux qui doivent subir une ATK avec un chirurgien orthopédiste.
  2. Sélectionnez les patients en fonction des critères d’éligibilité définis par le protocole de l’étude. Des exemples de critères d’inclusion comprennent le fait d’être âgé de 18 ans ou plus et d’avoir un diagnostic confirmé d’arthrose du genou. Des exemples de critères d’exclusion comprennent le remplacement partiel du genou ou le fait d’avoir un diagnostic confirmé de polyarthrite rhumatoïde.
  3. Communiquez avec les patients pour obtenir un consentement éclairé avant la chirurgie.

2. Traitement de l’échantillon (pour l’ARN)

REMARQUE: Effectuer tous les traitements tissulaires dans une armoire de biosécurité de classe II et suivre des techniques stériles. Portez toujours un EPI approprié (gants en nitrile, blouse de laboratoire, lunettes de sécurité) lors du traitement des échantillons humains. Plusieurs fragments d’os sont produits pendant l’ATK, une grande quantité d’os / cartilage sera potentiellement disponible pour la dissection. En raison de la progression de la maladie, la dégénérescence du cartilage articulaire peut être plus grave sur certaines parties osseuses, ce qui peut être pris en compte dans la conception expérimentale. Seuls les tissus qui imposent l’électrocautérisation pour la résection ont des dommages aux bords thermiques, et un effort chirurgical concerté est fait pour obtenir la plupart des tissus avec un scalpel afin de minimiser les dommages. Les tissus réséqués doivent être maintenus hydratés en tout temps avec du PBS stérile.

  1. Désinfectez toutes les surfaces de travail et l’équipement avec de l’éthanol à 70 %, du décontaminant RNase, de l’eau traitée au DEPC, et encore une fois avec de l’éthanol à 70 %. Essuyez le liquide résiduel avec des tissus propres et non pelucheux. Les pinces, les coupe-os et les scalpels sont autoclavés ou trempés dans de l’éthanol à 70% pendant au moins 10 minutes avant utilisation. Gardez l’équipement immergé dans de l’éthanol à 70 % lorsqu’il n’est pas utilisé immédiatement.
  2. Pré-étiqueter au moins trois cryoviaux avec le nom de l’échantillon anonymié et le numéro aliquote pour chaque tissu (p. ex., TKA-1 Cartilage 1).
    1. Identifiez chaque type de tissu de l’échantillon en fonction des différences de taille, de forme, de couleur et de texture, comme indiqué et décrit à la figure 2. Identifier le cartilage(Flèche de la figure 2A), l’os (flèchede la figure 2B), le ménisque(figure 2C),le coussinet adipeux infrapacellaire(figure 2D),le ligament croisé antérieur(figure 2E),la synoviale(figure 2F)et le muscle oblique vastus medialis(figure 2G).
  3. Isoler le cartilage articulaire.
    1. Sélectionnez une partie osseuse avec une dégradation minimale du cartilage.
    2. À l’aide d’un scalpel n° 10, coupez à travers la profondeur du cartilage autant que possible pour disséquer toute l’épaisseur de la couche de cartilage.
      REMARQUE: Un scalpel n ° 10 ne pénètre que dans le cartilage, pas dans les os.
    3. En utilisant toute l’épaisseur du cartilage, disséquez trois cubes de 5 mm.
  4. Isoler l’os sous-chondral.
    1. Utilisez la même section osseuse à partir de laquelle le cartilage a été recueilli.
    2. À l’aide d’un scalpel n° 10, grattez tout le cartilage restant et les tissus résiduels de la surface osseuse.
    3. Tenez la partie osseuse à couper avec une pince et utilisez les coupe-os pour couper trois cubes de 5 mm.
  5. Isolez le ménisque.
    1. Identifier une partie relativement intacte du ménisque médial ou latéral.
    2. À l’aide d’un scalpel et d’une pince No.10, disséquez trois cubes de 5 mm.
  6. Isolez le coussinet adipeux infrapacellaire.
    1. À l’aide d’un scalpel n° 10 et d’une pince, coupez la partie jaune du tissu en trois portions homogènes et de taille égale (~ 500 mg chacune).
  7. Isoler le ligament croisé antérieur (LCA).
    1. À l’aide d’un scalpel et d’une pince No.10, disséquez trois cubes de 5 mm.
  8. Isolez la synoviale.
    1. À l’aide d’un scalpel et d’une pince n° 10, isolez autant que possible la partie cellulaire rose de la membrane en grattant le tissu adipeux.
    2. Disséquez trois portions homogènes et de taille égale (~200 mg chacune).
  9. Isoler le muscle oblique vastus medialis (VMO).
    1. À l’aide d’un scalpel et d’une pince n° 10, retirez tout tissu adipeux de l’échantillon, en ne laissant que le tissu musculaire rouge.
    2. Disséquer trois cubes de 5 mm.
      REMARQUE: La taille initiale du tissu limite la taille des portions.
  10. Rincez les portions de tissu avec du PBS stérile pour éliminer tout résidu ou débris.
  11. Pour effectuer l’histologie, fixez chaque portion de tissu comme décrit dans la partie 3.
  12. Pour effectuer l’extraction de l’ARN, coupez chacune des trois parties de tissu en plus petits morceaux (~ cubes de 1-2   mm).
    1. Transférer hermétiquement les plus petits morceaux dans un bouchon cryovial sécurisé de 2 mL, congeler en s’immergeant dans de l’azote liquide pendant 30 s, puis transférer dans un congélateur à -80 °C pour un stockage à long terme (jusqu’à 4 mois testés dans le protocole actuel). Répétez ceci pour toutes les aliquotes de tous les tissus.
    2. Continuer à Homogénéisation tissulaire telle que décrite dans la partie 4.

3. Traitement des échantillons (pour l’histologie)

ATTENTION: Le forgé est un produit chimique dangereux, utilisé uniquement dans une hotte chimique.

  1. Remplissez des tubes coniques pré-marqués de 15 mL avec une solution de forme à 10%.
  2. À l’aide de pinces, transférez la section de tissu dans les tubes remplis de for formel.
  3. Fixez les tissus dans le for formel pendant 1 semaine à température ambiante tout en secouant / agitant si possible.
  4. Après 1 semaine, jeter le forme dans l’élimination appropriée des déchets chimiques, rincer les tissus avec du PBS, puis transférer dans un tube conique frais de 15 ml contenant 70% d’éthanol pour un stockage à long terme à 4 ° C jusqu’à ce que les échantillons soient incorporés pour le sectionnement.
    REMARQUE: Pour les os / cartilage uniquement, effectuez la décalcification comme suit.
  5. Après 1 semaine, jeter le forme dans une élimination appropriée des déchets chimiques et rincer les tissus avec du PBS.
  6. Transférer le tissu dans un tube conique de 50 mL avec 45 mL de solution d’EDTA à 10 % (pH 7,4).
  7. Si l’agitation n’est pas possible, inverser les tubes 10 à 15 fois par jour.
  8. Jetez et remplacez la solution EDTA une fois par semaine.
    1. Deux fois par semaine, testez la texture avec un instrument (c.-à-d. une spatule) ou un doigt ganté pour confirmer la décalcification en observant la déformation lorsque la pression est appliquée. Le temps nécessaire pour décalcifier le tissu osseux variera entre les échantillons de 4 à 6 semaines.
  9. Une fois décalcifié, rincer le tissu avec du PBS et transférer dans un tube conique frais de 15 mL contenant 70 % d’éthanol pour un stockage à long terme à 4 °C jusqu’à ce que les échantillons soient incorporés pour le sectionnement.

4. Homogénéisation tissulaire

ATTENTION : Le protocole utilise le phénol chimique dangereux. Le travail avec du phénol doit être effectué dans une hotte chimique.

REMARQUE: Nettoyez soigneusement tout l’équipement et les surfaces à utiliser avec de l’éthanol à 70% (tremper pendant au moins 10 min), suivi d’un décontaminant RNase (tremper pendant au moins 10 min), rincer à l’eau traitée au DEPC, essuyer avec une serviette en papier propre et non pelucheuse, puis repulvériser ou tremper avec de l’éthanol à 70%.

  1. Homogénéisation des tissus durs (cartilage articulaire, os sous-chondral, ménisque)
    1. Avant l’homogénéisation, refroidissez le mortier, le pilon et la spatule à l’aide d’azote liquide. Ceux-ci doivent être conservés aussi froids que possible pour éviter le dégel des échantillons.
    2. Traiter les échantillons un à la fois, en gardant les autres échantillons à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.
    3. Transférer l’échantillon de tissu dans le mortier à l’aide d’une spatule réfrigérée; versez de l’azote liquide supplémentaire sur le tissu et laissez-le s’évaporer. Écrasez le tissu à l’aide du pilon. Ajoutez à plusieurs reprises plus d’azote liquide à l’échantillon de tissu, laissez-le s’évaporer, puis continuez à broyer avec le pilon pour faire une poudre fine.
    4. Après avoir poudré le tissu autant que possible, transférer dans un tube de microcentrifugation pré-réfrigéré de 1,5 mL.
      1. Pré-refroidissement des tubes en s’immergeant dans de l’azote liquide pendant 30 s avant le transfert tissulaire.
    5. Ajouter 1 mL de la solution acide-guanidinium-phénol à chaque tube et le garder sur la glace.
    6. Répétez les étapes 4.1.3 à 4.1.5 pour chaque échantillon de tissu dur.
    7. Après chaque tissu, nettoyez le mortier, le pilon et la spatule avec de l’éthanol à 70%, du décontaminant RNase, de l’eau traitée au DEPC et un trempage supplémentaire dans de l’éthanol à 70%. Essuyez tout liquide résiduel avec un tissu propre et non pelucheux.
    8. Incuber les échantillons sur de la glace pendant 20 minutes supplémentaires.
  2. Homogénéisation des tissus mous (coussinet adipeux infrapellaire, LCA, synoviale, VMO)
    1. Désinfectez l’homogénéisateur en faisant couler des tubes d’éthanol à 70 %, de décontaminant RNase, d’eau traitée au DEPC et d’un lavage supplémentaire à l’éthanol à 70 %, chacun pendant 30 s. Essuyez tout liquide résiduel avec un tissu propre et non pelucheux. Répétez cette opération entre chaque échantillon.
    2. Pré-étiqueter des tubes à fond rond de 5 mL pour chaque échantillon. Ajouter 1 mL de la solution acide-guanidinium-phénol dans chaque tube.
      1. Travailler sur un échantillon à la fois, en gardant les autres échantillons à traiter à -80 °C jusqu’à leur utilisation.
    3. Transférer le tissu dans un tube pré-marqué de 5 mL avec acide-guanidinium-phénol.
    4. Homogénéiser les tissus en impulsions de 30 s, en restant sur la glace pendant et entre les impulsions. Répétez jusqu’à ce que le tissu soit dissous visuellement ou pendant un maximum de cinq impulsions de 30 s.
      REMARQUE: Certains tissus fibreux (c.-à-d. les muscles) peuvent ne pas s’homogénéiser complètement.
    5. Incuber le tissu dissous sur de la glace et passer à l’échantillon suivant.
      1. Nettoyez l’homogénéisateur comme décrit à l’étape 4.2.1. Assurez-vous que les morceaux de tissu ne restent pas dans les dents de la sonde; retirer avec des pinces stériles si nécessaire.
    6. Après homogénéisation de tous les échantillons, incuber sur de la glace dans de l’acide-guanidinium-phénol pendant 20 minutes supplémentaires.
    7. Transférer les échantillons des tubes à fond rond vers des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL pré-étiquetés et pré-réfrigérés.

5. Extraction de l’ARN des tissus

ATTENTION : Ce protocole utilise des produits chimiques dangereux tels que le phénol, le chloroforme et l’isopropanol. Effectuez tout le travail dans une hotte chimique.

REMARQUE : L’équipement et les réactifs sont réservés au travail de l’ARN seulement et doivent être de qualité chimique appropriée pour les applications moléculaires (c.-à-d. stériles, sans nucléase). Ce protocole succède aux protocoles d’homogénéisation tissulaire des parties 4.1 et 4.2. Nettoyez soigneusement tous les équipements et surfaces à utiliser avec de l’éthanol à 70% (tremper pendant au moins 10 min), suivi d’un décontaminant RNase (tremper pendant au moins 10 min). Rincer à l’eau traitée au DEPC, essuyer le liquide résiduel avec une serviette en papier propre et non pelucheuse, puis repulvérir ou tremper avec de l’éthanol à 70 %.

  1. Centrifuger les tubes de microcentrifugation à 10000 x g pendant 10 min à 4 °C pour granuler les débris.
  2. Transférer le surnageant dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL.
    REMARQUE: Pour les tissus adipeux, une couche lipidique sera parfois présente sur le dessus. Évitez de transférer cela en perçant la couche sur le côté du tube avec une pointe de pipette.
  3. Ajouter 200 μL de chloroforme pour 1 mL de solution acide-guanidinium-phénol à chaque échantillon. Serrez vigoureusement les tubes à la main pendant 30 s pour mélanger. Ensuite, incuber sur de la glace pendant 2 min.
  4. Échantillons de centrifugeuse à 10000 x g pendant 12 min à 4 °C.
    NOTE: Après centrifugation, trois couches se seront formées: une phase aqueuse contenant de l’ARN, une interphase d’ADN blanc et une phase de protéine rose au fond.
  5. Transférer environ 500 μL de la phase aqueuse supérieure dans un tube de microcentrifugation frais de 1,5 mL.
    REMARQUE: Ne pas perturber l’interphase et les fractions protéiques. Stockez ces phases à -80 °C pour un futur isolement de l’ADN ou des protéines.
  6. Ajouter un volume égal de solution acide-guanidinium-phénol à la phase aqueuse transférée, mélanger en inversant le tube 8-10 fois. Incuber le tube sur de la glace pendant 20 min.
  7. Ajouter 200 μL de chloroforme pour 1 mL de solution acide-guanidinium-phénol à chaque échantillon. Serrer vigoureusement à la main pendant 30 s pour mélanger puis incuber sur de la glace pendant 2 min.
  8. Échantillons de centrifugeuse à 10000 x g pendant 12 min à 4 °C.
  9. Transférer <500 μL de la phase aqueuse dans un tube de microcentrifugation frais, en prenant soin de ne pas contaminer l’échantillon avec les autres phases.
    ATTENTION : Jetez les phases restantes avec des méthodes appropriées d’élimination des matières dangereuses.
  10. Ajouter un volume égal (en phase aqueuse) de 100% d’isopropanol à chaque échantillon. Mélanger en inversant le tube 8 à 10 fois. Incuber sur de la glace pendant 5 min.
    1. Ajouter 1 μL de coprécipitant de glycogène à chaque échantillon pour aider à localiser la pastille d’ARN après la centrifugation.
  11. Centrifuger les échantillons à 12000 x g pendant 25 min à 4 °C.
  12. Localisez la pastille dans le tube (si vous utilisez un coprécipitant, elle apparaîtra bleue). Versez délicatement le surnageant.
  13. Lavez la pastille en ajoutant 1 mL d’éthanol glacé à 75 % à chaque échantillon, vortex pour déloger la pastille du fond du tube.
    REMARQUE: Préparez de l’éthanol à 75% en utilisant de l’éthanol pur de qualité moléculaire et de l’eau sans nucléase.
  14. Centrifuger à 7000 x g pendant 5 min à 4 °C. Versez délicatement le surnageant.
  15. Répétez les étapes 5.13 et 5.14 deux fois de plus.
  16. Rotation rapide (<2000 x g pendant 5 s) pour amener tout liquide résiduel au fond du tube. Utilisez une pipette P20 pour éliminer tout éthanol résiduel du fond des tubes.
    1. Évitez de toucher la pastille d’ARN avec une pointe de pipette. Modifier les conseils entre les échantillons.
  17. Avec les bouchons de tube ouverts, sécher à l’air les échantillons à température ambiante pendant 10 min.
    REMARQUE: Le granulé peut devenir translucide à mesure qu’il sèche. S’assurer que tout l’éthanol résiduel s’est évaporé améliorera la pureté de l’ARN.
  18. Ajouter 25 μL d’eau sans nucléase dans chaque tube pour dissoudre la pastille.
  19. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
  20. Pipettez doucement de haut en bas pour mélanger l’ARN.
  21. Aliquote 5 μL de l’échantillon dans un tube frais pour l’analyse du contrôle de la qualité (Partie 6). Conserver les 20 μL restants à -80 °C pour les tests d’expression génique.

6. Contrôle de la qualité

  1. Déterminez la concentration et la pureté de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre conformément aux instructions du fabricant.
  2. Déterminez l’intégrité de l’ARN à l’aide d’un appareil d’électrophorèse conformément aux instructions du fabricant.
    REMARQUE: Diluer l’ARN pour qu’il se situe dans la plage des limites de détection de la puce.

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Résultats

Sept tissus uniques de l’articulation du genou humain sont disponibles pour la collecte de patients souffrant d’ATK pour l’arthrose (Figure 1). Dans ce protocole, chacun de ces tissus a été identifié et traité dans les 4 heures suivant l’ablation chirurgicale (Figure 2). En suivant les étapes décrites à la figure 3,des parties de chaque tissu ont été fixées au for formel pour l’évaluation histologique (figure 4<...

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Discussion

Le protocole présenté s’est avéré efficace pour la collecte de sept tissus humains primaires d’arthrose pour l’extraction de l’ARN (Tableau 1) et le traitement histologique (Figure 4). Avant de prélever des échantillons de patients, il est nécessaire d’établir un protocole approuvé par la CISR, idéalement en collaboration avec un chirurgien ou une équipe chirurgicale. L’application d’un protocole normalisé pour le prélèvement d’échantillons (p. ex., résection à partir d’empl...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs remercient les participants à l’étude qui ont rendu cette recherche possible et dévouent ce rapport à de nouveaux scientifiques dans le domaine de l’arthrose.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mLEppendorf05 402Stériles, sans nucléases. Réservé aux travaux d’ARN uniquement.
10 % FormalinCardinal HealthC4320-101Conserver dans l’armoire à produits chimiques lorsqu’il n’est pas utilisé.
100 % chloroforme (qualité biologie moléculaire)Fisher ScientificICN19400290Stérile, sans nucléases. Réservé au travail de l’ARN uniquement, stocker dans une armoire à produits chimiques lorsqu’il n’est pas utilisé.
100 % éthanol (qualité biologie moléculaire)Fisher ScientificBP2818500Stérile, sans nucléases. Réservé au travail sur l’ARN uniquement, lors de la dilution, utilisez de l’eau sans DEPC/nucléase.
100 % isopropanol (qualité biologie moléculaire)Fisher ScientificAC327272500Stérile, sans nucléases. Réservé au travail de l’ARN uniquement, stocker dans une armoire à produits chimiques lorsqu’il n’est pas utilisé.
100 % réactif alcoolCardinal HealthC4305Dilué à 70 % avec dH2O à des fins de nettoyage.
Boîtes de culture stériles de 15 cmThermo Scientific12-556-003Stériles, sans nucléases.
Tubes en polypropylène (Falcon) de 15 mLFisher Scientific14 959 53AStériles, sans nucléases.
Flacons cryogéniques de 2 mL (filetés extérieurement)Fisher Scientific10 500 26Stériles, sans nucléases.
Tubes à fond rond de 5 mLCorning352052Stériles, sans nucléases. Réservé aux travaux d’ARN uniquement.
Tubes en polypropylène (Falcon) de 50 mLFisher Scientific12 565 271Stériles, sans nucléases.
BioanalyseurAgilentG2939BApour la mesure de l’intégrité de l’ARN.
Armoire de biosécuritégénéral de laboratoire
Coupe-osFisher Scientific08 990Stérilisé avec 70 % d’EtOH.
HotteÉquipement
Scalpels jetables (n° 10)Thermo Scientific3120032Stériles, sans nucléases.
EDTALife Technologies15-576-028Solution à 10 % avec dH2O.
ForcepsTout fournisseurStérilisé avec 70 % d’EtOH.
Glycoblue CoprecipitantFisher ScientificAM9516Réservé au travail sur l’ARN uniquement, stocker à -20 ° ;C.
KimwipesFisher Scientific06-666
Azote liquideTout fournisseur
Azote liquide DewarÉquipement
Mortier et pilonTout fournisseurRéservé uniquement pour le travail sur l’ARN, stérilisé selon le protocole.
Spectrophotomètre NanodropThermo ScientificND-2000Pour les mesures de pureté et de rendement de l’ARN.
Eau sans nucléases/traitée au DEPCFisher ScientificStérile, sans nucléases. Réservé aux travaux d’ARN uniquement.
PBS (stérile)Gibco20 012 050Stérile, sans nucléases.
Pipettes (2 & micro ; L, 20 et micro ; L, 200 et micro ; L, 1000 et micro ; L) et pourboiresTout fournisseurStérile, sans nucléases.
Plasma/Sérum Advanced miRNA kitQiagen217204
Centrifugeuse réfrigérée 5810REppendorf22625101
RNAlaterThermo Scientific50 197 8158Stérile, sans nucléases.
RNAse Away/RNAseZapFisher Scientific
7002
Spatule (taille semi-micro)Tout fournisseurRéservé uniquement pour le travail sur l’ARN.
Homogénéisateur de tissusPro Scientific01-01200Réservé uniquement au travail sur l’ARN, stérilisé selon le protocole.
Réactif TRIzolFisher Scientific15 596 026Stérile, sans nucléases. Réservé aux travaux d’ARN uniquement.
Équipement chimique général de laboratoirede laboratoire général

Références

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