Imagerie des domaines réplicatifs dans la chromatine ultrastructurellement préservée par tomographie électronique

Résumé

Ce protocole présente une technique de cartographie à haute résolution des sites de réplication dans la chromatine structurellement préservée in situ qui utilise une combinaison de marquage pré-intégration EdU-streptavidin-Nanogold et ChromEMT.

Résumé

Les principes du repliement de l’ADN dans le noyau cellulaire et ses transformations dynamiques qui se produisent lors de l’accomplissement des fonctions génétiques de base (transcription, réplication, ségrégation, etc.) restent mal compris, en partie en raison du manque d’approches expérimentales de visualisation à haute résolution de loci de chromatine spécifiques dans des noyaux structurellement préservés. Nous présentons ici un protocole pour la visualisation des domaines réplicatifs dans la culture cellulaire monocouche in situ, en combinant le marquage EdU de l’ADN nouvellement synthétisé avec la détection ultérieure du marquage avec l’amplification Ag des particules Nanogold et la coloration ChromEM de la chromatine. Ce protocole permet l’étiquetage pré-intégration à contraste élevé et à haute efficacité, compatible avec la fixation traditionnelle du glutaraldéhyde qui offre la meilleure conservation structurelle de la chromatine pour le traitement des échantillons à température ambiante. Un autre avantage de l’étiquetage de pré-intégration est la possibilité de présélectionner les cellules d’intérêt pour la section. Ceci est particulièrement important pour l’analyse de populations cellulaires hétérogènes, ainsi que pour la compatibilité avec les approches de tomographie électronique pour l’analyse 3D à haute résolution de l’organisation de la chromatine sur les sites de réplication, et l’analyse du réarrangement post-réplicatif de la chromatine et de la ségrégation des chromatides sœurs dans l’interphase.

Introduction

La réplication de l’ADN est un processus biologique de base requis pour la copie fidèle et la transmission de l’information génétique pendant la division cellulaire. Chez les eucaryotes supérieurs, la réplication de l’ADN est soumise à une régulation spatio-temporelle étroite, qui se manifeste par une activation séquentielle des origines de la réplication¹. Les origines de réplication voisines tirant de manière synchrone forment des groupes de replicons². Au niveau de la microscopie optique, les sites de réplication continue de l’ADN sont détectés comme des foyers de réplication de nombre et de taille variés. Les foyers ....

Protocole

Le protocole est optimisé pour les cellules adhérentes et a été testé sur les lignées cellulaires HeLa, HT1080 et CHO.

1. Étiquetage et fixation des cellules

1. Cellules de plaque sur des couvercles nettoyés à l’acide dans une boîte de Petri de 3 cm. Cultiver les cellules dans le milieu recommandé pour la lignée cellulaire utilisée à 70% de confluence.
2. Ajouter l’EdU (5-éthyynyl-2'-désoxyuridine) à partir de 10 mM de stock jusqu’à la concentration finale de 10 μM et placer les cellules dans l’incubateur pendant 10 min ou plus (selon l’objectif de l’expérience). Pour des impulsions plus courtes (jusqu’à 2 min....

Résultats

Les foyers de réplication dans les noyaux de cellules de mammifères présentent des modèles distincts de distribution dans le noyau en fonction de la progression de la phase S. Ces modèles sont en corrélation avec l’activité transcriptionnelle des loci en cours de réplication. Étant donné que la méthode présentée ici utilise une procédure de fixation assez forte, il est assez simple d’utiliser le marquage d’impulsions réplicatives pour la détection spécifique de loci de chromatine dans divers états transcriptionnels, même.......

Discussion

La méthode décrite ici présente plusieurs avantages par rapport aux protocoles précédemment publiés. Tout d’abord, l’utilisation de la chimie du clic pour le marquage de l’ADN répliqué élimine la nécessité d’une dénaturation de l’ADN préalable à la détection de BrdU avec des anticorps, préservant ainsi mieux l’ultrastructure de la chromatine.

Deuxièmement, l’utilisation de la biotine comme ligand secondaire généré après la fixation du glutaraldéhyde et la trempe appropriée des groupes aldéhyd.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
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5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU)	Thermo Fisher	A10044
2-(4-morpholino)éthane Acide sulfonique (MES)	Fisher Scientific	BP300-100
AlexaFluor 555-azide	Termo Fisher	A20012
biotine-azide	Lumiprobe	C3730
Sérum bovin albumine	Boval	LY-0080
DDSA	SPI-CHEM	26544-38-7
DMP-30	SPI-CHEM	90-72-2
DRAQ5	Thermo Scientific	62251
Résine époxy monomère	SPI-CHEM	90529-77-4
Glutaraldéhyde (25 %, grade EM)	TED PELLA, INC	18426
Gomme arabique	ACROS Organics	258850010
Chlorure de magnésium	Panreac	141396.1209
NaBH4	SIGMA-ALDRICH	213462
NMA	SPI-CHEM	25134-21-8
N-propyl gallate	SIGMA-ALDRICH	P3130
PBS	MP Biomedicals	2810305
Lactate	d’argent ALDRICH	359750-5G
Streptavidin-AlexaFluor 488 conjugué	Termo Fisher	S11223
Conjugué streptavidine-Nanogold	Nanosondes	2016
acide tétrachloroaurique	SIGMA-ALDRICH	HT1004
Tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris)	CHEM-IMPEX INT’L	298
Triton X-100	Fluka Chemica	93420
Instruments
Carbon Coater	Hitachi
Copper single slot grids	Ted Pella	1GC10H
Cy5 fluorescence set (Ex620/60 DM660 Em700/75)	Nikon	Cy5 HQ	Alternatives : Zeiss, Leica, Olympus
Couteau diamanté Ultra Wet 45o	Diatome	DU	Alternatives : Ted Pella
Microscope fluorescent	Nikon	Ti-E	Alternatives : Zeiss, Leica, Olympus
Porte-échantillon à inclinaison élevée	Jeol
Rotator	Biosan	Multi Bio RS-24
Microscope électronique à transmission fonctionnant à 200 kV en mode EFTEM, avec goniomètre à haute inclinaison	Jeol	JEM-2100	Alternatives : FEI, Hitachi
Tweezers	Ted Pella	523
Ultramicrotome	Leica	UltraCut-E	Alternatives : RMC
Software
Acquisition d’images	Open Source	SerialEM (https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/)
Traitement d’images	Open Source	IMOD (https://bio3d.colorado.edu/imod/)