Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à des températures aussi élevées que 70 °C, avant la congélation pour les expériences cryo-EM.
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Article de méthode
Préparation de grilles d’échantillons à haute température pour Cryo-EM
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les grilles d’échantillons pour les expériences de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) sont généralement préparées à une température optimale pour le stockage d’échantillons biologiques, principalement à 4 °C et parfois à température ambiante. Récemment, nous avons découvert que la structure protéique résolue à basse température peut ne pas être fonctionnellement pertinente, en particulier pour les protéines d’archées thermophiles. Une procédure a été développée pour préparer des échantillons de protéines à des températures plus élevées (jusqu’à 70 ° C) pour l’analyse cryo-EM. Nous avons montré que les structures provenant d’échantillons préparés à des températures plus élevées sont fonctionnellement pertinentes et dépendent de la température. Nous décrivons ici un protocole détaillé pour la préparation de grilles d’échantillons à haute température, en utilisant 55 °C comme exemple. L’expérience a utilisé un appareil de vitrification modifié à l’aide d’un tube de centrifugation supplémentaire, et les échantillons ont été incubés à 55 ° C. Les procédures détaillées ont été affinées pour minimiser la condensation de vapeur et obtenir une fine couche de glace sur la grille. Des exemples d’expériences réussies et infructueuses sont fournis.
Introduction
La technologie cryo-EM pour résoudre les structures des complexes protéiques a continué à s’améliorer, en particulier dans le sens de l’obtention de structures à haute résolution 1,2. Entre-temps, le paysage de son application a également été élargi en variant les conditions d’échantillon telles que le pH ou les ligands avant le processus de vitrification3, qui implique la préparation de grilles d’échantillons suivie de la congélationplongeante 4,5. Une autre condition importante est la température. Bien que les expériences cryo....
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Protocole
NOTE: Ce protocole vise à utiliser un appareil de vitrification commerciale modifié pour préparer les échantillons de cryo-microscopie électronique (cryo-EM) à des températures spécifiques, en particulier supérieures à 37 ° C. La configuration expérimentale globale est illustrée à la figure 1. Le protocole utilise 55 °C comme exemple. Pour les conditions spécifiques à d’autres températures, veuillez vous référer au tableau supplémentaire 2 de la référence12.
1. Préparation de l’appareil de vitrification
- Faites un trou de 1 cm dans un tube centrifuge de 50 ml à son extrémité fe....
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Résultats
La vue d’ensemble du faible grossissement est illustrée à la figure 5A,B. Le panneau A est un exemple de grille réussie. Il y a un gradient de glace du haut à gauche (plus épais) au bas à droite (plus mince ou vide). Une telle grille facilite la recherche d’une épaisseur appropriée de la couche de glace dans la zone médiane adaptée à la collecte de données, comme les cases bleue et verte. La grille B est trop sèche. Les carrés de la grille ont un contraste lumineux, ce qui s.......
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Discussion
À l’étape 1 du protocole, assurez-vous que le tube de centrifugation a été bien installé et ne tombe pas lorsque l’expérience est en cours. En raison de l’accumulation d’un grand nombre de gouttelettes d’eau dans la chambre, ce qui pourrait modifier la capacité d’adsorption du papier filtre, il est recommandé de ne pas dépasser 30 minutes après que la chambre de l’appareil de vitrification ait atteint la température d’équilibre. Si le temps de fonctionnement dépasse 30 min, l’opérateur doit remplacer le papier filtre et .......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.
Remerciements
Les auteurs remercient le Dr Hervé Remigy de Thermo Fisher Scientific pour ses précieux conseils. Les expériences cryo-EM ont été réalisées à l’Academia Sinica Cryo-EM Facility (ASCEM). L’ASCEM est soutenue par l’Academia Sinica (Grant No. AS-CFII-108-110) et Taiwan Protein Project (Grant No. AS-KPQ-109-TPP2). Les auteurs remercient également Mme Hui-Ju Huang pour son aide dans la préparation des échantillons.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tube | Falcon Falcon | 352070 | format : 50 mL |
| Papier filtre | Ted Pella | 47000-100 | Ø ; 55/20mm, Grade 595 |
| HI1210 | Bain-marie | Leica | |
| K100X | Microscopie électronique Sciences | décharge luminescente | |
| Quantifoil, 1.2/1.3 200Mesh Cu | grid Ted Pella | 658-200-CU-100 | |
| Titan Krios G3 | Thermo Fisher Scientific | 1063996 | imagerie à faible dose |
| Vitrobot Mark IV | Thermo Fisher Scientific | 1086439 | |
| Pince à épiler | Vitrobot Ted Pella | 47000-500 |
Références
- Yip, K. M., Fischer, N., Paknia, E., Chari, A., Stark, H. Atomic-resolution protein structure determination by cryo-EM. Nature. 587, 157-161 (2020).
- Nakane, T., et al. Single-particle cryo-EM at atomic resolution. Nature. 587, 152-156 (2020).
- Chen, C. Y., et al.
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Réimpressions et autorisations
