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Article de méthode

Production rapide, abordable et simple de lysat sans cellules bactériennes

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DOI :

10.3791/62753

⸱

29 octobre 2021

 ,  ,  , 
1Biocircuits Institute, University of California, San Diego, 2Present address, Kyoto Institute of Technology, 3Present address, Vertex Pharmaceuticals, 4Department of Bioengineering, University of California, San Diego, 5Molecular Biology Section, University of California, San Diego

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode rapide et simple pour produire du lysat bactérien pour l’expression génique sans cellule, en utilisant une souche modifiée d’Escherichia coli et ne nécessitant que du matériel de laboratoire standard.

Résumé

L’expression génique sans cellules offre le pouvoir de la biologie sans les complications d’un organisme vivant. Bien qu’il existe de nombreux systèmes d’expression génique de ce type, la plupart sont assez coûteux à l’achat et / ou nécessitent un équipement spécial et une expertise finement affinée pour produire efficacement. Ce protocole décrit une méthode de production de lysat sans cellules bactériennes qui soutient des niveaux élevés d’expression génique, en utilisant uniquement de l’équipement de laboratoire standard et nécessitant un traitement minimal. La méthode utilise une souche d’Escherichia coli produisant une endolysine qui n’affecte pas la croissance, mais qui lyse efficacement une pastille cellulaire récoltée après un simple cycle de gel-dégel. Le seul traitement supplémentaire requis est une brève incubation suivie d’une centrifugation pour éliminer l’autolysat des débris cellulaires. Des circuits géniques dynamiques peuvent être obtenus grâce à l’expression hétérologue de la protéase ClpX dans les cellules avant le prélèvement. Une souche d’E. coli dépourvue du gène lacZ peut être utilisée pour des applications de biodétection haute sensibilité et sans cellules à l’aide d’une lecture colorimétrique ou fluorescente. L’ensemble du protocole nécessite aussi peu que 8-9 heures, avec seulement 1-2 heures de travail pratique de l’inoculation à l’achèvement. En réduisant le coût et le temps d’obtention du lysat sans cellule, cette méthode devrait augmenter l’abordabilité de l’expression génique sans cellule pour diverses applications.

Introduction

L’expression génique dans les lysats sans cellules présente plusieurs avantages par rapport à l’utilisation de cellules vivantes1,2,3,4. Les lysats peuvent être facilement modifiés biochimiquement et utilisés dans des conditions qui pourraient être préjudiciables ou impossibles à atteindre dans les cellules vivantes. Les circuits d’expression génique n’ont pas à rivaliser ou à rivaliser avec les processus biologiques de l’hôte, et tester de nouveaux circuits génétiques est aussi simple que d’ajouter de l’ADN. Pour ces raisons, l’expression génique sans cellules a trouvé diverses applications, des biocapteurs5,6 au prototypage rapide de circuits de gènes synthétiques7,8 au développement de cellules artificielles9. La plupart des expressions géniques sans cellules utilisent des lysats cellulaires qui ont été hautement transformés, nécessitant généralement des protocoles longs et complexes, un équipement spécialisé et / ou des étapes sensibles pouvant entraîner des variations significatives entre les utilisateurs et les lots10,11.

Cet article décrit une méthode simple et efficace de production de lysat sans cellule qui nécessite un traitement et une expertise minimes (Figure 1A)12. La méthode repose sur des cellules d’E. coli qui sont conçues pour lyser après un simple cycle de gel-dégel. Les cellules expriment une endolysine du phage lambda qui dégrade la paroi cellulaire. Au fur et à mesure que les cellules se développent, cette endolysine reste dans le cytoplasme, séquestrée de la paroi cellulaire. Cependant, un simple cycle de gel-dégel perturbe la membrane cytoplasmique, libérant l’endolysine dans le périplasme, où elle dégrade la paroi cellulaire, entraînant une lyse cellulaire rapide. Le protocole peut être complété avec seulement quelques heures de travail pratique et ne nécessite qu’un congélateur, une centrifugeuse capable de 30 000 × g (pour des résultats optimaux; des vitesses plus faibles peuvent être utilisées avec plus de soin pour ne pas déranger le granulé), un mélangeur vortex et une solution tampon simple. Le lysat fonctionnel peut même être produit en lyophilisant les cellules et en les réhydratant in situ. Cependant, cette méthode produit des lysats avec une activité plus faible, probablement en raison des débris cellulaires restants.

Les lysats sont très actifs pour l’expression de gènes sans cellules, et ils peuvent être améliorés de différentes manières en fonction de l’utilisation finale. Le taux de synthèse des protéines peut être encore augmenté en concentrant le lysat à l’aide de concentrateurs de spin standard. L’ADN linéaire peut être protégé de la dégradation en ajoutant de la protéine GamS purifiée. La dégradation des protéines, nécessaire à une dynamique de circuit plus complexe telle que l’oscillation, peut être obtenue en co-exprimant un hexamère ClpX dans la souche13productrice d’autolysats. Enfin, les lectures visuelles basées sur LacZ sont activées en utilisant une souche autolysée dépourvue de lacZ. Dans l’ensemble, cette méthode produit un lysat sans cellules hautement actif qui convient à un large éventail d’applications.

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Protocole

1. Préparez les supports et les tampons.

  1. Préparez 2xYTPG medium.
    1. Mélanger 62 g de poudre 2xYT, 5,99 g de phosphate de potassium monobasique, 13,93 g de phosphate de potassium dibasique et de l’eau désionisée à 2 L.
    2. Autoclave sur cycle liquide avec un temps d’exposition de 30 min14.
    3. À 400 mL de milieu 2xYTP du 1.1.2, ajouter 7,2 g de D-glucose (dextrose) et mélanger jusqu’à dissolution.
    4. Filtrer-stériliser à travers un filtre de 0,2 μm.
  2. Préparez la mémoire tampon S30A.
    1. Mélanger Tris-HCl (pH 7,7, concentration finale de 50 mM), glutamate de potassium (60 mM final) et glutamate de magnésium (14 mM final).
    2. Ajustez le pH à 7,7 à l’aide de 10 M KOH.
  3. Préparez la solution 1 (voir le tableau 1).
    1. Remettre en suspension l’acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) dans 2 mL d’eau.
    2. Ajustez le pH à 8,0 à l’aide de KOH.
    3. Ajoutez tous les autres composants du tableau 1.
    4. Ajustez le pH à 7,6 à l’aide de 10 M KOH. Filtrer-stériliser.
  4. Préparer une solution de prémélange 2,5x (voir tableau 2).
    1. Mélanger tous les composants du tableau 2.
    2. Ajustez le pH à 7,5 à l’aide de KOH.
    3. Aliquote et congeler à -80 °C.
      REMARQUE : Une réaction de 20 μL utilise 8,9 μL de prémélange.

2. Préparez les cellules.

  1. Strier les cellules autolysées sur des plaques de gélose LB contenant 50 μg/mL d’ampicilline à l’aide d’une boucle d’inoculation et croître à 37 °C (voir note 1).
  2. Choisissez une seule colonie dans une culture de démarrage de milieu LB / ampicilline à l’aide d’une pointe de pipette et cultivez à 37 ° C pendant la nuit.
  3. Inoculer 400 mL de milieu 2xYTPG contenant 50 μg/mL d’ampicilline avec 400 μL de culture de démarrage, et croître à 37 °C dans une fiole d’Erlenmeyer de 1 L, en agitant à 300 tr/min.
  4. Mesurer périodiquement la densité optique de la culture à 600 nm (OD600)à l’aide d’un spectrophotomètre pour lire une cuvette optique d’une longueur de trajet de 1 cm. Lorsque l’OD600 dépasse 1, commencez à diluer la culture 5 fois avant les mesures pour vous assurer que les mesures restent dans la plage linéaire d’un spectrophotomètre de laboratoire typique. Continuer à cultiver les cellules jusqu’à ce que la culture diluée 5 fois atteignel’OD 600 de 0,3 (correspondant à une culture OD600 de 1,5).

3. Préparez le lysat.

  1. Préparer le tampon S30A complété par 2 mM de dithiothréitol (TNT). Mélanger 3 mL de tampon S30A avec 6 μL de solution mère TNT à 1 M. Placer sur de la glace pour une utilisation à l’étape 3.7.
  2. Récolter les cellules par centrifugation à 1800 × g pendant 15 min à température ambiante.
  3. Jetez le surnageant en le versant et en utilisant une pipette pour éliminer tout liquide restant.
  4. Remettre la pastille dans 45 mL de tampon S30A froid (4-10 °C) à l’aide d’un mélangeur vortex.
  5. Peser un tube de centrifugeuse vide de 50 mL, y transférer les cellules et répéter les étapes 3.2-3.3 pour laver les cellules.
  6. Peser la pastille en soustrayant le poids d’un tube vide de 50 mL. Assurez-vous d’aspirer soigneusement tout surnageant restant pour assurer une mesure précise du poids des granulés.
    REMARQUE: Un rendement typique est d’environ 1,3 g de granulés cellulaires provenant de 400 mL de culture de production.
  7. Ajouter 2 volumes de tampon froid S30A complété par 2 mM de dithiothréitol, soit 2 mL de tampon pour 1 g de pastille cellulaire, et remettre les cellules en suspension vigoureuse par mélange vortex.
  8. Congelez les cellules. Placer le tube de 50 mL contenant les cellules dans un congélateur à -20 °C ou -80 °C jusqu’à ce que la pastille soit complètement congelée.
    REMARQUE: L’étape de congélation est un bon point d’arrêt pour la journée.
  9. Décongelez les cellules dans un bain-marie à température ambiante.
  10. Vortex vigoureusement pendant 2-3 min.
  11. Incuber à 37 °C pendant 45 min en agitant à 300 tr/min.
  12. Nettoyer l’échantillon de débris cellulaires lourds par centrifugation dans des tubes centrifuges transparents à 30 000 × g pendant 45 min à 4 °C.
    REMARQUE: Si une centrifugeuse capable de 30 000 x g n’est pas disponible, centrifugez pendant 45 min à 21 000 × get faites preuve d’une prudence supplémentaire à l’étape 3.13, car la pastille sera moins compacte.
  13. Transférez soigneusement le surnageant dans un nouveau tube avec une pipette, en évitant autant que possible de déranger la pastille. Si le surnageant transféré est contaminé par un matériau provenant de la pastille, répétez l’étape précédente.
  14. Transférer le surnageant dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 mL et centrifuger à nouveau à 21 000 × g (ou la vitesse maximale d’une centrifugeuse de table) pendant 5 min.
  15. Aliquotez l’autolysat nettoyé dans les volumes souhaités, en évitant soigneusement toute pastille restante, et congelez à -80 ° C ou utilisez-le immédiatement.
    REMARQUE : Une seule réaction de 20 μL utilise 8 μL d’autolysat.

4. Expression génique sans cellules

REMARQUE: L’autolysat est maintenant prêt pour toute utilisation finale souhaitée. Ce qui suit est un exemple de protocole standard pour l’expression de gènes sans cellules.

  1. Pour une réaction de 20 μL, mélanger sur glace 8 μL d’autolysat et 8,9 μL de prémélange. Voir NOTE à la fin de la section du protocole concernant l’optimisation des concentrations de glutamate de magnésium et de PEG 8000.
  2. Ajouter de l’ADN (p. ex., pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 à une concentration finale de 8 nM), tout autre réactif et de l’eau à 20 μL.
  3. Placez la réaction dans une microplaque de 384 puits et mesurez le temps de fluorescence et/ou les extrémités à l’aide d’un lecteur de plaques. Pour la protéine fluorescente verte (GFP), utilisez une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 520 nm.

5. Modifications du protocole

REMARQUE : Les modifications suivantes du protocole lui permettent de servir d’autres applications.

  1. Expression génique sans cellules à l’aide de modèles d’ADN linéaires
    1. Effectuez les étapes de la section 4, en complétant la réaction avec une protéine GamS purifiée de 2,2 μM (exprimée et purifiée comme décrit12)avant l’ajout de l’ADN linéaire.
  2. Expression génique sans cellule incorporant la dégradation des protéines
    1. À l’étape 2.1, utilisez des cellules autolysées contenant le plasmide pACYC-FLAG-dN6-His (voir la Table des matériaux). Dans tous les milieux de croissance, inclure en outre 34 μg/mL de chloramphénicol.
    2. À l’étape 2.3, inclure 40 μM d’isopropyle β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) dans le milieu de croissance pour induire l’expression du plasmide.
    3. Répétez les étapes 3.2 à 3.4 (lavage) deux fois de plus (pour un total de trois lavages) pour assurer l’élimination complète du chloramphénicol, qui est un inhibiteur de la traduction. Pour les deux premiers lavages (étape 3.4), remplacer le tampon S30A par une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4).
    4. À l’étape 4.2, compléter avec un supplément de 3 mM d’ATP (ajouté à partir d’une solution mère de 100 mM d’ATP dans l’eau, pH 7,2) et de 4,5 mM de glutamate de magnésium (en utilisant une solution mère de 1 M dans l’eau) (concentrations finales) pour compenser l’utilisation élevée d’ATP par ClpXP, ainsi que la chélation du magnésium par l’ATP supplémentaire.
  3. Expression génique sans cellules à l’aide de lectures basées sur LacZ (y compris colorimétriques)
    1. À l’étape 2.1, utilisez des cellules de type automatique qui n’expriment pas nativement LacZ (voir le tableau des matériaux).
  4. Alternativement, préparez le lysat directement à partir de cellules lyophilisées.
    1. Effectuez toutes les étapes de 1.1 à 3.7.
    2. Mélanger 8 μL de suspension cellulaire avec 8,9 μL de prémélange.
    3. Ajoutez de l’ADN plasmidique (si vous le souhaitez), d’autres réactifs personnalisés et de l’eau pour atteindre un volume final de 20 μL.
    4. Transférer la réaction sur une microplaque de 384 puits et la lyophiliser.
      REMARQUE: Les échantillons lyophilisés peuvent être conservés jusqu’à une semaine et peut-être plus longtemps.
    5. Pour commencer la réaction, réhydratez-la avec 18 μL d’eau désionisée complétée par l’ADN ou d’autres réactifs souhaités.
    6. Suivez la dynamique de fluorescence dans un lecteur de plaques.

NOTE 1: Les cellules autolysées sont conçues pour se lyser lors d’un cycle de gel-dégel, il est donc particulièrement important d’utiliser un cryoprotecteur lors de la fabrication de stocks congelés. Nous avons congelé les stocks dans 24 % de glycérol en poids/vol et les avons stockés à -80 °C.

NOTE 2: Les ions magnésium et PEG 8000 sont essentiels pour la performance du lysat. Le prémélange de base 2,5x, basé sur des données publiées précédemment, contient 6 mM de glutamate de magnésium et 4,8% p/vol de PEG 8000, qui deviennent respectivement 2,4 mM et 1,9% dans la réaction finale. L’autolysat préparé avec le protocole ici fonctionne généralement mieux avec 5 mM de Mg-glutamate supplémentaires et 1,5% de PEG 8000 dans la réaction finale. Cependant, cela peut être optimisé dans la gamme d’un 0-10 mM Mg glutamate supplémentaire et d’un PEG 8000 supplémentaire de 0-3% (par rapport au prémélange de base). Pour préparer le prémélange avec les 5 mM de Mg-glutamate supplémentaires recommandés et 1,5 % de PEG 8000 (concentrations finales), mélanger 380 μL de prémélange avec 4,75 μL de glutamate de magnésium à 1 M et 36,1 μL de PEG 8000 à 40 % poids/volume.

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Résultats

Des résultats représentatifs peuvent être observés en utilisant l’autolysat pour exprimer la GFP à partir d’un plasmide exprimant de manière constitutive, ici pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500, et en enregistrant un cours temporel de fluorescence GFP dans un lecteur de plaques(Figure 1B). Une série de dilution d’ADN plasmidique a trouvé une forte expression même à 1 nM d’ADN. Par rapport à un lysat disponible dans le commerce, l’autolysat peut produire un rendement total plus élevé et atteind...

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Discussion

Le protocole décrit ici produit un lysat bactérien hautement actif pour l’expression de gènes sans cellules. La clé est d’utiliser des cellules porteuses du plasmide pAD-LyseR, qui exprime l’endolysine du phage lambda de manière cytosolique. Ces cellules sont potentialisées pour se lyser lors de la perméabilisation de la membrane interne, permettant à l’endolysine d’accéder à la paroi cellulaire, ce que la méthode réalise grâce à un simple cycle de gel-dégel. Parce que les cellules se lysent efficacement, le produit est ...

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Déclarations de divulgation

J.H. est cofondateur de GenCirq Inc., qui se concentre sur les thérapies contre le cancer. Il siège au conseil d’administration et détient des participations dans GenCirq.

Remerciements

Les auteurs remercient Zachary Sun et Richard Murray (California Institute of Technology) d’avoir aimablement fourni le plasmide P_araBAD-gamS, et Kaeko Kamei (Kyoto Institute of Technology) d’avoir aimablement fourni une centrifugeuse de refroidissement à grande vitesse. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health et du programme ARO MURI et a été en partie soutenu par la Leading Initiative for Excellent Young Researchers, MEXT, Japon.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2xYT médiaEMD Millipore4.85008ou équivalent
3-PGASigma AldrichP8877ou
équivalent Unité de filtration centrifuge Amicon Ultra-15, coupure 3 kDaMillipore SigmaUFC900308en option, peut être utilisé pour concentrer le lysat, sélectionner la capacité du concentrateur appropriée pour le volume à concentrer
ampicillineSigma AldrichA0166-5Gou carbénicline, une variante plus stable
ATPSigma AldrichA8937ou équivalent
cAMPSigma AldrichA9501ou équivalent
CoASigma AldrichC4282ou équivalent
CTPUnited States Biosciences14121ou équivalent
D-glucose (dextrose)Fisher ScientificAAA1749603ou équivalent
dithiothréitol (DTT)Sigma AldrichD0632-1Gou équivalent
E. coli BL21-Gold (DE3) porteur de pAD-LyseRAddgene99244
E. coli BL21-Gold (DE3) et Delta ; lacZ porteur de pAD-LyseRAddgene99245
Acide foliniqueSigma AldrichF7878ou équivalent
GTPUnited States Biosciences16800ou équivalent
HEPESSigma AldrichH3375-25Gou
équivalent LB média FisherScientificDF0446075ou équivalent
glutamatede magnésiumSigma Aldrich49605-250Gou équivalent
NADSigma AldrichN6522ou
équivalent glutamate de potassiumSigma AldrichG1501-100Gou
hydroxyde de potassium équivalent (KOH)Sigma Aldrich221473-25Gpour ajuster le pH
phosphate de potassium dibasicFisher ScientificBP363-500ou équivalent
phosphate de potassium monobasiqueFisher ScientificBP362-500ou équivalent
SpermidineSigma Aldrich85558ou équivalent
Tris-HClFisher Scientific9310500GMou équivalent
mélange d’ARNtRoche10109541001ou équivalent
UTP United States Biosciences23160ou équivalent

Références

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