Prélèvement de tissus et extraction d’ARN de l’articulation ostéoarthritique humaine du genou

Résumé

Les tissus primaires obtenus chez les patients après une arthroplastie totale du genou fournissent un modèle expérimental pour la recherche sur l’arthrose avec une translatabilité clinique maximale. Ce protocole décrit comment identifier, traiter et isoler l’ARN de sept tissus uniques du genou pour soutenir la recherche mécaniste dans l’arthrose humaine.

Résumé

L’arthrose (OA) est une maladie articulaire chronique et dégénérative qui affecte le plus souvent le genou. Comme il n’existe actuellement aucun remède, l’arthroplastie totale du genou (ATK) est une intervention chirurgicale courante. Des expériences utilisant des tissus d’arthrose humaine primaires obtenus à partir de TKA fournissent la capacité d’étudier les mécanismes de la maladie ex vivo. Alors que l’arthrose était auparavant considérée comme ayant un impact principalement sur le cartilage, on sait maintenant qu’elle affecte plusieurs tissus de l’articulation. Ce protocole décrit la sélection des patients, le traitement des échantillons, l’homogénéisation des tissus, l’extraction de l’ARN et le contrôle de la qualité (basé sur la pureté, l’intégrité et le rendement de l’ARN) de chacun des sept tissus uniques pour soutenir l’investigation du mécanisme de la maladie dans l’articulation du genou. Avec le consentement éclairé, des échantillons ont été prélevés sur des patients souffrant d’ATK pour l’arthrose. Les tissus ont été disséqués, lavés et stockés dans les 4 heures qui ont suivi la chirurgie par congélation éclair pour la fixation de l’ARN ou du form formel pour l’histologie. Les tissus prélevés comprenaient le cartilage articulaire, l’os sous-chondral, le ménisque, le coussinet adipeux infrapacellaire, le ligament croisé antérieur, la synoviale et le muscle oblique vastus medialis. Des protocoles d’extraction d’ARN ont été testés pour chaque type de tissu. La modification la plus importante concernait la méthode de désintégration utilisée pour les tissus durs à cellules basses et à matrice élevée (considérés comme cartilage, os et ménisque) par rapport aux tissus mous à cellules relativement hautes et à matrice basse (considérés comme coussinet adipeux, ligament, synoviale et muscle). Il a été constaté que la pulvérisation était appropriée pour les tissus durs et que l’homogénéisation était appropriée pour les tissus mous. Une propension de certains sujets à produire des valeurs de nombre d’intégrité de l’ARN (RIN) plus élevées que d’autres sujets de manière cohérente dans plusieurs tissus a été observée, suggérant que des facteurs sous-jacents tels que la gravité de la maladie peuvent avoir un impact sur la qualité de l’ARN. La capacité d’isoler de l’ARN de haute qualité à partir de tissus humains primaires d’arthrose fournit un modèle physiologiquement pertinent pour des expériences sophistiquées d’expression génique, y compris le séquençage, qui peuvent conduire à des connaissances cliniques qui sont plus facilement traduites pour les patients.

Introduction

Le genou est la plus grande articulation synoviale du corps humain, comprenant l’articulation tibofemorale entre le tibia et le fémur et l’articulation fémoro-patellaire entre la rotule et le fémur¹. Les os du genou sont tapissés de cartilage articulaire et soutenus par divers tissus conjonctifs, y compris les méniques, la graisse, les ligaments et les muscles, et une membrane synoviale encapsule toute l’articulation pour créer une cavité remplie de liquide synovial^1,2,3 ( Figure1). Un genou sain fonctionne comme une artic....

Protocole

Ce protocole d’étude a été approuvé et a suivi les lignes directrices institutionnelles établies par le Henry Ford Health System Institutional Review Board (CISR no 13995).

1. Sélection des patients

1. Identifiez les patients parmi ceux qui doivent subir une ATK avec un chirurgien orthopédiste.
2. Sélectionnez les patients en fonction des critères d’éligibilité définis par le protocole de l’étude. Des exemples de critères d’inclusion comprennent le fait d’être âgé de 18 ans ou plus et d’avoir un diagnostic confirmé d’arthrose du genou. Des exemples de critères d’exclusion comprennent le remplacement partiel du genou ou le fait....

Résultats

Sept tissus uniques de l’articulation du genou humain sont disponibles pour la collecte de patients souffrant d’ATK pour l’arthrose (Figure 1). Dans ce protocole, chacun de ces tissus a été identifié et traité dans les 4 heures suivant l’ablation chirurgicale (Figure 2). En suivant les étapes décrites à la figure 3,des parties de chaque tissu ont été fixées au for formel pour l’évaluation histologique (figure 4<.......

Discussion

Le protocole présenté s’est avéré efficace pour la collecte de sept tissus humains primaires d’arthrose pour l’extraction de l’ARN (Tableau 1) et le traitement histologique (Figure 4). Avant de prélever des échantillons de patients, il est nécessaire d’établir un protocole approuvé par la CISR, idéalement en collaboration avec un chirurgien ou une équipe chirurgicale. L’application d’un protocole normalisé pour le prélèvement d’échantillons (p. ex., résection à partir d’empl.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL	Eppendorf	05 402	Stériles, sans nucléases. Réservé aux travaux d’ARN uniquement.
10 % Formalin	Cardinal Health	C4320-101	Conserver dans l’armoire à produits chimiques lorsqu’il n’est pas utilisé.
100 % chloroforme (qualité biologie moléculaire)	Fisher Scientific	ICN19400290	Stérile, sans nucléases. Réservé au travail de l’ARN uniquement, stocker dans une armoire à produits chimiques lorsqu’il n’est pas utilisé.
100 % éthanol (qualité biologie moléculaire)	Fisher Scientific	BP2818500	Stérile, sans nucléases. Réservé au travail sur l’ARN uniquement, lors de la dilution, utilisez de l’eau sans DEPC/nucléase.
100 % isopropanol (qualité biologie moléculaire)	Fisher Scientific	AC327272500	Stérile, sans nucléases. Réservé au travail de l’ARN uniquement, stocker dans une armoire à produits chimiques lorsqu’il n’est pas utilisé.
100 % réactif alcool	Cardinal Health	C4305	Dilué à 70 % avec dH2O à des fins de nettoyage.
Boîtes de culture stériles de 15 cm	Thermo Scientific	12-556-003	Stériles, sans nucléases.
Tubes en polypropylène (Falcon) de 15 mL	Fisher Scientific	14 959 53A	Stériles, sans nucléases.
Flacons cryogéniques de 2 mL (filetés extérieurement)	Fisher Scientific	10 500 26	Stériles, sans nucléases.
Tubes à fond rond de 5 mL	Corning	352052	Stériles, sans nucléases. Réservé aux travaux d’ARN uniquement.
Tubes en polypropylène (Falcon) de 50 mL	Fisher Scientific	12 565 271	Stériles, sans nucléases.
Bioanalyseur	Agilent	G2939BA	pour la mesure de l’intégrité de l’ARN.
Armoire de biosécurité			général de laboratoire
Coupe-os	Fisher Scientific	08 990	Stérilisé avec 70 % d’EtOH.
Hotte	Équipement
Scalpels jetables (n° 10)	Thermo Scientific	3120032	Stériles, sans nucléases.
EDTA	Life Technologies	15-576-028	Solution à 10 % avec dH2O.
Forceps	Tout fournisseur		Stérilisé avec 70 % d’EtOH.
Glycoblue Coprecipitant	Fisher Scientific	AM9516	Réservé au travail sur l’ARN uniquement, stocker à -20 ° ;C.
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666
Azote liquide	Tout fournisseur
Azote liquide Dewar	Équipement
Mortier et pilon	Tout fournisseur		Réservé uniquement pour le travail sur l’ARN, stérilisé selon le protocole.
Spectrophotomètre Nanodrop	Thermo Scientific	ND-2000	Pour les mesures de pureté et de rendement de l’ARN.
Eau sans nucléases/traitée au DEPC	Fisher Scientific		Stérile, sans nucléases. Réservé aux travaux d’ARN uniquement.
PBS (stérile)	Gibco	20 012 050	Stérile, sans nucléases.
Pipettes (2 & micro ; L, 20 et micro ; L, 200 et micro ; L, 1000 et micro ; L) et pourboires	Tout fournisseur		Stérile, sans nucléases.
Plasma/Sérum Advanced miRNA kit	Qiagen	217204
Centrifugeuse réfrigérée 5810R	Eppendorf	22625101
RNAlater	Thermo Scientific	50 197 8158	Stérile, sans nucléases.
RNAse Away/RNAseZap	Fisher Scientific	7002
Spatule (taille semi-micro)	Tout fournisseur		Réservé uniquement pour le travail sur l’ARN.
Homogénéisateur de tissus	Pro Scientific	01-01200	Réservé uniquement au travail sur l’ARN, stérilisé selon le protocole.
Réactif TRIzol	Fisher Scientific	15 596 026	Stérile, sans nucléases. Réservé aux travaux d’ARN uniquement.

Équipement chimique général de laboratoirede laboratoire général