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Article de méthode

Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

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DOI :

10.3791/62727

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30 juin 2021

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1Department of Pathobiology, University of Guelph

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous fournissons ici une procédure détaillée pour la production à grande échelle de vecteurs AAV de qualité recherche en utilisant des cellules HEK 293 adhérentes cultivées dans des piles de cellules et la purification par chromatographie d’affinité. Ce protocole donne systématiquement >1 x 1013 génomes vectoriels/mL, fournissant des quantités vectorielles appropriées pour les études sur les grands animaux.

Résumé

Les vecteurs du virus adéno-associé (AAV) sont parmi les vecteurs de thérapie génique les plus avancés sur le plan clinique, avec trois thérapies géniques AAV approuvées pour les humains. L’avancement clinique de nouvelles applications pour l’AAV implique la transition de modèles de petits animaux, tels que des souris, à des modèles animaux plus grands, y compris des chiens, des moutons et des primates non humains. L’une des limites de l’administration d’AAV à des animaux plus gros est la nécessité de grandes quantités de virus à titre élevé. Bien que la culture cellulaire en suspension soit une méthode évolutive pour la production de vecteurs AAV, peu de laboratoires de recherche ont l’équipement (par exemple, les bioréacteurs) ou savent comment produire de l’AAV de cette manière. De plus, les titres AAV sont souvent significativement plus faibles lorsqu’ils sont produits dans des cellules HEK 293 en suspension par rapport aux cellules HEK293 adhérentes. Décrit ici est une méthode pour produire de grandes quantités d’AAV à titre élevé à l’aide de piles de cellules. Un protocole détaillé pour le titrage de l’AAV ainsi que des méthodes de validation de la pureté des vecteurs sont également décrits. Enfin, les résultats représentatifs de l’expression du transgène médiée par l’AAV dans un modèle ovin sont présentés. Ce protocole optimisé pour la production à grande échelle de vecteurs AAV dans les cellules adhérentes permettra aux laboratoires de biologie moléculaire de faire progresser les tests de leurs nouvelles thérapies AAV dans des modèles animaux plus grands.

Introduction

La thérapie génique utilisant des vecteurs de virus adéno-associés (AAV) a fait d’énormes progrès au cours des trois dernières décennies1,2. Les améliorations démontrées dans un large éventail de maladies génétiques, y compris la cécité congénitale, l’hémophilie et les maladies du système musculo-squelettique et du système nerveux central, ont amené la thérapie génique AAV à l’avant-garde de la recherche clinique3,4. En 2012, l’Agence européenne des médicaments (EMA) a approuvé Glybera, un vecteur AAV1 exprimant la lipoprotéine lipase (LPL) pour le traitement du déficit en LL, ce qui en fait la première autorisation de mise sur le marché pour un traitement de thérapie génique en Europe ou aux États-Unis5. Depuis lors, deux autres thérapies géniques AAV, Luxturna6 et Zolgensma7,ont reçu l’approbation de la FDA, et le marché devrait se développer rapidement au cours des 5 prochaines années avec jusqu’à 10-20 thérapies géniques attendues d’ici 20258. Les données cliniques disponibles indiquent que la thérapie génique AAV est une modalité sûre, bien tolérée et efficace, ce qui en fait l’un des vecteurs viraux les plus prometteurs, avec plus de 244 essais cliniques impliquant AAV enregistrés auprès de ClinicalTrials.gov. L’intérêt croissant pour les applications cliniques impliquant des vecteurs AAV nécessite des méthodes de production robustes et évolutives pour faciliter l’évaluation des thérapies AAV dans de grands modèles animaux, car il s’agit d’une étape critique dans le pipeline translationnel9.

Pour la production de vecteurs AAV, les deux principales exigences sont le génome AAV et la capside. Le génome de l’AAV de type sauvage (wt)-AAV est de l’ADN simple brin d’environ 4,7 kb de longueur10. Le génome wt-AAV comprend des répétitions terminales inversées (ITR) trouvées aux deux extrémités du génome, qui sont importantes pour l’emballage, et les gènes rep et cap 11. Les gènes rep et cap, nécessaires à la réplication du génome, à l’assemblage de la capside virale et à l’encapsulation du génome dans la capside virale, sont retirés du génome viral et fournis en trans pour la production de vecteurs AAV12. Le retrait de ces gènes du génome viral laisse place à des transgènes thérapeutiques et à tous les éléments régulateurs nécessaires, y compris le promoteur et le signal polyA. Les RTI restent dans le génome du vecteur pour assurer une réplication correcte du génome et une encapsulation virale13,14. Pour améliorer la cinétique de l’expression transgénique, les génomes des vecteurs AAV peuvent être conçus pour être auto-complémentaires, ce qui atténue le besoin de conversion de la conversion de l’ADN simple brin en double brin pendant la réplication du génome AAV, mais réduit la capacité de codage à ~ 2,4 kb15.

Au-delà de la conception du génome AAV, la sélection du sérotype de capside détermine le tropisme tissulaire et cellulaire du vecteur AAV in vivo2. En plus du tropisme tissulaire, il a été démontré que différents sérotypes AAV présentent une cinétique d’expression génique différente16. Par exemple, Zincarelli et coll.17 ont classé différents sérotypes AAV en sérotypes à faible expression (AAV2, 3, 4, 5), sérotypes à expression modérée (AAV1, 6, 8) et sérotypes à expression élevée (AAV7 et 9). Ils ont également classé les sérotypes AAV en expression lente (AAV2, 3, 4, 5) ou expression à apparition rapide (AAV1, 6, 7, 8 et 9). Ces tropismes divergents et la cinétique d’expression des gènes sont dus aux variations des acides aminés dans les protéines de la capside, aux formations de protéines de la capside et aux interactions avec les récepteurs/corécepteurs de la cellule hôte18. Certaines capsides AAV ont des caractéristiques bénéfiques supplémentaires telles que la capacité de traverser la barrière hémato-encéphalique après administration intravasculaire (AAV9) ou résident dans des cellules musculaires à longue durée de vie pour une expression transgénique durable (AAV6, 6.2FF, 8 et9) 19,20.

Cet article vise à détailler une méthode rentable pour produire des vecteurs AAV de haute pureté, à haut titre et de qualité recherche pour une utilisation dans des modèles précliniques de grands animaux. La production d’AAV à l’aide de ce protocole est réalisée par transfection à double plasmide dans des cellules adhérentes du rein embryonnaire humain (HEK)293 cultivées dans des piles cellulaires. En outre, l’étude décrit un protocole pour la purification par chromatographie d’affinité du sulfate d’héparine, qui peut être utilisé pour les sérotypes AAV qui contiennent des domaines de liaison à l’héparine, y compris AAV2, 3, 6, 6.2FF, 13 et DJ21,22.

Un certain nombre de systèmes d’emballage sont disponibles pour la production de vecteurs AAV. Parmi ceux-ci, l’utilisation d’un système de co-transfection à deux plasmides, dans lequel les gènes Rep et Cap et les gènes auxiliaires Ad (E1A, E1B55K, E2A, E4orf6 et ARN VA) sont contenus dans un plasmide (pHelper), présente certains avantages pratiques par rapport à la méthode de transfection commune à trois plasmides (triple), y compris un coût réduit pour la production de plasmides23,24 . Le plasmide du génome AAV contenant la cassette d’expression du transgène (pTransgene) doit être flanqué de RTI et ne doit pas dépasser ~4,7 kb de longueur. Le titre et la pureté des vecteurs peuvent être affectés par le transgène en raison des effets cytotoxiques potentiels pendant la transfection. L’évaluation de la pureté du vecteur est décrite ici. Les vecteurs produits à l’aide de cette méthode, qui donnent un 1 x10 13 vg/mL pour chacun, ont été évalués chez des souris, des hamsters et des modèles animaux ovins.

Tableau 1 : Composition des solutions requises. Informations nécessaires, y compris les pourcentages et les volumes, des composants nécessaires pour diverses solutions tout au long du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

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Protocole

1. Double transfection plasmidique des cellules HEK293 dans des piles cellulaires

  1. Décongeler un cryo-flacon de cellules HEK293 dans un bain de billes fixé à 37 °C.
    REMARQUE: Préchauffez le DMEM complet à 37 ° C pendant que les cellules décongèlent pour s’assurer que la température froide ne choque pas les cellules lors du placage. Assurez-vous que les cellules ont un faible nombre de passage, idéalement inférieur à 20, pour assurer une croissance et une efficacité de transfection optimales. Assurez-vous que les cellules sont certifiées exemptes de mycoplasmes.
  2. Transférer le contenu du cryo-flacon goutte à goutte dans un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de DMEM complet préchauffé et centrifuger les cellules à 500 x g pendant 5 min.
  3. Aspirer le milieu, puis remettre en suspension les cellules HEK293 dans 20 mL de DMEM complet préchauffé. Ensemencez les cellules dans une plaque de 15 cm et incubez à 37 °C, avec 5% de CO2.
  4. Divisez les cellules d’une plaque de 15 cm en trois pour les ensemencer dans la chambre de culture cellulaire.
    1. Une fois que les cellules sont confluentes à 80%, aspirez le milieu et lavez doucement la plaque avec 3 mL de PBS pour ne pas perturber la monocouche. Ensuite, aspirez le PBS et ajoutez 3 mL de trypsine.
    2. Incuber pendant 2 min à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se soulèvent de la plaque, puis neutraliser la trypsine en ajoutant 7 mL de DMEM complet à la plaque.
    3. Recueillir tous les milieux et cellules dans un tube de 15 mL et granuler les cellules en les centrifugant à 500 x g pendant 5 min.
    4. Aspirer le surnageant du tube de 15 mL et remettre en suspension la pastille de cellule dans 3 mL de DMEM complet. Ajouter 1 mL à chaque plaque de 15 cm contenant 20 mL de DMEM complet; bercer doucement les plaques pour répartir uniformément les cellules, et incuber à 37 °C, avec 5% de CO2.
  5. Une fois que les cellules sont confluentes à 80 %, répétez les étapes 1.4.1 et 1.4.2. Recueillir le surnageant dans des tubes coniques de 50 mL et inverser doucement le tube pour s’assurer que les cellules sont homogènes.
  6. Déterminer la densité cellulaire en mélangeant 10 μL d’échantillons de cellules avec 10 μL de bleu de trypan et en ajoutant le mélange à une lame de comptage de cellules pour analyse dans le compteur de cellules.
  7. Mélanger 1 L de DMEM complet préchauffé avec la suspension cellulaire nécessaire pour ensemencer la chambre de culture cellulaire (surface de 6360 cm2)avec 1 x 104 cellules/cm2. Versez le mélange cellulaire dans la chambre de culture cellulaire et faites pivoter doucement pour répartir uniformément les cellules sur chaque monocouche(Figure 1)et incuber à 37 °C, avec 5 % de CO2.
  8. En plus de la chambre de culture cellulaire, plaquez une plaque de 15 cm avec 1 x 104 cellules/cm2 comme référence pour la confluence.
  9. Après ~65-h d’incubation, vérifiez la confluence sur la plaque de référence - idéalement ~ 80% -90% confluent.
    REMARQUE: Préchauffez le DMEM complet pour l’ajouter à la chambre de culture cellulaire à 37 ° C.

figure-protocol-1
Figure 1: Manœuvre de la pile cellulaire pour l’ensemencement et la transfection des cellules. Pour l’empilement de cellules d’ensemencement, commencez par retirer l’un des bouchons d’aération et versez 1 L de DMEM complet préchauffé avec la quantité nécessaire de cellules HEK293 (A). Répartissez uniformément les cellules et les supports en resserrant les deux bouchons d’évent et amenez tous les supports au coin de la pile de cellules avec l’un des capuchons d’évent et placez-le dans ce coin (B), placez la pile de cellules sur le côté (C), puis tournez la pile de cellules à 90 ° (D) afin que les ports d’évent soient vers le haut (E). Abaissez doucement la pile de cellules à sa position horizontale normale et assurez-vous que toutes les chambres de la pile de cellules sont complètement recouvertes de support (F). Lors de la transfectation, dévissez les deux bouchons d’évent et versez lentement les vieux milieux dans un conteneur à déchets stérile pour un écoulement uniforme afin de ne pas perturber la monocouche des cellules (G). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Préparer un mélange de polyéthylèneimine (PEI)/ADN à un rapport de concentration de 3:1 (p/p).
    1. Préparez le mélange d’ADN dans un tube conique de 50 mL en ajoutant 475 μg de pTrangene et 1425 μg de pHelper à 40 mL de milieu à sérum réduit pour créer un rapport 3:1 de pHelper:pTrangene.
      REMARQUE : Le calculateur de mélange PEI/ADN se trouve au tableau 2.
    2. Ajouter 5,7 mL d’Î.-P.-É. (1 g/L) au milieu sérique réduit et au mélange d’ADN goutte à goutte. Ensuite, vortexz brièvement et incubez pendant 10 min à température ambiante.
      REMARQUE: Lorsque PEI / ADN incube à température ambiante, il deviendra légèrement trouble.
  2. Après 8 min d’incubation de l’Î.-P.-É./ADN, retirez le milieu de la chambre de culture cellulaire.
    REMARQUE: Assurez-vous de desserrer les deux capuchons orange pour maintenir un flux fluide de milieu afin d’éviter le délogement des cellules.
  3. Ajouter PEI/ADN à 1 L de DMEM complet préchauffé et verser lentement le mélange dans le port de la chambre de culture cellulaire. Répartir uniformément le liquide sur toutes les rangées(Figure 1)et incuber pendant 72 h à 37 °C, avec 5 % de CO2.

2 Récolte de l’AAV et lyse chimique des cellules HEK293 transfectées

  1. Agiter vigoureusement la chambre de culture cellulaire pour déloger les cellules jusqu’à ce que le milieu semble trouble des cellules délogées et verser dans quatre tubes centrifuges de 500 mL.
  2. Centrifugez les tubes à 18 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour granuler les cellules. Versez le surnageant clarifié dans un flacon de copolyester de polyéthylène téréphtalate (PETG) de 1 L.
    REMARQUE: Si l’on n’a pas accès à une centrifugeuse à grande vitesse, centrifuger à 12 000 x g pendant 40 min. Les cellules granulées peuvent ne pas être solides à cette vitesse et glisseront comme déversant un surnageant.
  3. Remettre en suspension les pastilles de cellule dans des tubes centrifuges de 500 mL avec 50 mL de tampon de lyse et incuber pendant 60 min à 37 °C.
  4. Centrifugez les tubes à 18 000 x g pendant 30 min, puis transférez le surnageant dans la même bouteille PETG de 1 L. Jetez les débris cellulaires granulés.
    REMARQUE: Purifier immédiatement le surnageant clarifié et conserver à 4 °C jusqu’à 72 h. Pour un stockage à plus long terme, conserver à -80 °C. Ne pas conserver à -20 °C.

3 Purification vectorielle AAV par chromatographie d’affinité de l’héparine

  1. Retirer le lysat brut de -80 °C et laisser à 4 °C pendant la nuit pour décongeler. Une fois décongelé, utilisez un filtre de 0,22 μM pour filtrer le lysat brut.
  2. Pour passiver le concentrateur centrifuge, ajouter 4 mL de tampon de prétraitement du filtre à un concentrateur centrifuge pour chaque colonne d’héparine sépharose utilisée. Passivate le concentrateur centrifuge à température ambiante pendant 2-8 h. Mettez en place la passivation immédiatement avant les étapes de purification.
  3. Installez le tube et la pompe (Figure 2).
    1. Placez le tube dans une pompe péristaltique et faites fonctionner 20 mL de 1 M NaOH. Ensuite, faites couler 50 mL d’eau de qualité moléculaire, puis exécutez 50 mL de DMEM basal.
    2. Fixez une colonne d’héparine sépharose de 5 mL au tube et faites couler 25 mL de DMEM basal pour éliminer l’agent de conservation.
  4. Faire passer 0,2 μM de lysat brut filtré à travers la colonne à un débit de 1 à 2 gouttes/s.

figure-protocol-2
Figure 2: Mise en place d’une pompe péristaltique pour la purification de l’AAV. Faites passer le tube du lysat brut à travers la pompe péristaltique et dans la colonne de la matrice d’héparine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

REMARQUE: Assurez-vous de ne pas introduire de bulles ou de laisser la colonne sécher, car cela compromettrait la colonne et empêcherait l’élution de l’AAV. Jetez la colonne si elle est sèche et utilisez une nouvelle colonne pour le reste du lysat brut.

  1. Chargez tout le lysat brut sur la colonne d’héparine et utilisez les solutions suivantes pour laver la colonne.
    1. Laver à l’aide de 50 mL de 1x Hank’s Balanced Salt Solutions (HBSS) sans Mg2+ et Ca2+.
    2. Laver à l’aide de 15 mL de 0,5 % de N-Lauroylsarcosine dans HBSS sans Mg2+ et Ca2+.
    3. Laver à l’aide de 50 mL de HBSS sans Mg2+ et Ca2+.
    4. Laver à l’aide de 50 mL de HBSS avec Mg2+ et Ca2+
    5. Laver à l’aide de 50 mL de 200 mM de NaCl/HBSS avec Mg2+ et Ca2+.
    6. Éluez 5 x 5 mL (25 mL au total) avec 300 mM de NaCl/HBSS avec Mg2+ et Ca2+ et étiquetez les élutions comme E1-E5 (chaque élution est de 5 mL).
  2. Concentration du virus à l’aide d’un concentrateur centrifuge
    1. Faire tourner le concentrateur centrifuge contenant le tampon de prétraitement à 900 x g pendant 2 min. Jetez le flux.
    2. Laver le filtre du concentrateur centrifuge avec 4 mL de HBSS avec Mg2+ et Ca2+ et centrifuger à 1000 x g pendant 2 min; jeter le flux traversant.
    3. Ajouter l’élution E2 au concentrateur centrifuge. Tourner à 1000 x g pendant 5 min et jeter le flux.
    4. Terminez l’ajout de E2, puis ajoutez E3 au concentrateur centrifuge et faites tourner à 1000 x g pendant 5 min jusqu’à ce que le virus concentré soit d’environ 1 mL.
      REMARQUE: Évitez de centrifuger le vecteur de manière à ce que le volume soit inférieur au niveau du filtre. Ne concentrez pas E1, E4 ou E5 dans le concentrateur centrifuge, car ils contiennent très peu ou pas de vecteur et contiennent des contaminants.
    5. Retirez le virus concentré du concentrateur centrifuge à l’aide d’une pointe filtrée p200 et placez-le dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 mL.
    6. Rincez le concentrateur centrifuge avec 200 μL de HBSS avec Mg2+ et Ca2+ pour déloger tout AAV restant du filtre. Pipettez vigoureusement de haut en bas plusieurs fois (pendant environ 30 s) pour déloger tout virus adhérant à la membrane et placez-le dans le tube centrifuge de 1,5 mL avec le reste du virus. Mélangez bien le tube.
    7. Aliquote 5 μL pour les extractions d’ADN et stocker le vecteur purifié à -80 °C.
  3. Laver la colonne à l’aide de 25 mL de 2 M de NaCl. De plus, utilisez 25 mL de Triton X-100 à 0,1 %, préchauffé à 37 °C pour laver la colonne. Ensuite, lavez la colonne à l’aide de 50 mL de dH2O stérile, puis lavez à l’aide de 25 mL d’éthanol à 20 %.
  4. Assurez-vous que la membrane de la colonne est complètement saturée en éthanol à 20%, car il s’agit de la solution de stockage. Scellez la colonne avec des bouchons fournis et conservez-la à 4 °C.
  5. Conservez le tube dans 1 M NaOH.
    REMARQUE: Si elles sont nettoyées correctement, les colonnes d’héparine sépharose peuvent être réutilisées jusqu’à cinq fois.

4 Extraction d’ADN génomique AAV

  1. Préparer le mélange réactionnel mentionné dans le tableau 3 dans un tube PCR pour le traitement par DNase.
ComposantVolume
Vecteur AAV purifié5 μL
10x Tampon DNase2 μL
DNase1 μL
ddH2O12 μL
Final Volume20 μL

Tableau 3 : Formule du mélange maître du traitement À la DNase. Composants et volumes recommandés requis pour le traitement par DNase des vecteurs viraux AAV lors de l’extraction de l’ADN.

  1. Vortex le tube PCR pour mélanger et pulser le tube PCR pour faire tourner le contenu.
  2. À l’aide d’un thermocycleur, incuber à 37 °C pendant 20 min suivi de 75 °C pendant 15 min pour inactiver la DNase à la chaleur.
  3. Ajouter 5 μL de protéinase K.
  4. À l’aide d’un thermocycleur, incuber à 50 °C pendant 60 min, puis à 95 °C pendant 30 min pour inactiver à chaud la protéinase K.
  5. Utilisez un kit de nettoyage de l’ADN pour éliminer les contaminants potentiels.
    REMARQUE: Cette étape a été effectuée à l’aide d’un kit de nettoyage du sang et des tissus disponible dans le commerce (Table des matériaux).
    1. Ajouter 200 μL de tampon AL (kit de nettoyage du sang et des tissus, table des matériaux)au tube PCR contenant le vecteur traité DNase/Protéinase K.
    2. Vortex le tube PCR et incubation à 56 °C pendant 10 min dans un thermocycleur.
    3. Pipettez le liquide du tube PCR dans une colonne de spin stérile située dans un tube de collecte.
    4. Ajouter 200 μL d’éthanol à 100 % à la colonne et bien mélanger par vortex.
    5. Centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min et jeter le flux à travers.
    6. Ajouter 500 μL de tampon AW1 (Kit de nettoyage du sang et des tissus, Table des matériaux)à la colonne de rotation.
    7. Centrifuger à 6 000 x g pendant 1 min et jeter le flux à travers.
    8. Ajouter 500 μL de tampon AW2 (kit de nettoyage du sang et des tissus, table des matériaux)à la colonne de rotation.
    9. Centrifuger à 15 000 x g pendant 3 min et jeter le flux à travers.
    10. Placez la colonne de spin dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 mL et ajoutez 200 μL de tampon AE (kit de nettoyage du sang et des tissus, table des matériaux)directement à la membrane de la colonne de spin.
    11. Incuber à température ambiante pendant 1 min.
    12. Centrifuger à 6 000 x gpendant 1 min pour éluer l’ADN.
    13. Conservez l’ADN à -20 °C.

5 Titrage des génomes des vecteurs AAV à l’aide d’une réaction en chaîne quantitative par polymérase et d’une sonde Simian Virus 40 (SV40)

REMARQUE: Effectuez tous les travaux de qPCR dans une hotte PCR à l’aide d’embouts de pipette filtrés pour éviter la contamination externe de l’ADN. Si le génome AAV ne code pas une séquence SV40 polyA, utiliser une sonde contre l’ITR décrit ailleurs25. Assurez-vous que l’ADN plasmidique sélectionné comme standard contient une séquence de polyA SV40.

  1. Préparation standard du stock
    1. Diluer l’étalon d’ADN plasmidique stock (plasmide pTransgene contenant la séquence SV40 polyA) à une concentration finale de 10 μg/μL et conserver à -20 °C dans des aliquotes de 6 μL.
    2. Déterminez le nombre de copies présentes dans la norme d’ADN plasmidique à l’aide de la calculatrice en ligne suivante26.
      REMARQUE: Utilisez un ADN plasmidique utilisé pour la norme produite par un fournisseur commercial pour assurer la qualité et la concentration correcte. Préparer une grande quantité de norme (p. ex., 10 ml) pour mener des études de transition lors de la transition vers une norme nouvellement préparée.
  2. Préparer le mélange de réactifs suivant mentionné dans le tableau 4 pour les échantillons et l’étalon dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
    REMARQUE: Préparez un excès suffisant du mélange principal. Voir le tableau 5 pour les séquences amorce/sonde.
ComposantVolume
Mixage maître universel qPCR (2X)10 μL
Eau de qualité moléculaire4,5 μL
40x SV40 polyA apprêt/sonde0,5 μL
Final Volume15 μL

Tableau 4 : Mélange maître qPCR pour le titrage AAV. Composants et volumes recommandés requis pour la qPCR de l’ADN extrait des vecteurs viraux AAV.

ComposantSéquence
Amorce avant5'-AGCAATAGCATCACAAATTTCACAA-3'
Amorce inversée5'-CCAGACATGATAAGATACATTGATGAGTT-3'
Sonde/56-FAM/AGCATTTTT/Zen/TTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTC/3IABkFQ

Tableau 5 : Séquences d’amorce par rapport à la séquence d’ADN polyA SV40. Séquences des amorces et de la sonde utilisées pour le titrage qPCR, qui se lient à des zones spécifiques de vecteurs viraux AAV contenant la séquence SV40 polyA.

  1. Pipette le mélange principal de haut en bas pour mélanger.
  2. Installez la plaque de dilution.
    1. Utilisez une plaque transparente de 96 puits pour préparer les dilutions étalons et d’échantillons, ajoutez 45 μL d’eau de qualité moléculaire à chaque puits dans une colonne sur deux en commençant par la colonne 1 (colonnes 1, 3, 5, 7, 9 et 11).
    2. Ajouter 5 μL de l’étalon au puits A1 et pipette pour mélanger.
    3. Utilisez une nouvelle pointe de pipette filtrée pour créer une dilution de 1/10 du puits A1 à B1.
    4. Continuez une série de dilutions 10 fois le long de la colonne jusqu’à ce qu’elles atteignent G1.
    5. N’ajoutez pas à H1, car cela agira comme un contrôle négatif.
    6. Appliquer le premier échantillon (S1) en l’ajoutant au puits A3, formant une dilution de 1/10. Pipette ce mélange et transfert de 5 μL au puits B3. Jetez l’embout de la pipette après ce transfert.
    7. Avec une nouvelle pointe de pipette, mélanger la solution dans le puits B3 et former une dilution de 1/100. Transférer 5 μL de ce mélange dans le puits C3 et jeter la pointe après le transfert.
    8. Avec une nouvelle pointe de pipette, pipettez de haut en bas la solution dans le puits C3 pour obtenir une dilution de 1/1000. Jetez la pointe.
    9. Continuez à diluer les échantillons sans ajouter d’échantillons aux colonnes 2, 4, 6, 8, 10 ou 12.
    10. Une fois tous les échantillons dilués, mélanger le contenu dans les puits de la colonne 1, puis transférer 20 μL dans la colonne 2.
    11. Répétez cette opération pour les colonnes 3, 5, 7, 9 et 11 afin de créer des répétitions de chaque dilution d’étalon et d’échantillon. Reportez-vous à la figure 3 pour la disposition des plaques.
      REMARQUE: Après la mise en place de la plaque à la figure 3,les échantillons dilués dans les rangées G et H n’auront que 1/10 et 1/100 dilutions.

figure-protocol-3
Figure 3: Disposition des plaques pour le titrage qPCR AAV. Le bleu indique l’emplacement de la dilution en série de l’étalon; le vert indique l’emplacement du témoin négatif; le violet indique l’emplacement de la dilution des échantillons. Chaque standard, négatif ou échantillon est ajouté en réplique. Un exemple de concentration de l’étalon a été ajouté pour montrer la série de dilution de l’étalon, et le placement des dilutions d’échantillon a été ajouté à leurs puits respectifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Titrage par qPCR basée sur la détection SV40 polyA
    1. Ajouter 15 μL de mélange maître qPCR à chaque puits d’une plaque qPCR à 96 puits à semi-jupe blanche.
    2. Transférer 5 μL de chaque échantillon de la plaque transparente de 96 puits vers la plaque qPCR à 96 puits à semi-jupe blanche.
    3. Utilisez une pipette multicanal pour assurer un mélange adéquat du mélange maître qPCR et de l’échantillon.
    4. Scellez la plaque avec un film d’étanchéité et centrifugez la plaque qPCR à 1500 x g pendant 30 s.
    5. Exécutez la réaction qPCR sur un instrument d’amplification et de détection PCR en temps réel sur plaque, en utilisant les conditions suggérées dans le tableau 6.
SectionCyclesHeureTempératureDescription
Pré-incubation1x5 min95 °CDénaturation de l’ADN.
Amplification38x15 s95 °CAmplification de l’ADN. Les paramètres peuvent être modifiés si vous utilisez d’autres apprêts avec des températures de recuit différentes.
60 s60 °C
Refroidissement1x60 s40 °CRefroidissement des plaques. Fin de la course.

Tableau 6 : Protocole de thermocycleur pour le titrage qPCR à base de sonde d’hydrolyse. Protocole de thermocycleur recommandé pour l’utilisation du titrage qPCR à base de sonde des vecteurs AAV purifiés extraits par ADN.

REMARQUE : Pour la feuille de calcul du titrage qPCR AAV, voir le tableau 7.

  1. Analyse des données pour déterminer le nombre de copies du génome AAV.
    1. Remplissez les cellules de données de la feuille de calcul (tableau 7A) avec les valeurs de concentration obtenues à partir de l’exécution de la qPCR pour les dilutions standard et d’échantillon.
    2. Utiliser les valeurs de concentration du tableau 7A pour produire une courbe standard (tableau 7B).
      REMARQUE: La courbe standard sera représentée sous la forme d’un logarithme naturel (y = a ln(x) + b) avec l’efficacité R2. Une courbe standard doit avoir un rendement proche de 100 % etR2 proche de 1,0 (≥0,99).
    3. Remplissez l’efficacité de la pente en remplissant ce calculateur en ligne27.
      REMARQUE: Une efficacité comprise entre 90% et 110% est acceptable. Si l’efficacité de la qPCR est en dehors de cette plage, réexécutez la qPCR.
    4. Utiliser les valeurs de concentration du tableau 7A pour faire la moyenne des dilutions de chaque échantillon et déterminer l’écart-type de chaque échantillon (tableau 7C).
      REMARQUE : Exclure les dilutions des échantillons qui sont inférieures de plus d’un écart-type à la moyenne des dilutions de l’échantillon.
    5. En utilisant la concentration moyenne de chaque dilution, multipliez par le facteur de dilution, puis divisez par cinq pour obtenir les génomes vectoriels (vg)/μL de chaque échantillon (Tableau 7C).
    6. Calculer le vg/mL de chaque échantillon en multipliant la moyenne des concentrations de chaque échantillon par 80 000(tableau 7C).
    7. Faire la moyenne du vg/mL de chaque dilution pour produire le vg/mL final de chaque échantillon (Tableau 7C).
      REMARQUE: L’utilisateur doit diviser la concentration moyenne de chaque dilution par un facteur cinq pour tenir compte des 5 μL chargés dans chaque puits pour l’essai de qPCR afin de produire la concentration en vg/μL. Le facteur de 80 000 explique la transition de la valeur moyenne de concentration de chaque échantillon à vg/mL. Tout d’abord, la moyenne de la valeur de concentration de chaque échantillon doit être multipliée par 2 pour tenir compte des génomes monocaténaires, car l’ensemble de sondes d’amorce ne quantifie que l’ADN simple brin (ADNSs) à sens positif, et le génome de l’AAV existe dans un rapport approximatif de 1: 1 entre l’ADNSs positif et négatif25,28. La moyenne de la valeur de concentration de chaque échantillon doit être multipliée x40 pour tenir compte de la dilution de l’échantillon de 5 μL de vecteur purifié (section 4.1) à 200 μL d’ADN extrait (section 4.6.12). Enfin, la moyenne de la valeur de concentration de chaque échantillon doit être multipliée x1000 pour passer de vg/μL à vg/mL.

6 Évaluation de la qualité et de la pureté des vecteurs

  1. Contrôle de la qualité - Western Blot
    1. Préparez un gel SDS PAGE à 12%.
    2. Effectuer l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide.
      REMARQUE: Chargez 6 x 1010 vg d’échantillons par puits.
    3. Transférer les protéines dans la membrane du difluorure de polyvinylidène (PVDF).
    4. Blocage de la membrane PVDF
      1. Retirez la membrane de l’appareil de transfert et rincez à 0,1 % de PBST pour éliminer l’acrylamide en vrac.
      2. Placer la membrane dans une solution bloquante pendant au moins 1 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 °C.
        REMARQUE: Le tampon bloquant peut être complété par du sérum de chèvre à 2%.
    5. Incubation avec anticorps primaire
      1. Décantez le tampon bloquant et ajoutez l’anticorps primaire, un anticorps monoclonal anti-AAV de souris à une dilution de 1:200.
      2. Incuber toute la nuit à 4 °C.
      3. Décantez l’anticorps primaire et lavez cinq fois avec 0,1% de PBST pendant 5 min à température ambiante avec agitation.
    6. Incubation avec anticorps secondaires
      1. Décanter la solution de lavage et ajouter l’anticorps secondaire conjugué HRP, dilué à 1:7500 dans un tampon bloquant, et incuber pendant 1 h à température ambiante avec agitation.
      2. Décanter l’anticorps secondaire et laver cinq fois avec 0,1% pbST pendant 5 min à température ambiante avec agitation.
      3. Effectuez un lavage final avec PBS à température ambiante avec agitation.
    7. Détectez les protéines à l’aide d’un substrat chimiluminescent amélioré (ECL).
    8. Imagez le gel pour visualiser les protéines virales (sous-unités VP1, VP2 et VP3) (Figure 4).

figure-protocol-4
Figure 4: Transfert western montrant les protéines de la capside AAV. Voie A; Échelle MW, voie B; AAV6.2FF-hIgG01, voie C; AAV6.2FF-hIgG02, voie D; AAV6.2FF-hIgG03 et voie E; AAV6.2FF-hIgG04. 6 x 1010 vg de chaque AAV6.2FF-hIgG ont été chargés dans leurs voies respectives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Contrôle de la pureté - SDS PAGE et Coomassie Stain
    1. Préparer le gel et les échantillons de FDS-PAGE comme décrit aux étapes 6.1.1 et 6.1.2.
    2. Fixez le gel dans une solution de fixation pendant 1 h ou pendant la nuit avec une agitation douce. Changez la solution de fixation une fois au cours de la première heure.
    3. Tacher le gel dans une solution de coloration pendant 2-4 h avec une agitation douce.
    4. Détachez le gel avec une solution décolorante. Reconstituez la solution de déscoloration plusieurs fois jusqu’à ce que le fond du gel soit complètement coloré (4-24 h).
    5. Conservez le gel coloré dans une solution de stockage.
    6. Imagez le gel pour visualiser toutes les protéines colorées par la solution de coloration coomassie.

figure-protocol-5
Figure 5: Gel teinté de Coomassie. Voie A; Échelle MW, voie B; AAV6.2FF-hIgG01, voie C; AAV6.2FF-hIgG02, voie D; AAV6.2FF-hIgG03, voie E; AAV6.2FF-hIgG04, voie F; AAV6.2FF-hIgG05 et Lane G; AAV6.2FF-hIgG06. 6 x 1010 vg de chaque AAV6.2FF-hIgG ont été chargés dans leurs voies respectives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Test alternatif de contrôle de la pureté - HEK293 détection de protéine de la cellule hôte ELISA
    1. Effectuez la détection de la protéine de la cellule hôte HEK293 via ELISA conformément aux instructions du fabricant.
      REMARQUE: Utilisez des dilutions de 5 x 10-2 et 1 x 10-3 pour les échantillons de rAV purifiés. Une fois que la TMB est ajoutée au puits, incuber à l’abri de la lumière. La régression linéaire ne peut pas être utilisée pour analyser les résultats.
    2. Effectuer une analyse point à point, une spline cubique ou une méthode d’ajustement logistique à quatre paramètres pour interpoler les concentrations d’inconnues et multiplier par le facteur de dilution afin de déterminer la concentration de l’échantillon d’origine.

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Résultats

La traduction de modèles de petits rongeurs en modèles animaux plus grands et l’application clinique éventuelle présentent un défi important en raison de la grande quantité d’AAV nécessaire pour transduire de plus gros animaux et obtenir des effets thérapeutiques. Pour comparer l’efficacité de transduction de la capside AAV6.2FF rationnellement conçue, précédemment démontrée une augmentation de 101 fois de l’efficacité de transduction dans les cellules musculaires murines par rapport à AAV63,des s...

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Discussion

La production de vecteurs AAV recombinants (rAAV) décrits dans cet article utilise des matériaux, des réactifs et de l’équipement courants trouvés dans la majorité des laboratoires et des installations de recherche en biologie moléculaire. Cet article permet au lecteur de produire des rAAV in vitro et in vivo de haute qualité. Surtout, ce protocole de production de rAAV, par rapport à des protocoles plus fastidieux impliquant la purification du chlorure de césium, est efficace et évite l’utilisation de ...

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Déclarations de divulgation

Sarah K. Wootton est l’inventrice d’un brevet américain US10806802B2 pour la capside AAV6.2FF.

Remerciements

Amira D. Rghei, Brenna A. Y. Stevens, Sylvia P. Thomas et Jacob G. E. Yates ont reçu des bourses d’études supérieures de l’Ontario Veterinary College ainsi que des bourses d’études supérieures de l’Ontario. Amira D. Rghei a reçu une bourse d’études Mitacs Accelerate. Ces travaux ont été financés par la subvention de projet des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) (no 66009) et une subvention de projets de recherche en santé concertée (partenariat avec le CRSNG) (no 433339) à SKW.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,22 &mu ; m filterMillipore SigmaS2GPU05RE
0,25 % TrypsineFisher ScientificSM2001C
1-ButanolThermo Fisher ScientificA399-4ATTENTION. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter des gants
10 chambres pile de cellulesCorning3271
Bouteille PETG 1LThermo Fisher Scientific2019-1000
30 % Acrylamide/Bis SolutionBio-Rad1610158
Plaque à jupe 96 puitsFroggaBioFS-96
Joints de plaque adhésiveThermo Fisher Scientific08-408-240
Persulfate d’ammonium (APS)Bio-Rad161-0700MISE EN GARDE. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter des gants
Kit de nettoyage du sang et des tissusQiagen69506utiliser pour le nettoyage de l’ADN dans la section 4.6 du protocole
Bleu de bromophénolFisher ScientificB392-5ATTENTION. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter des gants
Boîtes de culture cellulaireGreiner bio-one7000232plaques de 15 cm
Culture Tube coniqueThermo Fisher Scientific339650Tube conique de 15 mL
Culture Tube coniqueFisher Scientific14955240Tube conique de 50 mL
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) avec 1000 mg/L de D-glucose, L-glutamineCytiva Life SciencesSH30022.01
ECL Western Blot SubstratThermo Fisher Scientific32209
ÉthanolGreenfieldP016EA95Diluer l’alcool éthylique (95 % vol) à 20 % pour la section 3.7.4 et 70 % pour la section 6.1.1.1
Sérum de veau fœtal (FBS)Thermo Fisher ScientificSH30396.03
Acide acétique glacialFisherScientific A38-500PRUDENCE. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter des gants
GlycérolFisher ScientificBP229-1
GlycineFisher ScientificBP381-500
HBSS avec Mg2+ et Ca2+Thermo Fisher ScientificSH302268.02
HBSS sans Mg2+ et Ca2+Thermo Fisher ScientificSH30588.02
Cellules HEK293American Tissue Culture CollectionCRL-1573À la réception, décongeler les cellules et la culture comme décrit dans le fabricant' . Une fois que les cellules ont été peu circulées et qu’elles se développent bien, congelez une sous-fraction pour l’avenir dans des aliquotes et stockez-la dans de l’azote liquide. Utilisez toujours les cellules situées en dessous du numéro de passage 30. Une fois que les cellules cultivées ont été passées plus de 30 fois, il est recommandé de redémarrer une culture à partir des aliquotes stockées
ELISA de protéine de cellule hôte HEK293Cygnus TechnologiesF650S Instructions pour la colonne de
sulfate d’héparineCytiva Life Sciences17040703
KimwipeThermo Fisher ScientificKC34120
  ; L-glutamine (200 mM)Thermo Fisher ScientificSH30034.02
Coussin de support pour tube de centrifugeuse grand volumeCorningCLS431124Le coussin de support doit être utilisé avec des tubes de centrifugeuse de grand volume, sauf si le rotor de la centrifugeuse est équipé des coussins à fond en V appropriés
Tubes à centrifuger grand volumeCorningCLS431123-6EATubes à centrifuger de 500 mL
MgCl2  ; Thermo Fisher Scientific7791-18-6
Tube de microcentrifugationFisher Scientific05-408-129Tube de microcentrifugation de 1,5 mL, stériliser avant utilisation
Eau de qualité moléculaireCytiva Life SciencesSH30538.03
N-Lauroylsarcosine sel de sodiumSigma AldrichL5125ATTENTION. Porter
des gants NaClThermo Fisher ScientificBP35810
Optimem, sérum réduit moyenThermo Fisher Scientific31985070
Pasteur pippetsFisher Scientific13-678-20DStériliser avant utilisation
PBS (10x)Thermo Fisher Scientific70011044Diluer à 1x pour une utilisation sur cellules
Pénicilline-Streptomycine SolutionCytiva Life SciencesSV30010
plasmide pHelperConception de novo ou obtenu à partir d’un dépôt de plasmidesNA
Bassin de pipettesThermo Fisher Scientific13-681-502Achat de bassins de pipettes stériles
Polyéthylène glycol tert-octylphényléther (Triton X-100)Thermo Fisher Scientific9002-93-1MISE EN GARDE. Porter des gants
Polyéthylénimine (PEI)Polyscience24765-1Suivre le fabricant' pour produire une solution de 1 L. 0,22&mu ; m filtrer et stocker à 4° ; C
Plaque PCR semi-jupe en polypropylèneFroggaBioWS-96
Polysorbate 20 (Tween 20)Thermo Fisher ScientificBP337-100MISE EN GARDE. Portez des gants
difluorure de polyvinylidène (PVDF)Cytiva Life Sciences10600023Utilisez des pinces pour manipuler. Portez des gants.
Anticorps primaireProgen65158
Protein LadderFroggaBioPM008-0500
Protéinase KThermo Fisher ScientificAM2546
Plasmide pTrangeneConception de novo ou obtenu à partir d’un dépôt de plasmidesNADoit contenir SV40 polyA dans le génome pour être compatible avec le titrage AAV de la section 5.0
Tubulure de pompeCole-ParmerRK-96440-14Optimisation de la longueur de la tubulure et confinement du virus dans les fractions E1-E5
RQ1 Dnase 10 Tampon de réactionPromegaM6101Utilisation à une concentration de 10x dans le protocole de la section 4.0
RQ1 Dnase sans RnasePromegaM6101
Diluant d’échantillonCygnus TechnologiesI700Doit être acheté séparément pour être utilisé avec le kit
ELISA de protéine de cellule hôte HEK293Anticorps secondaire, HRPThermo Fisher ScientificG-21040
Lait écrémé en poudreOxoidLP0033B
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Thermo Fisher Scientific28312ATTENTION. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter
des gants Hydroxyde de sodium (NaOH)Thermo Fisher ScientificSS266-4
SV40 polyA sonde d’amorceIDTUtiliser la séquence du tableau X pour la citation de l’IDT pour la synthèse
Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)Thermo Fisher Scientific15524010ATTENTION. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Porter
des gants Tris BaseFisher ScientificBP152-5
Trypan blueBio-Rad1450021
Ultra-FilterMillipore SigmaUFC810024Ultra-4 Centrifuge 10K device doit être utilisé, car il a une coupure de 10000 poids moléculaire
Nucléase universelle pour la lyse cellulaireThermo Fisher Scientific88702
Universal qPCR master mixNEBM3003L
Whatman PaperMillipore SigmaWHA1001325
&beta ;-mercaptoethanolFisher Scientific21985023ATTENTION. Utilisation sous une hotte à flux laminaire. Portez des gants
ATTENTION :  ; Reportez-vous au tableau des matériaux pour les directives sur l’utilisation des produits chimiques dangereux.
À Kit membrane en

Références

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