Article de méthode

Analyse quantitative du taux de croissance d’Aspergillus nidulans à l’aide de la microscopie en direct et d’un logiciel open source

DOI :

10.3791/62778

⸱

24 juillet 2021

 ,  ,  , 
1Microbial Molecular Genetics Laboratory, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD), 2Light Microscopy Unit, Institute of Biosciences and Applications, National Centre for Scientific Research, Demokritos (NCSRD)

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons un protocole d’imagerie en direct sans étiquette utilisant des techniques de microscopie optique transmise pour capturer des images, analyser et quantifier la cinétique de croissance du champignon filamenteux A. nidulans dans les cultures submergées et les milieux solides. Ce protocole peut être utilisé en conjonction avec la microscopie à fluorescence.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il est bien établi que la croissance des colonies de champignons filamenteux, qui dépend principalement des changements dans le taux de croissance apicale des hyphes et des mycéliums, est estimée macroscopiquement sur les milieux solidifiés en comparant la taille des colonies. Cependant, mesurer quantitativement le taux de croissance de souches ou de souches fongiques génétiquement différentes dans différentes conditions environnementales / de croissance (pH, température, sources de carbone et d’azote, antibiotiques, etc.) est difficile. Ainsi, la poursuite d’approches complémentaires pour quantifier la cinétique de croissance devient obligatoire afin de mieux comprendre la croissance des cellules fongiques. En outre, il est bien connu que les champignons filamenteux, y compris Aspergillus spp., ont des modes distincts de croissance et de différenciation dans des conditions subaérivoles sur des milieux solides ou des cultures submergées. Ici, nous détaillons une méthode microscopique quantitative pour analyser la cinétique de croissance du champignon modèle Aspergillus nidulans, en utilisant l’imagerie en direct dans les cultures submergées et les milieux solides. Nous capturons des images, analysons et quantifions les taux de croissance de différentes souches fongiques de manière reproductible et fiable à l’aide d’un logiciel open source et gratuit pour les bio-images (par exemple, Fidji), d’une manière qui ne nécessite aucune expertise préalable en analyse d’images de la part de l’utilisateur.

Introduction

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Les champignons filamenteux sont d’une grande importance socio-économique et écologique, étant à la fois cruciaux en tant qu’outils industriels / agricoles pour la productiond’enzymeset d’antibiotiques1,2 et en tant qu’agents pathogènes des plantes cultivées3, insectes nuisibles4 et humains3. De plus, les champignons filamenteux tels que Aspergillus nidulans sont largement utilisés comme organismes modèles pour la recherche fondamentale, comme les études en génétique, biologie cellulaire et évolutive ainsi que pour l’étude de l’extension hyphale5. Les champignons filamenteux sont des organismes hautement polarisés qui s’allongent grâce à l’apport continu de lipides/protéines membranaires et à la synthèse de novo de la paroi cellulaire à l’extrémité extensible6. Un rôle central dans la croissance de la pointe hyphale et le maintien de la polarité est une structure spécialisée appelée « Spitzenkorper » (SPK), une structure hautement ordonnée composée principalement de composants cytosquelettes et de la distribution polarisée du Golgi6,7,8.

Les stimuli/signaux environnementaux, tels que l’interface eau-air, la lumière, la concentration de CO2 et l’état nutritionnel sont responsables des décisions de développement prises par ces moisissures9. Dans les cultures submergées (liquides), la différenciation d’A. nidulans est réprimée et la croissance se produit par allongement de la pointe hyphale6. Au cours de la croissance végétative, les spores asexuées (conidies) germent par extension apicale, formant un réseau indifférencié de cellules hyphales interconnectées, le mycélium, qui peut continuer à croître indéfiniment tant que les nutriments et l’espace sont disponibles. D’autre part, sur les milieux solides, les pointes hyphales s’allongent et après une période définie de croissance végétative (compétence développementale), la reproduction asexuée est initiée et les tiges de conidiophores aériennes s’étendent à partir de cellules spécialisées du pied du mycélium6. Ceux-ci donnent naissance à des structures multicellulaires de développement spécialisées appelées conidiophores, qui produisent de longues chaînes de conidies haploïdes10 qui peuvent relancer la croissance dans des conditions environnementales favorables.

Une méthode largement utilisée pour mesurer la croissance fongique filamenteuse consiste à inoculer des spores sur une gélose nutritive contenue dans une boîte de Pétri et à mesurer macroscopiquement le diamètre de la colonie quelques jours plus tard11. Le diamètre/surface de la colonie, le plus dépendant des changements du taux de croissance mycéliale et moins de la densité des conidiophores12,est alors utilisé comme valeur de croissance. Bien que la mesure de la taille de la population fongique (colonie) qui pousse sur des surfaces solides soit tout à fait adéquate, ce n’est en aucun cas la mesure la plus précise de la croissance. Par rapport aux moyennes au niveau de la population (moyennes de la taille des colonies fongiques), les mesures unicellulaires peuvent saisir l’hétérogénéité d’une population cellulaire et permettre l’identification de nouvelles sous-populations de cellules, états13,dynamique, voies ainsi que les mécanismes biologiques par lesquels les cellules répondent aux changements endogènes et environnementaux14,15. La surveillance de la croissance et du phénotype des cellules fongiques par microscopie time-lapse est sans doute l’approche d’observation quantitative unicellulaire la plus largement utilisée.

Ici, nous détaillons un protocole d’imagerie en direct sans étiquette utilisant des techniques de microscopie à lumière transmise (telles que le contraste de phase, le contraste d’interférence différentielle (DIC) et la microscopie polarisée) pour capturer des images, qui, indépendamment de l’utilisation combinée de la microscopie à fluorescence, peuvent être utilisées pour analyser et quantifier la croissance polaire des souches d’A. nidulans dans les cultures submergées et les milieux solides.

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Protocole

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1. Préparation de l’inoculum

REMARQUE: Toutes les étapes doivent être effectuées sous une armoire à flux laminaire.

  1. Striez la souche fongique d’intérêt, à partir d’un stock de glycérol (-80 °C) à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, sur des plaques de milieu minimal (MM) complétées par les besoins nutritionnels appropriés en rapport avec la souche examinée [MM: 10,0 g/L de glucose, solution saline de 20 mL/L (solution saline: 26 g/L KCl, 26 g/L MgSO4·7H2O, 76 g/L KH2PO4, 2,0 mL/L de chloroforme) et 1 mL/L oligo-éléments (oligo-éléments : 40 mg/L Na2B4O7· H2 O, 400 mg/L CuSO4, 8 g/L ZnSO4, 800 mg/L MnSO4, 800 mg/L FePO4), ajuster le pH à 6,8 avec 1 M NaOH, ajouter 1 % (p/v) de gélose et les suppléments requis comme décrit dans16 et autoclave] (Figure 1).
    REMARQUE: La solution saline, la solution d’oligo-éléments et les suppléments sont autoclavés.
  2. Incuber pendant 2-3 jours à 37 °C.
  3. Utiliser un cure-dent stérile (ou une boucle d’inoculation), transférer un petit nombre de conidies, en touchant doucement une seule colonie, sur des plaques de milieu complet (CM) [CM : 10,0 g/L de glucose, 2,0 g/L de peptone, 1,0 g/L d’extrait de levure, 1,0 g/L d’acides casaminés, 20 mL/L de solution saline, 1 mL/L d’oligo-éléments, 5 mL/L de solution vitaminique (solution vitaminique : 0,1 g/L de riboflavine, 0,1 g/L de nicotinamide, 0,01 g/L d’acide p-aminobenzoïque, 0,05 g/L de pyridoxine HCl, 1,0 mg/L de biotine), ajuster le pH à 6,8 avec 1 M de NaOH, ajouter 1 % (p/v) de gélose et les suppléments requis comme décrit aupoint 16 et autoclave]. Autoclavez et conservez la solution vitaminique dans une bouteille sombre à 4 °C.
    REMARQUE: Dans le cas où la croissance fongique est trop dense pour identifier et isoler les colonies individuelles, re-streak sur une nouvelle plaque de gélose pour obtenir des colonies uniques.
  4. Incuber pendant 3-4 jours à 37 °C.
  5. Obtenir une suspension conidiale d’environ 2 x 106 cellules/mL en grattant 1 cm de la surface d’une colonie fongique conidiée cultivée sur des plaques de gélose CM, à l’aide d’un cure-dent stérile(Figure S1).
    REMARQUE: Si nécessaire, comptez les conidies avec un hémocytomètre.
  6. Récolter les conidies d’A. nidulans dans un tube de centrifugeuse stérile de 1,5 mL avec 1,0 mL d’eau distillée autoclavée contenant 0,05 % (v/v) de Tween 80 pour réduire le nombre d’amas de conidies.
    REMARQUE: Conidia peut être stocké jusqu’à 2-3 semaines à 4 ° C sans perte de viabilité pertinente (A. Athanasopoulos et V. Sophianopoulou, données non publiées). Cependant, il est recommandé de filtrer et / ou de laver la suspension conidiale pour éliminer les parties mycéliales et les nutriments, afin de prévenir le gonflement conidial.

2. Préparation pour l’imagerie des champignons filamenteux se développant sur des milieux agar (solides)

REMARQUE: Une version modifiée de la méthode de la 'gélose inversée17,18 est utilisée.

  1. Initialement, repérer des aliquotes de 10 μL de conidial vigoureusement vortexé (environ 2 x 104 cellules/mL) en plusieurs points sur des boîtes de Petri (Ø9 cm) 15 mL de MM avec 1% (p/v) de gélose(Figure 2).
    REMARQUE: En utilisant la version modifiée de la « méthode de la gélose inversée », il est possible d’imager des échantillons fongiques pendant de nombreuses heures sans effets délétères apparents sur les hyphes en croissance.
  2. Incuber la culture expérimentale en fonction du stade de développement destiné à être étudié.
  3. Découper un bloc de gélose de ≈0,8 mm2 contenant la colonie à l’aide d’un scalpel stérile.
    REMARQUE: Les dimensions du bloc de gélose à découper dépendent des dimensions de l’équipement à placer par la suite. Dans le présent ouvrage, 8 diapositives bien μ sont utilisées (voir ci-dessous).
  4. Inverser et placer le bloc de gélose dans un puits d’un verre de couverture à glissière μ ou similaire à 8 chambres avec couvercle adapté à l’imagerie en direct.
    REMARQUE: Dans le cas où la microscopie à lumière transmise sera utilisée en combinaison avec la microscopie à fluorescence (marquage), le bloc de gélose peut être inversé sur une gouttelette de milieu liquide contenant le colorant de coloration des cellules vivantes, juste avant l’imagerie.

3. Préparation pour l’imagerie des champignons filamenteux se développant sur un milieu liquide

  1. Transférer 10 μL d’aliquotes d’une suspension conidiale vigoureusement vortexée (environ 2 x 104 cellules/mL) dans les puits d’une lame de 8 puits μ contenant 200 μL de MM (liquide) avec les suppléments appropriés (voir ci-dessus).
  2. Incuber pendant le temps souhaité à la température souhaitée (Figure 3).
    REMARQUE: Si la microscopie à lumière transmise est utilisée en combinaison avec la microscopie à fluorescence (marquage), les cultures liquides ont le grand avantage que des colorants fluorescents peuvent être ajoutés à n’importe quel moment souhaité au cours de l’expérience19.

4. Capturez des images

REMARQUE: Le choix du microscope dépend de l’équipement disponible. Dans tous les cas, la configuration du microscope doit inclure un étage inversé, une chambre environnementale ou au moins une pièce avec un contrôle précis de la température de l’air.

  1. Préchauffer la chambre thermostatée du microscope à 37 °C (sauf indication contraire ou comme convenant aux espèces fongiques utilisées) pour stabiliser la température avant de commencer. Cette chambre permet la modulation de température de l’optique du microscope et de l’étage d’échantillonnage lors d’expériences time-lapse. Sachez que des aberrations optiques20 sont introduites lorsque des huiles d’immersion normales (conçues pour être utilisées à 23 °C) sont utilisées à 37 °C ou plus.
    REMARQUE: Avec un budget serré, les chambres d’incubation peuvent être fabriquées à partir de carton et de matériau d’emballage isolant21 ou à l’aide d’une imprimante 3D22.
  2. Allumez le microscope, la puissance du scanner, l’alimentation laser et l’ordinateur, puis chargez le logiciel d’imagerie. Placez la lame μ (préparée précédemment) dans la phase de microscope et faites la mise au point.
  3. Trouvez des champs de vision qui contiennent des cellules isolées/qui ne se chevauchent pas (ou du moins qui ne sont pas surpeuplées), afin de faciliter les mesures de croissance lors de l’analyse d’images. Capturez au moins 50 cellules en croissance par échantillon pour permettre une analyse statistique robuste.
  4. Sélectionnez l’approche de microscopie à lumière transmise souhaitée. Réduire le temps d’exposition ou la puissance laser et le temps de séjour des pixels et/ou augmenter les diamètres des trous d’épingle, afin de minimiser le photobleachage des cellules fongiques, comme décrit ailleurs 23,24.
  5. Réglez le microscope pour acquérir des images aux intervalles de temps souhaités et commencer l’acquisition de séries chronologiques.
    REMARQUE: Pour corriger la dérive focale au fil du temps (en particulier pour les longues expériences), en raison de la dérive thermique, de la diversité des tailles de cellules et du mouvement des cellules, utilisez une stratégie de mise au point automatique si disponible dans votre logiciel de microscope.

5. Analyse d’images

REMARQUE: Cette section décrit les étapes clés du traitement des images de microscopie time-lapse pour mesurer le taux de croissance d’A. nidulans. L’ouverture, la visualisation et le traitement des images sont réalisés avec le logiciel open source ImageJ/Fiji25.

  1. Importez les images aux Fidji à l’aide de Plugins | Bio-Formats | Importateur de bio-formats dans le menu Fidji avec les paramètres par défaut (Figure 4A).
    REMARQUE: Vérifiez si l’importateur de bio-formats reconnaît correctement l’étalonnage de l’image. La dimension de l’image affichée dans la fenêtre d’image du champ d’information supérieur doit être égale aux dimensions de l’image d’origine(Figure 4B). Appuyez sur Maj + P pour afficher et modifier les propriétés de l’image dans le logiciel ImageJ/Fiji.
  2. Si nécessaire, utilisez l’histogramme correspondantà 26 pour la correction de l’éclairage entre différentes images (Image | Ajuster | | de correction de l’eau de Javel Correspondance de l’histogramme) (Figure 4C).
  3. Si nécessaire, utilisez l’algorithme SIFT (Plugins | | d’inscription Alignement linéaire de la pile avec SIFT) pour aligner ou faire correspondre des piles d’images (Figure 4D). Sélectionner "Traduction" dans le menu de transformation attendue devrait suffire à corriger toute dérive x-y.
    REMARQUE: D’autres plugins peuvent également être utilisés pour aligner une pile de tranches d’image, telles que Stabilisateur d’image (https://imagej.net/Image_Stabilizer) ou StackReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/).
  4. Sélectionnez les hyphes qui poussent parallèlement au couvercle, en évitant ceux qui sont inclinés. Assurez-vous de sélectionner les hyphes qui se propagent par extension polaire et évitez les hyphes présentant des ramifications latérales et/ ou apicales.
  5. Utilisez MTrackJ (Plugins | MTrackJ) plugin pour suivre les pointes hyphales en croissance (Figure 4E)27. Pour ajouter une piste, sélectionnez le bouton Ajouter dans la barre d’outils et placez le premier point à une pointe hyphale à l’aide du clic gauche de la souris. La série chronologique passera automatiquement à l’image suivante. Pour terminer le processus de suivi, double-cliquez avec la souris sur le point final (ou appuyez sur la touche Échap) (Figure 4F). Passez à un autre point d’intérêt (c.-à-d. la croissance de la pointe hyphale) dans le laps de temps initial et recommencez la procédure en mesurant le taux de croissance d’un autre hyphe.
    REMARQUE: Pour installer MTrackJ, suivez les instructions présentées à https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/
  6. Cliquez sur le bouton Mesure dans la boîte de dialogue MTrackJ (Figure 4G) pour ouvrir la table de sortie. Enregistrer les mesures de piste (Fichier | Enregistrer sous) au format de fichier souhaité (par exemple, csv), analysez-les et tracez-les(Figure 4H).
    REMARQUE: En sélectionnant le bouton Film, un film est produit montrant l’image et la progression du suivi.

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Résultats

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Suite à ce protocole, nous avons capturé et analysé diverses images correspondant à différents stades de croissance/développement du champignon filamenteux A. nidulans. Les données présentées dans cette étude ont été traitées et analysées à l’aide du logiciel Fidji. Les mesures ont été enregistrées sous forme de fichiers csv, analysées statistiquement et préparées sous forme de graphiques à l’aide de logiciels statistiques commerciaux et / ou d’un langage de programmation Python utilisant des bibliothèques logic...

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Discussion

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La surveillance de la croissance et du phénotype des cellules fongiques par microscopie time-lapse est une approche puissante pour évaluer le comportement cellulaire en temps réel et déterminer quantitativement et avec précision si un traitement médicamenteux particulier et / ou une intervention génétique entraîne une croissance cellulaire détectable ou des différences phénotypiques au fil du temps.

Dans cette étude, une méthodologie fiable d’imagerie des cellules vivantes a été décrite pour m...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été en partie soutenu par le projet « Une infrastructure de recherche grecque pour la visualisation et la surveillance des processus biologiques fondamentaux (BioImaging-GR) » (MIS 5002755) qui est mis en œuvre dans le cadre de l’action « Renforcement de l’infrastructure de recherche et d’innovation », financé par le programme opérationnel « Compétitivité, entrepreneuriat et innovation » (CRSN 2014-2020) et cofinancé par la Grèce et l’UE.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
µ ;-Slide 8 WellIbidi80826Lames d’imagerie
4-Acide aminobenzoïqueMerckA9878
azhA&Delta ; ngnA&Delta ;Génotype : zhA&Delta ;::p yrGAf ; ngnA&Delta ;::p yrGAf ; pyroA4 pantoB100 / Références :Collection de laboratoire, Athanasopoulos et al., 2013
Bacto Casamino AcidsGibco223030
BiotineMerckB4639
ChloroformeMerck67-66-3
Sulfate de cuivre(II) pentahydratéMerckC8027
GlucoseMerckG8270
GraphPad Prism 8.0LogicielLogiciel statistique
ImageJNIHLogiciel de traitement et d’analyse
d’images Boucle d’inoculationMerckI8263-500EA
Phosphate de fer(III)Merck1.03935
Leica Application Suite XLeica MicrosystemsLogiciel de microscope
Sulfate de magnésium heptahydratéMerck63138
Sulfate de manganèse(II) monohydratéMerckM7899
Microscope Leica TCS SP8Leica Microsystems
Nicotinamide (Niacinamide)Supelco47865-U
PeptoneMillipore68971
Boîtes de Pétri pour la microbiologie CultureKISKERG090
Chlorure de potassiumMerckP4504
Phosphate de potassium monobasiqueMerckP5655
Chlorhydrate de pyridoxineMerckP6280
Quali - Tubes de microcentrifugation, 1,7 mL, sans DNase, RNase et apyrogènes, stérilesKISKERG052-S
Quali - Tubes de microcentrifugation, 2,0 mL, stérilesKISKERG053-S
Quali - Embouts standard, biseautés, 100-1000 & micro ; LKISKERVL004G
Quali - Pointes standard, biseautées, 1-200 & micro ; LKISKERVL700G
Quali Microvolume Tips, sans DNase-, sans RNase, 0,1-10 & micro ; L/clearKISKERGC. CONSEILS. B
Riboflavine (B2)Supelco47861
Lames de scalpel NO. 11OdontoMed2011S2771
Chlorure de sodiumMerckS7653
Hydroxyde de sodiumMerckS8045
Tétraborate de sodium décahydratéMerckS9640
VS151 (PilA-GFP et H1-mRFP)Génotype : pyrG89 ; pilA ::sgfp ::AfpyrG+ argB2 nkuA&Delta ;::argB+  ; pyroA4 hhoA ::mrfp ::Afribo+ riboB2 / Références :Collection de laboratoire, Biratsi et al., 2021
WTGénotype : nkuA&Delta ;::argB ; pyrG89 ; pyroA4 ; pyrG89 / Références : TN02A3 -FGSC A1149
Extrait de levureMillipore70161
ZnSO4
GraphPad

Références

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  1. Kumar, A. Aspergillus nidulans: A Potential Resource of the Production of the Native and Heterologous Enzymes for Industrial Applications. International Journal of Microbiology. 2020, 8894215(2020).
  2. Kück, U., Bloemendal, S., Teichert, I. Putting Fungi to Work: Harvesting a Cornucopia of Drugs, Toxins, and Antibiotics. PLoS Pathogens. 10 (3), (2014).
  3. Paterson, R. R. M., Lima, N. Filamentous Fungal Human Pathogens from Food Emphasising Aspergillus, Fusarium and Mucor. Microoraganism. 5 (3), (2017).
  4. Wang, C., Wang, S. Insect Pathogenic Fungi: Genomics, Molecular Interactions, and Genetic Improvements. Annual Review of Entomology. 62, 73-90 (2017).
  5. Etxebeste, O., Espeso, E. A. Aspergillus nidulans in the post-genomic era: a top-model filamentous fungus for the study of signaling and homeostasis mechanisms. International Microbiology. 23 (1), 5-22 (2020).
  6. Riquelme, M., et al. Fungal Morphogenesis, from the Polarized Growth of Hyphae to Complex Reproduction and Infection Structures. Microbiology and Molecular Biology Reviews MMBR. 82 (2), (2018).
  7. Athanasopoulos, A., André, B., Sophianopoulou, V., Gournas, C. Fungal plasma membrane domains. FEMS Microbiology Reviews. , (2019).
  8. Pantazopoulou, A., Peñalva, M. A. Organization and Dynamics of the Aspergillus nidulans Golgi during Apical Extension and Mitosis. Molecular Biology of the Cell. 20 (20), 4335-4347 (2009).
  9. Bayram, Ö, Feussner, K., Dumkow, M., Herrfurth, C., Feussner, I., Braus, G. H. Changes of global gene expression and secondary metabolite accumulation during light-dependent Aspergillus nidulans development. Fungal Genetics and Biology. 87, 30-53 (2016).
  10. Yu, J. -H. Regulation of Development in Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus. Mycobiology. 38 (4), 229-237 (2010).
  11. Tomkins, R. G. Measuring growth: The petri dish method. Transactions of the British Mycological Society. 17 (1-2), 150-153 (1932).
  12. Gifford, D. R., Schoustra, S. E. Modelling colony population growth in the filamentous fungus Aspergillus nidulans. Journal of Theoretical Biology. 320, 124-130 (2013).
  13. Kasprowicz, R., Suman, R., O'Toole, P. Characterising live cell behaviour: Traditional label-free and quantitative phase imaging approaches. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 84, 89-95 (2017).
  14. Aknoun, S., et al. Quantitative phase microscopy for non-invasive live cell population monitoring. Scientific Reports. 11, (2021).
  15. Chessel, A., Carazo Salas, R. E. From observing to predicting single-cell structure and function with high-throughput/high-content microscopy. Essays in Biochemistry. 63 (2), 197-208 (2019).
  16. Todd, R. B., Davis, M. A., Hynes, M. J. Genetic manipulation of Aspergillus nidulans: meiotic progeny for genetic analysis and strain construction. Nature Protocols. 2 (4), 811-821 (2007).
  17. Hickey, P. C., Swift, S. R., Roca, M. G., Read, N. D. Live-cell Imaging of Filamentous Fungi Using Vital Fluorescent Dyes and Confocal Microscopy. Methods in Microbiology. 34, 63-87 (2004).
  18. Trinci, A. P. J. A Kinetic Study of the Growth of Aspergillus nidulans and Other Fungi. Journal of General Microbiology. 57 (1), 11-24 (1969).
  19. Lichius, A., Zeilinger, S. Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi. Journal of Visualized Experiments. (153), e60613(2019).
  20. Oomen, L. C. J. M., Sacher, R., Brocks, H. H. J., Zwier, J. M., Brakenhoff, G. J., Jalink, K. Immersion oil for high-resolution live-cell imaging at 37°C: optical and physical characteristics. Journal of Microscopy. 232 (2), 353-361 (2008).
  21. Distel, M., Köster, R. In Vivo Time-Lapse Imaging of Zebrafish Embryonic Development. CSH protocols. 2007, (2007).
  22. Walzik, M., et al. A portable low-cost long-term live-cell imaging platform for biomedical research and education. Biosensors and Bioelectronics. 64, (2014).
  23. Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
  24. North, A. J. Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition. The Journal of Cell Biology. 172 (1), 9-18 (2006).
  25. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  26. Miura, K. Bleach correction ImageJ plugin for compensating the photobleaching of time-lapse sequences. F1000Research. 1000, 1494(2020).
  27. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for Cell and Particle Tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  28. Strovas, T. J., Lidstrom, M. E. Population heterogeneity in Methylobacterium extorquens AM1. Microbiology. 155, Pt 6 2040-2048 (2009).
  29. Biratsi, A., Athanasopoulos, A., Kouvelis, V. N., Gournas, C., Sophianopoulou, V. A highly conserved mechanism for the detoxification and assimilation of the toxic phytoproduct L-azetidine-2-carboxylic acid in Aspergillus nidulans. Scientific Reports. 11 (1), 7391(2021).
  30. Athanasopoulos, A., Boleti, H., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome distribution and localization in the meiotic progeny of Aspergillus nidulans. Fungal Genetics and Biology. 53, 84-96 (2013).
  31. Vangelatos, I., Roumelioti, K., Gournas, C., Suarez, T., Scazzocchio, C., Sophianopoulou, V. Eisosome Organization in the Filamentous AscomyceteAspergillus nidulans. Eukaryotic Cell. 9 (10), 1441-1454 (2010).
  32. Athanasopoulos, A., Gournas, C., Amillis, S., Sophianopoulou, V. Characterization of AnNce102 and its role in eisosome stability and sphingolipid biosynthesis. Scientific Reports. 5 (1), (2015).
  33. Peñalva, M. A. Tracing the endocytic pathway of Aspergillus nidulans with FM4-64. Fungal Genetics and Biology. 42 (12), 963-975 (2005).
  34. Versari, C., et al. Long-term tracking of budding yeast cells in brightfield microscopy: CellStar and the Evaluation Platform. Journal of The Royal Society Interface. 14 (127), 20160705(2017).
  35. Adams, T. H., Wieser, J. K., Yu, J. -H. Asexual Sporulation in Aspergillus nidulans. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 62 (1), 35-54 (1998).
  36. Lagree, K., Desai, J. V., Finkel, J. S., Lanni, F. Microscopy of fungal biofilms. Current Opinion in Microbiology. 43, 100-107 (2018).
  37. Brunk, M., Sputh, S., Doose, S., van de Linde, S., Terpitz, U. HyphaTracker: An ImageJ toolbox for time-resolved analysis of spore germination in filamentous fungi. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
  38. Baum, T., Navarro-Quezada, A., Knogge, W., Douchkov, D., Schweizer, P., Seiffert, U. HyphArea-Automated analysis of spatiotemporal fungal patterns. Journal of Plant Physiology. 168 (1), 72-78 (2011).
  39. Barry, D. J., Williams, G. A., Chan, C. Automated analysis of filamentous microbial morphology with AnaMorf. Biotechnology Progress. 31 (3), 849-852 (2015).

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